超氧化物自由基); 氢氧自由基(· OH); 激发态氧分子(¹O₂), 过氧化氢(H₂O₂)和各类过氧化物(ROOH)是生物体内有氧代谢的产物, 也是有氧条件下电离辐射与生物所产生的活性自由基^[1]。在生理情况下, 自由基参于体内重要的新陈代谢过程。但在电离辐射损伤病理情况下, 各种因素造成的自由基产生和清除失衡, 将引起机体生物氧化过程发生异常链式反应^[2]。

自五十年代起有关电离辐射介导自由基学说已被众多学者所共知, 并陆续发现人体内存在着一系列抗氧化酶具有自由基清除作用。如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px), 过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等。由于人体内各类抗氧化酶在电离辐射作用下可发生理化性质和结构改变。而使其活性降低。故研究辐射抗氧化酶效应及其受照后的变化规律, 均具有理论和实际应用价值。本研究旨在观察和评价机体受照后不同时间, 细胞内外抗氧化酶的变化特点和规律, 了解受照后时间变化因素, 对酶失活幅度的影响。

1 材料与方法 1.1 动物与分组

昆明种小鼠, 6~8周龄, 平均体重21.56± 0.21g, 由中国预防医学科学院流研所动物中心提供。按6Gy照射后不同时间, 分为照射后1天组、3天组、5天组、7天组和正常对照组。每组20只小鼠。

1.2 照射条件

放射源为⁶⁰Coγ射线。照射剂量率为1Gy/分, 实验组动物接受照射剂量为6Gy, 在军事医学科学院钴源室进行整体照射。

1.3 观测指标 1.3.1  

采用黄嘌呤氧化酶法测定血清和肝细胞浆内总SOD(T-SOD); 锰SOD(Mn-SOD)和铜锌(Cu, Zn-SOD)活力^[3], 南京建成生物工程所提供药盒。以亚硝酸盐单位(Nu/ml)表示活性。

1.3.2  

改良Hafeman微量法, 测定血液和肝细胞浆中GSH-Px活力^[4], 军事医学科学院六所提供测试药盒。

1.3.3  

采用比浊法, 测定血液和肝细胞浆内CAT活力^[5], 军事医学科学院六所提供测试药盒。

1.3.4  

TBA萤光法(八木法), 测定血清和肝细胞浆内脂质过氧化物(LPO)含量^[6]。

1.4 肝细胞匀浆制备及分离

各组动物摘眼球取血后, 处死动物, 取肝脏400mg, 拭干残留血液, 置入玻璃匀浆器中, 加入pH7.5磷酸盐液, 研磨, 制成10%肝细胞组织匀浆。将该匀浆反复置入液氮和37℃水溶中, 5次, 使细胞冻溶。RD4000型冷冻离心机4000xg、离心20分钟, 取上清, 备查。按Lowrg法测定蛋白含量。

1.5 统计学分析

全部实验数据采用平均数±标准差(x±s)表示。采用统计学T检验和F检验, 对各均数进行显著性差异比较。

2 结果 2.1 照射6Gy后不同时间细胞内外T-SOD、Mn-SOD和Cu、Zn-SOD活力比较见表 1、2。

从表 1、2可见:小鼠照射后第一天, 血清及肝细胞内T-SOD活力已有降低趋势。随着照后时间延长, 其酶活力降低幅度逐渐增加, 致照后第七天分别为正常对照组的49.6%(血清)和34.01%(肝细胞浆)。细胞内外Cu、Zn-SOD活力变化趋势与T-SOD活力变化相平行, 但各时段Mn-SOD活力与正常对照组均值相比, 差异不显著。照后第三天和第五天, 细胞内外T-SOD和Cu、Zn-SOD活力变化幅度与其它时段酶变化幅度不呈线性关系。上述结果提示:1.照后时间变化对细胞内外T-SOD活力有影响; 2.细胞内外总SOD活力变化推测主要与Cu、Zn-SOD活力降低有关, 而射线对Mn-SOD活力影响较小。3.照后时间变化与细胞内外SOD活力变化下降幅度不呈线性关系。

