人和啮齿类动物细胞的HPRT基因位点位于X染色体上，该基因在两性细胞中均呈半合子状态(机能性单倍体状态)。人和仓鼠的HPRT基因组成度分别为44和34kb, 都有9个外显子[1]，其基因产物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酵(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosy Transferase, 简称HPRT)由2-4个蛋白亚单位组成。酶促次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸间的转磷酸核糖基作用而生成相应的核苷-5 -单磷酸，这是细胞体内嘌呤核苷酸生物合成中的一条补救途径。但此酶也能代谢嘌呤类似物6 -硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine，6-TG)或8 -氮杂鸟嘿(8-Azaguanine，8-AG)，形成一种致死性的核苷-5-磷酸盐，从而杀死正常细胞。在致癌物和致突物的作用下，某些细胞X染色体上控制HPRT的结构基因发生突变，不能再产生HPRG，从而使突变细胞对6-TG或8-AG具有抗性作用，这些细胞在含6-TG的选择性培养基上能继续分裂并形成集落[2, 3, 4]。凡能引起碱基替换，移码突变、缺失和基因重组的诱变物，均能引起HPRT基因位点的突变[5]。目前用来检测HPRT基因位点突变最常用的哺乳类细胞有CHO细胞、V79细胞及人外周血T淋巴细胞。V79细胞HPRT位点正向突变试验具有快速、灵敏、可靠、可检测遗传学改变等许多优点，已在遗传毒理学诱变机理研究，诱变剂的筛选，致癌剂、抗致癌剂的筛试等领域得到越来越广泛的应用[6]。本文报道用此种方法检测的60Co-γ射线诱发的HPRT基因位点的突变频率。
1 材料和方法 1.1 试验化合物与试剂6-巯基鸟嘌呤(2-AMIND-6-MER-CAPTOPURINE, 6-Thioguanine)纯度约98%, 氧化型辅酶Ⅱ(NADP)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)均系美国SIGMA化学公司产品，RPMI 1640培养基由美国GIBCO公司生产，S 9由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所制备，胎牛血清由浙江衢县科委购入，照射用60Co-γ源为军事医学科学院同位素室提供。
1.2 细胞及细胞培养条件试验用V79细咆由军事医学科学院二所四室刘国廉主任惠赠。细胞培养于含15 %胎牛血清，200μ/毫升庆大酶素的RPMI 1640培养液中，置二氧化碳培养箱内，在37℃，5 %CO2和95%~100%的相对湿度下培养。
1.3 诱变程序根据Jenssen[7]的方法略加改进，将1×108经HAT培养基处理并复原的细胞接种在75cm2的培养瓶中培养24小时，用60Co-γ射线照射，剂量分组为0.5、1、2、3、4、5Gy，剂量率为1.16Gy/min。照后24小时做克降形成率测定，以相对存活率表示不同剂量的γ射线对细胞的杀死效应(将对照组的存活率视为100%)。同时将2 ×105个细胞接种于培养瓶中，培养8天，令突变体表型表达，其间分传二次，以防止细胞密度过大引起接触抑制和交叉喂养。表达结束后，消化、计数细胞，取2 ×105个细胞接种于直径为90mm的培养皿中，加入10ml含6-TG的选择培养液(6-TG的终浓度为10ug/ml), 每组5个平行样品，以检定群体中的突变体细胞。与此同时，在60mm的培养皿中加入5 ml无6-TG的培养液，种植于200个细胞，以测定这些细胞的种植率。突变作用和种植效率的平皿均在8~10天后固定和染色计数，由观察到的突变克隆频率被未接触6-TG的细胞种植率除计算每108存活细胞的突变体频率。
2 结果和讨论当60Co-γ射线以1.16Gy/min的剂量率，分别用0.5、1、2、3、4、5Gy的剂量对V79细胞进行照射，细胞杀死效应和诱发的HPRT突变频率如图 1和图 2所示。
