电离辐射是引起人体肿瘤的重要因素之一, 近年来辐射致癌研究得到放射生物学界的普遍重视。体外细胞转化模型的建立, 为肿瘤的病因学、发病机理以及防治措施的研究提供了一个重要的手段。本文利用四川大学图像图形研究所研制的MIAS- 300图像分析系统, 观察⁶⁰Coγ线辐射体外诱发人胚肺细胞转化的形态计量学参数的特点及与剂量率和照射剂量的定量关系, 为电离辐射致癌机理、肿瘤细胞学的定量观察和诊断以及辐射防护研究等提供实验性资料。测试的主要参数有:细胞及细胞核面积、周长、等效直径、形状因子和核浆比等5项指标。有关细胞形态及生长状况、增殖能力、转化率和染色体畸变率等的观察结果, 有另文报告^[1]。

1 材料与方法 1.1 细胞培养、照封和样品的制备

应用本实验室由1例5月胎龄女婴肺组织经分离建立的人胚肺细胞系, H EL/9102^{[1, 2]}, 取第二代细胞悬液, 接种于静置的瓶内, 每瓶3~5×10⁴个细胞, 内放一个盖玻片, 加入培养液2ml, 培养2 4小时后经⁶⁰Coγ线照射。照射分两种条件:一是细胞与源相距4 m, 剂量率为1.51Gy/min; 二是细胞与源相距2.5 m, 剂量率为3.64Gy/min。照射剂量范围均为0~8.0Gy。照射后继续培养48~72小时, 传代至第9代, 取出盖玻片, 在温浴的HK液中洗一次, 放入Boiun液中固定15分钟, 用50%酒精洗一次, 最后放入70%酒精内固定, 凉干后经H.E染色, 封片待观测。

1.2 图像获取和浏量

用Olympus(BH₂)显微镜及日产Burle摄像头作图像输入装置。显微放大倍率:物镜40x, 线路放大32.5x, 总放大倍数为1300, 普通光源照明。在此输入条件下, 一个像素点的宽度为0.393μm。将样品载玻片置于显微镜下的载物平台上, 调焦至最清晰时摄取1幅图像。由于样品中被测的细胞和细胞核(特别是细胞)的反差大部分不清晰, 且细胞间有重迭现象, 因此, 一个视场中完整的细胞数较少。为了提高工作效率, 拟在摄取图像前, 先在图像编辑状态下清理B帧。然后不断变换视场摄取图像, 将每1视场上完整的细胞搬移到B帧, 直至B帧排满为止。完整的细胞在B帧排满后, 再拷入A帧, 以备对图像进行处理和测量。在图像编辑(Edit)模块下, 采用Draw Eiip功能对细胞核进行填充, 操作完毕, 将此图像存盘(以备后用)。转入图像分割模块(Segment), 将细胞核分割成二值图, 最后转入测试模块进行测量; 细胞核测试完毕, 将上述存盘图像调出, 再转入图像分割模块, 以细胞为目标, 分割成二值图并转入测试模块对细胞进行测量。每1个剂量组至少分析100个以上完整的细胞, 测试的主要参数有:细胞或细胞核的面积、周长、等效直径、形状囚子和核浆比等项指标。

2 研究结果 2.1 人胚肺细胞的形态计量学参数

两组剂量率作用下受到不同剂量照射的人胚肺细胞的形态计量参数列于表 1, 由表 1可见, 面积、等效直径和形状因子均随照射剂量的增加而增大, 经统计学处理各剂量组均值间绝大部分有非常显著的差异; 而周长随剂量则无明显变化, 经统计学处理, 各剂量组均值间亦无显著差别。

