长QT间期综合征主要分为遗传性(congenial long QT syndrome, cLQTS) 和获得性(acquired long QT syndrome, acLQTS) 两大类, 其中acLQTS的发生主要由药物抑制人类ether-α-go-go相关基因(the human ether-α-go-go related gene, hERG) 通道所致, 占acLQTS发生率的90%^[1]。hERG通道是由4个α亚基组成, 每个α亚单位包含1 159个氨基酸, 6个(S1~S6) 跨膜α螺旋结构域, 其中S1~S4构成电压传感结构域(voltage sensing domain, VSD), S5、S6以及中间的孔环构成孔道区域^{[2, 3]}。在S6片段内含有两个特异性芳香族氨基酸, 分别是第656位苯丙氨酸(phenylalanine, F)、652位酪氨酸(tyrosine, Y), 极易与药物结合^{[4, 5]}。当hERG通道被药物抑制后会诱发QT间期延长, 并伴有尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes, Tdp) 的发生, 严重时可致猝死^{[6, 7]}。目前, 新药研发都需要检测对hERG通道的药理作用以评估药物对心脏的不良反应^[8]。吴茱萸是一种用途广泛、药理活性多样、临床疗效可靠的名贵中草药, 具有极大的药用价值, 临床上主要用于治疗高血压、心绞痛、胃十二指肠溃疡、子宫出血和月经不调等疾病^[9]。至今已从吴茱萸中成功分离得到165种化学成分, 主要包括生物碱类、萜类和黄酮类等, 其中生物碱类成分含量最高。目前针对吴茱萸药理作用及代谢动力学的研究主要集中在吴茱萸的生物碱类成分上^[10]。已有文献报道吴茱萸中的去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine)、荷蒂芸香胺(hortiamine) 能够抑制hERG通道并导致豚鼠QT间期延长^[11]。羟基吴茱萸次碱(HRU) 的化学结构与之相似, 因此推测HRU是否也会抑制hERG通道？也会存在潜在致心律失常风险？所以, 本文研究目的是探讨HRU对hERG通道的影响及机制, 评价其临床应用的安全性, 为其安全用药提供理论依据。

主要药品与试剂   HRU (湖北广奥生物有限公司); 胎牛血清(FBS, Gibco公司); 遗传霉素(G418, Invitrogen公司); DMEM (Hyclone公司); Lipofectamine 2000 (Thermo公司)。

实验细胞及培养   HEK293细胞系(北京协和医学院); 稳定表达hERG基因的HEK293细胞系(加拿大蒙特利尔心脏研究所馈赠)。细胞采用含10% FBS和400 µmol·L^-1 G418的DMEM培养基进行培养。

RNA提取及PCR检测   将细胞接种在6孔板中, 孵育给药24 h, 每孔各加入Trizol 1 mL, 提取的RNA保存于DEPC水中。使用逆转录试剂盒, 取1 μg RNA逆转录合成cDNA。以GAPDH作为内参, 并用2^-ΔΔCt方法来进行定量分析。

电生理记录   准备细胞, 用PBS润洗3次, 加入胰酶1 mL, 消化至细胞从瓶壁脱落, 再迅速加入细胞培养液终止消化, 显微镜下观察细胞的消化情况, 吹散成单细胞混悬液。再转移至15 mL离心管中, 1 500 r·min^-1离心5 min, 弃上层, 向沉淀的细胞中加台式液2 mL, 使之重新混匀, 将细胞悬液铺至浴槽中, 静置5 min, 等待细胞贴附于浴槽底部。开启灌流装置系统, 待药液灌满浴槽, 与细胞充分接触, 然后选择表面光滑、边缘完整的细胞进行高阻封接, 记录hERG电流及通道动力学, 运用软件pClamp10.2进行数据分析。

蛋白表达检测   取出细胞, PBS润洗3次, 加入弱裂解液, 提取细胞总蛋白, 进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗, 置4 ℃摇床过夜。取出NC膜, 用PBST洗3次, 室温避光孵育辣根过氧化物酶标记的二抗。最后运用Odyssey红外荧光扫描仪成像, 使用Image Studio软件进行数据处理和分析。

