随着分子遗传学技术的发展, 采用基因突变研究辐射损伤日益受到重视。体细胞次黄嚓吟鸟嘿吟磷酸核糖转移酶(HPRT)基因位点是一个对电离辐射非常敏感的位点。Muir P等(1988)[1]认为电离辐射引起的许多损伤在染色体上是观察不到的, 而HPRT基因的灵敏度则高于染色体, 其检测方法简便、快速、灵敏。David等(1959)[2]提出高剂量电离辐射作用以多基因突变为主, 而低剂量范围内却以单基因突变为主。因此, HPRT基因位点分析更适用于职业受照人员或群体。Thacher(1956)[3]分析表明HPRT基因突变是不可逆的, 因而可长期存在体内。Hakoda(1988)[4]报道了日本原爆40年幸存者受照剂量>0.01Gy的HPRT基因突变频率仍能反映其受照剂量。利用此项新技术可用于急性及慢性小剂量长期照射的分析, 估算受照累积剂量, 发现电离辐射高敏感者, 评价放疗后癌症患者的危险度等, 均有研究价值。国内在辐射损伤研究中, 利用基因突变方法者很少, 尚未见有报道。我们对30例X线诊断工作者的体细胞HPRT基因突变频率进行了测定, 利用本实验室建立的X线诱发的体细胞HPRT基因突变频率与剂量关系曲线推算受照者的累积剂量, 年剂量当量, 并分析其与工龄的关系。
一 材料与方法1.受检时象:30例全部为男性X线诊断工作者, 平均年龄46.5岁(25~62岁), 平均工龄24.7年(5~43年)。
2。血样的采集与培养:每例采集血1 ml肝素抗凝血, 分装两瓶, 每瓶0.3ml血, 接种到含有3ml培养基中(80%RPMI1640, 20%小牛血清, 适量肝素和PHA, pPH7.2)其中一瓶加入0.3ml 1×10-6mol浓度的6-TG(6-琉基鸟嚓吟), 置37℃恒温培养至32小时时, 每瓶加入浓度为60μg/ml的Cyt-B (松胞素-B)工作液0.3ml, 使Cyt-B终浓度为6μg/ml, 混匀后, 继续培养至72小时。终止培养后, 吸去上清液, 加入预温至37℃的0.15MKCI 4ml, 混匀, 立即加入1ml新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1), 混匀, 置37℃温育10分钟, 1500转/分, 离心8分钟, 弃上清液后, 加入固定液5ml, 固定20分钟, 离心; 再重复固定一次, 离心, 弃上清液, 加入0.2ml固定液, 混匀, 滴于预冷的冰玻片上, 待干后, Giemsa染色。
3.阅片:每例计数2000个转化淋巴细胞(包括加6-TG和不加6-TG各1000个), 记录在同一胞浆内具有完整核膜的双核或多核淋巴细胞数(包括相压相切和分离的双核或多核细胞)。
4.统计分析:侮例2000个存活淋巴细胞中含有6-TG的1000个淋巴细胞中的双核或多核细胞数, 被除以不含6-TG的1000个淋巴细胞中的双核或多核细胞数, 其值为HPRT基因突变频率(‰), 其均值与正常值进行两个均数的T值显著性检验。根据HPRT基因突变频率与照射剂量得出的直线回归方程Y=1.0246+0.0104D, 以每例的HPRT基因突变频率代入公式, 求出为累积剂量, 再除以放射工龄即为平均年剂量当量(mSv)。
二 实验结果与讨论1.x线工作者体细胞HPRT基因突变频率测定结果:职业受照人员多为低剂量范围。David(1989)指出, 是以单基因突变为主。在体细胞突变研究中, 首推的基因为HPRT, 此项技术的基础在于缺乏HPRT的细胞具有6-TG抗性, HPRT是一种嘌呤合成酶, 其编码基因位于X染色体的长臂末端。
利用Norman(1988)[5]提出的多核细胞法检测HPRT基因位点突变率比1979 Strauss提出的放射自显影法及1982年Albertini提出克隆检测法简便、快速、灵敏, 检出率为以上两种方法的2~3倍, 因此, 本实验选用多核细胞检测法, 对30例男性放射科医生进行了测定, 结果见表 1。
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表 1 X线工作者体细胞HPRT基因位点突变频率的测定 |
平均HPRT基因突变频率为(1.1480±0.0844)×10-3与30例健康献血员(农民)的HPRT基因突变频率(1.0518±0.069)×10-3相比, 经T值检验为4.81, P < 0.01, 具有非常显著性差异, 见表 2。实验结果说明, X线工作者受职业照射剂量亦可使HPRT基因突变频率增高, 与Grosorsky(1985)[6]研究结果相近似。证明该方法用于低剂量受照人员测定其辐射损伤是可行的。
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表 2 X线工作者与献血员体细胞HPRT基因突变频率比较 |
2.依据HPRT基因突变频率与剂量关系方程推算X线工作者的累积剂量和年剂量当量:如何准确估算职业受照人员过去受照射剂量及其推算辐射致癌危险度, 以及放射损伤的诊断和已患肿瘤受照者的病因学诊断等都是至关重要的。Thacher(1986)[3]指出电离辐射引起HPRT基因突变的发生不是由于转录阻断, 而是真正的突变, 是不可逆的, 可长期存在体内, 测定其突变频率可反映受照剂量。因此, 可望成为一种生物剂量计。
根据文献[7]所报道的HPRT基因突变频率的剂量效应直线回归方程Y=1.0246+0.0104D, 再以每例的HPRT基因突变频率代入公式, 求得累积剂量, 除以放射工龄为平均年剂量当量(mSv), 结果见表 3。