2.2 细胞核形态计量学参数和等效直径的须率分布

人胚肺细胞在两种剂量率作用下受到不同剂量照射后, 细胞核的形态计量参数列于表 2。由表 2看出, 细胞核面积、周长、等效直径和核浆比均随照射剂量的增大而明显增加。经统计学处理各剂量组均值间大都有显著或非常显著的差异。在观察剂量的范围以内, 核的形状因子波动于0.884~0.947之间, 经分析表明该参数与照射剂量无明显依赖关系。这一结果表明, 各剂量组细胞核的形状在二维平面上接近于圆或椭圆, 由此推侧, 在三维空间多呈球或椭球状。剂量率为1.51 Gy/min照射各剂量组细胞核等效直径的频率分布绘于图 1。从图 1可见, 随着剂量的增大, 等效直径的均值明显右移。

2.3 形态计量参数与照射剂量的定量关系

由表 1和表 2均可见到, 人胚肺细胞或细胞核的有关参数, 随剂量的增大都有变大的趋势, 经用自动挑选数学模型的回归分析程序分析^[3], 结果说明用线性平方模型描述效果为最好。因此, 细胞或细胞核各参数与剂量的关系, 均用此模型描述, 即:

(1)

式中, E为细胞或细胞核形态计量学参数值, D为照射剂量(Gy), a, b和c为待定系数。各剂量组各参数的拟合系数列在表 3。表中的R为参数与剂量的相关系数, Q为残差平方和, 用这两个参数反映曲线拟合的优度。从表 3中看出, 各参数与剂量的相关系数均在0.90以上, 其中细胞核参数与剂量的关系更为密切, 其相关系数高达0.98以上。从表 3中最末一栏所列参数值增大到50%所需的剂量看, 核面积的变化最为敏感, 其次是核浆比。从参数测量值的变异度, 剂量依赖关系的密切程度, 曲线拟合的精度等诸因素综合分析, 在作类似的实验研究时, 选用细胞核的某些参数作为观察指标较为理想。

3 分析讨论 3.1 关于细胞形状因子随剂量增大亦增大而周长变化不明显的问题

众所周知, 形状因子的大小与物体的表面积密切相关^[3], 周长是反映物体体积和表面积大小的一个指标。由表 1看出, 细胞面积随剂量的增大而增加, 而周长则无明显变化, 这一结果似乎说明, 细胞体积随刑量的增加而增大, 其形状则由较复杂的菱形或长梭形逐步变为较简单的多边形或趋于圆形, 致使形状因子增大; 细胞周长不随剂量的增大而增加, 则说明细胞的表面积不随剂量的增大而增加。由此推测, 细胞的功能将随着照射剂量的增大而降低。因此, 在辐射细胞生物学研究中, 可用形状因子作为判断细胞功能有无变化的一种指标。

3.2 形态计量参数与剂量率和照扮剂量两因素的定量关系

将表 2中两种剂量率照射的各剂量组细胞核各参数均值间经统计学处理, 除3.0Gy组核浆比无显著差异外, 其余各剂虽组各参数两种剂量率间均有显著或非常显著的差别(见表 4)。这说明, 引起细胞或细胞柱形态计量学参数改变的因才, 不但取决于照射总剂量, 而且也与照射时的剂量率密切相关。经过数学分析和处理, 表 5列出了人胚肺细胞及细胞核形本计量学参数与剂量率(X₁)和照射剂量(X₂)间定量关系的函数表达式。从表 5中看出, 除细胞等效直径仅与照射剂量(X₂)1个因素有关外, 其余参数均与剂量率(X₁)和照射剂量(X₂)2个因素密切相关, 相关系数都在0.92以上。细胞核的4个形态计量学参数都是随着剂量率和照射剂量的增加而增加, 并随着它们乘积的增大而减小, 说明剂量率与照射剂量的交互作用是显著的。上述所论及的结果充分证明, 剂量率效应的确是存在的, 即剂量率大的比剂量率小的效应大。据文献报导^{[4, 5, 6]}, 剂量率是影响低LET辐射(γ、X线等)生物效应的重要因素之一, 在总剂量一定时, 剂量率越低, 照射时间越长, 其生物效应就越轻。它的机制是, 在低剂量率照射所致的亚致死性损伤的细胞有足够的时间得以修复。