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图 1 60Co-γ射线照射的V79细胞的存活率 |
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图 2 60Co-γ射线诱发的V79细胞突变频率 |
从图 1可见，随养照射剂量的加大，细胞存活率明显下降。剂量为0.5Gy时，存活率为91%，当剂量加大到5Gy吋，存活率只有9 %。经辐射剂量-细胞存活曲线计算机处理程序处理，属多靶投型，线性相关系数r为0.9851，P < 0.001。而HPRT位点的突变频率则随照射剂量的加大而增加，呈现出明显的剂量-效应关系，应用涂开成教授开发的“辐射剂量—效应曲线数学模型计算机处理程序”处理，资料可拟合成剂量平方模型：
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许多研究表明，体细胞的HPRT基因位点是一个对电离辐射和化学诱变剂都非常敏感的位点，HPRT位点突变试验国外已广泛用于工业和环境污染物的诱变研究。近十余年来又将此试验用于人体外周血淋巴细胞的测定，作为工业和环境毒物接触者的诱变性生物监测指标[8]，在探讨电离辐射所致人体遗传学损伤的机理以及损伤后的远期效应评价中，染色体只能反映本身可见的基因组损伤，因此有必要探讨电离辐射引起的单基因损伤的检测方法的应用潜势，在单基因突变的研究中，HPRT位点是一个经典的基因位点。有关电离辐射引起的HPRT基因位点突变的研究报道很多。辐射导致细胞单一死亡的发生率和单一基因发生突变的发生率之间的定量关系表达方式是：存活细胞数减少时，活细胞的突为频率增加。高LET-α粒子与低LET-x线相比，如果细胞死亡数一定，则高LET-α粒子引起的HPRT位点突变率明显高于低LET-x射线[9]。
Evans等人[10]分析了经X线照射剂量在0~2 Gy之间的T淋巴细胞的抗8-AG的突变频率。结果表明，剂量效应关系接近平方关系。Cox[11]和de Ruijter[12]报告的x线诱发的人成纤维细胞抗6-TG和抗8-AG的突变频率与剂量间的效应关系与其相似，剂量为0.5Gy时，突变频率足自发突变水平的2倍；到2 Gy时，突变率高达4或6倍。
研究也表明，电离辐射引起的HPRT基因突变的发生不是由于转录被阻断，而是真正的突变，且此种突变是不可逆的。这种电离辐射引起较大的基因损伤所致[13, 14]。由于这种不可逆性，使得HPRT基因突变长期存在于体内。Hakoda等[15]用T淋巴细胞克隆法分析了DS86估计值D>0.01Gy的30名日本原爆40年后的幸存者和17名D < 0.01Gy的对照者的HPRT基因位点突变频率，结果表明，17名对照者的T淋巴细胞的突变频率为3.4×10-8, 范围为(1.3-9.3)×10-8; 30名幸存的突变频率为5.2×10-6，范围为(0.8~14.4) ×10-8对照组与幸存组经统计学检验分析P < 0.05, 两组之间差异显著。Bradley等[16]在1988年的HPRT基因突变会议上报道了一例病人受5 Gy急性照射，其HPRT基因位点突变频率明显增高，三年以后其突变频率仍然是高的。
HPRT基因突变可望成为一种生物剂量计，可行的一面是：检测方法简便、快速、灵敏，对急性照射及慢性小剂量长期照射均可分析。目前对HPRT基因位点的研究已进入分子水平，经过特殊电泳分析，即可判断不同诱变剂所致的HPRT基因突变的特异损伤图谱；反过来，也可通过HPRT基因突变图谱分析所致突变的诱变剂[17]，再通过PCR (聚合酶链锁反应)技术对部分异常基因片断增值、放大，从而进一步分析突变发生的机理。因此，在电离辐射及各种诱变剂的损伤机理和遗传效应方面HPRT基因的研究填充了染色体、微核的不足之处，具有较大的应用潜势。
致谢: 本课题为IAEA研究协调项目的一部分，并得到核工业总公司科学基金资助。试验工作及数据处理承蒙军事医学院二所四室刘国廉主任及涂开成教授并全组同志的大力支持，在此一并深表谢意。
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