免疫荧光检测   细胞用4%多聚甲醛固定30 min, PBS润洗3次, 用0.4% Triton X-100穿透1 h后, 10%山羊血清封闭1 h, 加入抗体, 置于4 ℃冰箱孵育过夜。将细胞与稀释的Alexa Fluor 488和594在暗室中于37 ℃孵育1 h, 最后用DAPI进行染色10 min, PBS润洗3次, 使用荧光显微镜进行图像采集。

统计学分析   使用GraphPad Prism7.0软件进行数据作图, 所有实验数据均表示为均值±标准差($ \stackrel{-}{x} $ ± s), 两组间数据比较采用t检验, 多组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P < 0.05认为差异具有统计学意义。

为了检测HRU是否会抑制hERG通道, 利用全细胞膜片钳技术记录hERG-HEK293细胞的hERG电流, 记为对照组, 如图 1A所示, 在保证其他条件不变的情况下, 利用膜片钳灌流装置, 将HRU缓缓流进浴槽, 记录hERG电流, 记为HRU组。图 1B中I-V曲线结果显示, HRU会使hERG电流明显减小, 在+40 mV电压下, 10 μmol·L^-1 HRU对hERG电流抑制率为60.8%。如图 1C所示, HRU对hERG通道的抑制作用随浓度的增加而增大, 20 μmol·L^-1的抑制率达到86%。图 1D为HRU的半数抑制浓度(IC₅₀) 曲线图, 其IC₅₀值为2.1 μmol·L^-1。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The effect of hydroxyrutaecarpine (HRU) on the human ether-α-go-go related gene (hERG) channels current after instantaneous perfusion. A: Protocol and representative current traces under control or HRU-treated conditions in hERG-HEK293 cells; B: Normalized I-V curve of the hERG tail current; C: Dose-response curve, the inhibitory effect of HRU on hERG increased with the increase of dose; D: Half maximal inhibitory concentration (IC50) curve of HRU inhibition of hERG channels. Student's t test, n = 8, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs control (CTL)

接下来, 本研究观察了hERG通道动力学的变化来探讨HRU抑制hERG电流的内在机制, 包括激活、失活、复活过程。图 2A显示, 对照组hERG通道的半数激活电压(V_1/2) 为-32.01 ± 0.48 mV, 1 μmol·L^-1 HRU组V_1/2值为-32.72 ± 0.57 mV (P > 0.05), 10 μmol·L^-1 HRU组V_1/2值为-37.98 ± 0.92 mV (P > 0.05), 可见, HRU对通道的激活过程几乎没有影响。如图 2B所示, 首先在+40 mV电压下确保hERG通道失活, 在+20 mV电压下, 记录-120~+30 mV电压刺激下产生的稳态失活电流。结果如图 2C, HRU能降低hERG通道稳态失活电流。如图 2D, 先使通道完全失活, 再在-100 mV电压使通道开放, 然后给与-120~+30 mV的一系列脉冲, 测试每个电压下的瞬时失活电流。图 2E是经单指数方程拟合得出瞬时失活时间常数, 显示出HRU缩短了失活时间常数。图 2F是记录在-120~+30 mV电压下的hERG复活电流。图 2G显示出HRU给药后复活时间常数无明显改变(P > 0.05), 说明HRU对hERG通道复活过程无影响。

Figure 2

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Figure 2 The effects of HRU on the hERG channel kinetics after instantaneous perfusion. A: Voltage-dependent activation curves for the control and HRU group (1 and 10 μmol·L-1); B: Voltage clamp protocol, representative current traces for steady-state inactivation; C: Normalized steady-state inactivation curves before and after exposure to HRU; D: Voltage clamp protocol and representative current traces for the onset of inactivation; E: Time constant of inactivation curves; F: Voltage clamp protocol and representative current traces for recovery; G: Time constant of recovery curves. Student's t test, n = 8, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs CTL

