DNA作为遗传的物质基础, 同时又是辐射敏感的靶子, 一方面, 辐射造成DNA损伤, 从而导致各种有关疾病的发生。另一方面, 机体在一定程度上可对这些损伤进行修复, 从而避免了疾病的发生。因此, 深入研究电离辐射诱发的DNA损伤及其修复, 具有十分重要的医学意义^{[1, 2]}。

1 材料与方法 1.1 实验材料与试剂

C₅₇小鼠, 25克左右, 雌雄随机选用, 北京医科大学实验动物中心提供, 核酸酶S₁中国科学院百泰公司提供, ³H-TdR 0.67TBq/m mol购自中国原子能科学研究院

1.2 实验方法 1.2.1 辐射细胞样品的准备

断颈杀死C₅₇小鼠制备脾细胞悬液, 使其浓度为每毫升1640培养液中含1×10⁶个细胞, 然后每毫升中加入40μg PHA, 以刺激淋巴细胞分裂, 37℃恒温培养24小时后, 再加入3.70×10⁴ Bq的³H-TdR标记脾细胞DNA。

1.2.2 ⁶⁰Co-γ外照射

将细胞悬液用试管分装后, 放于冰浴中用⁶⁰Coγ源照射, 剂量分别为3, 6, 9, 12, 15Gy, 辐照后的细胞放在冰水中保存, 待检测SN A单链断裂及其重接修复, 每个剂量点均做三个平行样, 求其平均值作为测量结果。

1.2.3

PBS液洗细胞悬液三次, 最后用PBS液调整细胞浓度, 使其保持在1×10⁶个/毫升。

1.2.4 碱处理

用微量加样器取细胞悬液100μl, 沿管壁迅速加入碱性液(0.03N NaO H, 0.9M NaCl, 0.01M Na₂HPO₄, pH12.0), 迅速混匀后将试管架移至22℃三用水箱内, 避光静置20分钟, 每个样品做两个平行样。

1.2.5 中性化

向碱性化的胞解液内加入1ml中性化液(0.034N HCl, 2mg/L酚红), 终止DNA解链反应。混匀后将试管置于超声波发生仪上超声处理30秒。

1.2.6 S₁酶消化反应

向每试管中加入5%的SDS溶液83μl, 然后加入1ml反应液〔0.15M乙酸钠、15% (W/V)甘油、3m M ZnSO₄〕, 保持pH4.3—4.4, 45℃水浴中45分钟溶解沉淀, 碱处理时每个样品的两个平行样, 其中之一加入12单位的核酸酶S₁, 另一管不加酶作空白对照, 45℃孵育2小时。

1.2.7 酶反应中止

向所有试管中加入50μl牛血清蛋白生理盐水(含BSA 200μg), 随后分别沿管壁加入833μl的14%冷三氯乙酸, 终止S₁酶的消化反应。

1.2.8 微孔滤膜测样制备

提前1小时将滤膜(上海医药工业研究院, Φ 25m m, 孔径0.45μ)浸泡于PBS液中, 即可进行样品抽滤, 再加PBS液洗一次, 尔后用5ml(5%)三氯乙酸及无水乙醇5m l洗膜抽滤一次, 60℃烘干后进行液闪测量。

1.2.9 液闪测量

将滤膜置于闪烁瓶中, 水平放于瓶底, 加入7ml闪烁液(0.25g PO POP, 2.5g PPO, 150ml无水乙醇, 350ml二甲苯), 避光, 用双道液闪计数器进行放射性计数测量(cpm), 减去本底后即为样品的cpm值。

2 结果与讨论

根据本实验的原理, γ射线外照射致DNA单链断裂程度(F)可按下式计算:

即F为样品的核酸酶S₁抗性的双链DNA百分比。F越小, 表明DNA单链断裂数越多。

从表 1可看出, 在0~15Gy范围内, 随着γ外照射剂量增加, DNA单链断裂数也随着增加。

DNA单链断裂在37℃条件下的重接修复结果列于表 2。从表 2中可以看出, 重接修复在0~15分钟内迅速进行, 此期内修复的数量(F)从55%至93.99%, 占可修复的断裂数的近90%, 即出现了所谓的快修复期; 15分钟到1小时, DNA重接修复缓慢, 为慢修复期。

有关DNA链断裂及其重接修复的研究, 方法多样, 各具特色^{[3, 4]}。但Sheridan^[5]首先报道的利用单链DNA特异性的S₁酶法, 则具有快速、简便, 不需要昂贵设备的特点, 同时S₁酶作为分子生物学研究常用的工具酶, 易于购买, 价格较低。此法适用于一般实验室。

孟紫强^{[6, 7]}用羟基磷灰石柱层析法及Kohn碱洗脱法研究⁶⁰Co γ线照射引起的CHL和615小鼠的离体脾细胞DNA单链断裂结果及章杨培的微孔滤膜法检测γ射线引起的CHO细胞的DNA单链断裂结果和表 1结果是一致的, 这也从侧面说明了核酸酶S₁法的可靠性。关于DNA单链断裂的重接修复, 我们得出了该修复在37℃条件下进行最快, 这也许说明了此过程需要酶的参与; 另外, 此修复可分为快、慢修复相。过去有学者报道还存在不可修复部分, 这一点我们的实验结果和以前的报道有所不同, 可能和选择的剂量有关^{[3, 6]}。

另外, 孟紫强^[6]的工作表明, CHL细胞在相同剂量的γ外照射条件下, 引起的DNA单链断裂程度和我们的结果有所不同, 说明DNA单链断裂和细胞对辐射的敏感度可能有一定的联系。

一般说来, 常见的DNA辐射损伤包括:碱基脱落、碱基或核苷的改变、碱基错误配对、嘧啶二聚体形成、单链及双链断裂等, 而这些损伤最终均转变为链断裂, 从而得以检测及定量分析。应用现代技术深入地探索电离辐射致遗传物质DNA损伤及其修复机制, 无疑具有深刻的现实意义。