2.2 照射6Gy后不同时间细胞内外GSH-Px和CAT活力比较见表 3、4。

表 3、4结果显示受照后第一天肝细胞CAT活力即开始降低, 分别较正常对照组均值降低43%, 血清与肝细胞浆GSH-Px和CAT活力于照后第三天下降至第七日降至观察期最低水平, 与正常对照组均值相比, 约降低29.7%。但照后第3~5天GSHPx和CAT均值变化幅度较小, 与其它时间点无线性关系。

2.3 照射6Gy后不同时间细胞内外LPO含量比较见表 5

表 5结果显示:血清LPO含量升高于受照后第三天和第七天最为明显, 分别较正常对照组升高17.2%和12.30%, P < 0.05。而肝细胞浆内LPO含量则以受照后第三天、第五天升高最显著, 分别较正常对照组升高58.1%和46.5%, P < 0.01。结合同期血液和肝细胞浆内各抗氧化酶活力变化规律, 经相关分析两者关系为负相关r=-0.52。推测LPO上述变化可能与幅射引起抗氧化酶失活有关。血清和细胞内LPO含量升高幅度, 反映辐射对细胞的损伤程度。

3 讨论

射线作用于机体产生过氧化反应, 在动物及人类研究中均已得到证实^{[7, 8]}。众多研究结果表明:机体经射线作用后, 通过机体内分子被电离或激发, 形成大量自由基和过性氧, 经脂类的过氧化(lipid perox idatio n)产生具有毒性作用的脂质过氧化物。该物质(1)与体内抗氧化酶的巯基或色氨酸残基反应, 使酶失活; (2)破坏核酸结构, 攻击其嘌呤碱和嘧啶碱, 导致细胞变性; (3)氧化细胞膜脂质, 导致膜变性破坏和细胞内溶酶体内水解酶释放^[9]。

机体内存在两大类脂过氧化的防御系统。一类是酶防御系统, 包括SOD、G SH-Px、CAT和其它过氧化物酶等, 它们能有效的清除 、H₂O₂和LOOH等活性氧, 并终止自由基链式反应。另一类是非酶促反应, 包括维生素E、A、C辅酶A、巯基化合物等。

电离辐射对抗氧化酶的作用与产生脂类过氧化过程国内外学者均有报导^[10、11], 认为辐射损伤后, 体内多种抗氧酶活力均发生不同程度的降低, 其降低幅度与受照剂量有关。但受照后体内抗氧化酶活力变化趋势与受照后时间的关系, 尚未见报导。本研究对受照6Gy小鼠, 照后不同时间细胞内外SOD、GSH-Px、CAT活力和LPO含量变化进行观察。结果表明:小鼠整体照射6Gy后第一天, 血液及肝细胞浆内T-SOD、Cu、Zn-SOD、GSH-Px和CAT活性均较正常对照组已有降低趋势, 而LPO含量出现轻度升高。随着受照后时间的延长, 上述改变逐渐加重, 于照后第七天观察点, 其酶活力降至最低。但各观测点酶活力降低趋势与受照后时间之间, 不呈线性变化关系, 表现为部分观测点, 细胞内外酶活力降低幅度较小或出现波动现象, 我们推测该变化特点可能与细胞受照后应激合成SOD增加, 使细胞内外抗氧化酶活力增高有关, 而照后各阶段, 细胞内外LPO含量变化似乎是抗氧化酶活力降低的结果。这种辐射与抗氧化酶-脂质过氧化代谢异常关系, 有待进一步深入探讨。

电离辐射对机体的损伤有原发和继发之分, 而对生物大分子的损伤多与辐射能的原发作用和受照瞬间剂量大小有关^[12]。由于机体内各抗氧化酶本身亦为生物大分子, 在辐射的直接与间接作用下, 其结构中的大分子, 均可发生理化性质及结构变化, 而使酶活力降低, 同时受照后体内自由基、活性氧和脂质过氧化的增加及防御机制减弱, 间接造成组织细胞受损^[13]。结合本实验结果, 我们认为, 机体受照后当天血液和细胞浆内各氧化酶活力降低是辐射直接损伤的结果; 而照后数天血液和细胞浆内各抗氧化酶活力进行性改变及相应LPO含量升高的实质为辐射损伤间接作用的结果。

总之, 电离辐射损伤后细胞内外氧化酶活力改变及其与受照后时间的关系是一个非常复杂的酶代谢变化过程。诸多因素均可影响其活力。故对辐射酶学效应的研究须从多方面进行探讨才能得正确的科学依据和结论。