应用计算机辅助研究药物阻断hERG通道的方法简便快捷、经济高效^[12]。本研究采用分子对接技术模拟羟基吴茱萸次碱与hERG通道的相互作用^{[13, 14]}。预测结果显示, HRU与hERG通道结合的位点为芳香族氨基酸第656位苯丙氨酸(F656) 和第652位酪氨酸(Y652)。如图 3A所示, HRU中的苯环结构与氨基酸残基F656形成π-π堆积作用, 结构中的氮原子与氨基酸残基Y652形成氢键相互作用。接下来, 本研究对这一预测结果进行验证。将hERG通道内的苯丙氨酸和酪氨酸分别突变成缬氨酸(valine, V) 和丙氨酸(alanine, A), 再瞬时转染至HEK293细胞中, 分为WT-hERG组(图 3B)、Y652A-hERG组(图 3C)、F656V-hERG组(图 3D)。使用全细胞膜片钳技术记录HRU对hERG电流的影响。结果显示, 10 μmol·L^-1 HRU显著降低了WT-hERG组的hERG电流, 对Y652A-hERG、F656V-hERG组几乎无抑制作用。以上结果证明HRU与hERG通道的瞬时作用是结合了通道中F656和Y652位点。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Effects of HRU on hERG channel action sites. A: The HRU was docked into the binding site of the hERG channels, the HRU binds to the active pocket of hERG; B: Examples of WT hERG current traces and normalized I-V curve of the hERG tail current; C: Examples of Y652A hERG current traces and normalized I-V curve of the hERG tail current; D: Examples of F656V hERG current traces and normalized I-V curve of the hERG tail current. Student's t test, n = 10, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs CTL

为了探究HRU抑制hERG通道的内在机制, 本研究运用稳定表达hERG的HEK293细胞, 检测了HRU作用前后hERG mRNA表达水平是否发生了改变。如图 4结果显示, HRU显著降低hERG mRNA表达水平。由此说明, HRU对hERG通道的抑制作用极有可能是发生在转录调控过程。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Effects of HRU (1 and 10 μmol·L-1) on hERG mRNA levels. HRU reduced hERG mRNA levels. One-way ANOVA, n = 6, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs CTL

基于前期实验, 本课题组预测HRU对hERG通道可能会具有长期抑制作用。运用稳定表达hERG的HEK293细胞系, 观察HRU孵育24 h对hERG的影响。如图 5A和B所示, HRU孵育24 h明显抑制hERG蛋白表达。图 5C和D显示, HRU孵育24 h降低hERG电流, 10 μmol·L^-1 HRU对hERG电流的抑制率为62.2%。以上结果表明, HRU对hERG通道具有长期抑制作用, 并且HRU降低的hERG蛋白为功能性蛋白。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 HRU reduces hERG protein levels and hERG current after incubation. A, B: Western blot results and statistics for hERG expression levels (n = 5), one-way ANOVA; C: Protocol and representative current tracing on the hERG current under CTL group or HRU-treated 24 h; D: Normalized I-V curve of the hERG current. Student's t test, n = 10, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs CTL

转录因子Sp1对hERG基因的转录过程具有极其重要的作用^{[15, 16]}。本研究检测HRU是否能够降低Sp1的表达水平, 如图 6A和B显示, HRU作用24 h后, 1和10 μmol·L^-1 HRU均能抑制Sp1表达。为了证明Sp1是否参与HRU引起的hERG通道蛋白的下调, 运用基因敲减技术对Sp1基因进行敲减, 如图 6C和D所示, 敲减Sp1后, 10 μmol·L^-1 HRU组的hERG表达量显著减少, 说明Sp1参与了HRU引起的hERG蛋白表达降低。Sp1是在细胞核内发挥转录调控作用, 而hERG主要存在于细胞浆中。本研究利用核浆蛋白提取试剂盒检测细胞核内Sp1和细胞浆内hERG蛋白表达水平, 记为对照组、1 μmol·L^-1 HRU孵育组、10 μmol·L^-1 HRU孵育组。如图 6E~H显示, 细胞浆中hERG蛋白表达量减少, 细胞核内转录因子Sp1表达也是降低的。免疫荧光结果如图 6I所示, HRU组与对照组相比, 细胞质膜上的hERG表达量随HRU浓度的增加而下降, 同时细胞核内Sp1水平也降低。以上说明, 转录因子Sp1是调控HRU降低hERG蛋白表达的关键因子。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 HRU reduced hERG and Sp1 expression levels. A, B: Representative bands and statistics of Sp1 after HRU incubation for 24 h; C, D: Representative bands and statistics of hERG after transfection with a Sp1 siRNA; E, F: Representative bands and statistics of hERG in cytoplasm; G, H: Representative bands and statistics of Sp1 in nucleus, one-way ANOVA; I: Immunofluorescence showed reduced hERG and Sp1 expression levels by incubation with HRU, green represented hERG protein and red represented Sp1 protein. Scale bar, 50 μm. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs CTL