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表 3 依据X线诱发HPRT突变预率方程推算 |
从表 3可见, 经估算30名X线诊断工作者年剂量当量均低于50mSv限值, 平均为5.73mSv·a-1。从本文利用HPRT基因突变频率推算的年剂量当量与往年调查的结果基本相符。经初步测试, 说明利用该方法测定职业受照人员的累积剂量, 年剂量当量是可行的, 为科学地评价辐射损伤、防护情况、职业危害提供科学依据。
3.体细胞HPRR基因突变与放射工龄的关系。结果见表 4。
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表 4 HPRT突变频率与工龄的关系 |
从表 4可见, HPRT基因突变频率及平均累积剂量均有随放射工龄的增加而升高的趋势, 测定结果与实际情况相符。
三 小结利用多核细胞法测定了30例X线诊断工作者的体细胞HPRT基因位点突变频率, 其均值为1.1480±0.0844, 与30例献血员(农民)的HPRT基因突变频率(1.0518±0.069)相比有非常显著性差异(P < 0.01)依据本文以往建立的X线诱发的HPRT基因突变频率刻度曲线, 推算的累积剂量和年剂量当量值, 与本文测试30例X线工作者均小于50mSv年剂量当量限值, 平均为5.73mSv·a-1, 87%的人员小于10mSv·a-1的结果基本相符。说明利用该方法测定职业受照人员的累积剂量、年剂量当量是可行的。并证明HPRT基因突变频率和平均年剂量当量均随放射工龄的增加而升高。以上实验结果证明, 该方法客观、准确、灵敏。还可揭示染色体和微核所不能揭示的规律, 适用于低剂量受照人员的健康评价、剂量估算, 为及时恰当的医学处理提供科学依据。为保障放射人员的健康, 提高检测水平, 基因突变测定法定会日益受到人们的重视。
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Muir P, et al. Karyotyotypic abnormality of the x cbromosome is rare in mutaut HPRT lymphocyte clones[J]. Mutat Res, 1988, 197: 157. DOI:10.1016/0027-5107(88)90152-2 |
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David MDM, et al. Ⅲ Molecular Characterization of HPRT-defieient mutants induced by γ-rays or a particles showing that the majority have delations of all or part of the HPRT gene[J]. Mutat Res, 1989, 220: 11. DOI:10.1016/0165-1110(89)90006-7 |
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Thacker T, et al. Specific-Locus mutations induced in lukaryotes (especially mammalian cells) by radiation and Chemicals: a perspective[J]. Mutat Res, 1986, 160: 267. DOI:10.1016/0027-5107(86)90137-5 |
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Hakoda M, et al. Increased Somatic cell mutant fraquency in atomic bomb surrivors[J]. Mutat Res, 1988, 201: 396. |
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Grosorsky A J, et al. Evideme for linearasponse for the in duction of mutations in human cells by x-ray exposures below 10 rads[J]. Proc Nate Acad Sci VSA, 1985, 82: 2092. DOI:10.1073/pnas.82.7.2092 |
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Norman A, et al. A sensitive assay for 6-Thioguanine resistant lymphocytes[J]. Mutat Res, 1988, 208: 17. DOI:10.1016/0165-7992(88)90014-0 |
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史纪兰, 等. 低剂量X射线诱发人体细胞HPRT基因位点突变的剂量效应关系研究[J]. 中国辐射卫生杂志, 1993, 2(4): 181. |