在我国, 中药的发展已有千年之久, 因其疗效稳定、效果突出、应用范围广泛等优点, 所以人们往往忽略其不良反应。药物产生不良反应是不可避免的, 目前临床上针对药物引发的心脏毒性作用给予极大的关注。

从上世纪90年代末至今, 已经有若干中药因含有生物碱单体成分抑制hERG通道而被证实有致心律失常的风险, 如黄连素、乌头碱等^{[17, 18]}。吴茱萸具有抗心绞痛、抗癌和降压等功效, 是一种开发前景广阔的天然药物。为了增强吴茱萸的疗效, 降低其不良反应, 临床上常与黄连、人参、五味子等药物合用制成复方制剂, 如左金丸(萸莲丸) 和戊己丸等^[19]。有文献报道吴茱萸贴剂穴位治疗心律失常, 作用机制尚不明确^[20]。本课题组前期实验已对吴茱萸中生物碱类成分进行了部分研究, 发现吴茱萸次碱抑制hERG通道, 具有强烈致豚鼠心律失常的作用^[15]。HRU是从吴茱萸中提取的一种吲哚喹唑啉类生物碱^[21], 结构中包含氮碱基, 更是增加了与hERG通道结合的可能性, 运用分子对接技术将药物与hERG通道进行拟合, 结果显示出HRU与hERG通道紧密结合, 验证了前期的推测, HRU具有极大的潜在致心律失常风险。本文应用稳定转染hERG的HEK293细胞系, 首先观察到HRU瞬时给药能抑制hERG电流, 其抑制hERG通道与其加速通道失活, 缩小失活时间常数, 即与加速通道的失活动力学有关。hERG通道的S6结构域中包含两个芳香族氨基酸F656和Y652, 这两个残基的侧链都朝向通道的中央大空腔, 是hERG通道阻断剂的主要结合位点。本研究检测了HRU对突变的hERG通道Y652A、F656V的作用, 与野生型相比, 突变组电流的抑制作用明显减弱, 说明HRU与hERG通道的结合位点是Y652和F656, 抑制了hERG通道的开放过程。药物除了影响hERG通道功能, 也会影响hERG蛋白的合成、转运过程, 这也是导致发生acLQTS的重要原因之一。hERG通道的合成有两种形式: ①定位于内质网的135 kDa的未成熟核糖基化蛋白; ②约155 kDa的完全糖基化为成熟蛋白, 转运到细胞表面。hERG位于7q35~36基因位置, 从细胞核内转录成mRNA出核, 在内质网翻译合成初始hERG, 经过复杂正确的折叠、糖基化(135 kDa)、组装等过程方可离开内质网, 到达高尔基完全糖基化后再运输到细胞膜上, 形成成熟hERG蛋白, 发挥其电压门控通道特性。在这个过程中, 发生错误折叠或装配不完全的蛋白会在内质网中被质量控制识别并使其潴留在内质网中, 导致膜上蛋白表达减少, 即发生顺行转运障碍(anterograde trafficking defects)。核转录因子Sp1蛋白以及帮助hERG折叠、转运的伴侣蛋白热休克蛋白Hsp70、Hsp90在此过程中起重要调控作用。HRU孵育给药抑制hERG蛋白的表达, 同时电流减少, 说明HRU抑制的是功能性hERG蛋白。课题组前期实验首次证实, 转录因子Sp1在hERG的转录过程中起到重要调控作用^[22], 本实验应用Western blot观察到细胞核内Sp1和细胞浆内hERG蛋白表达都明显降低, 免疫荧光结果也与之保持一致, 说明HRU是通过下调Sp1而减少转录过程, 进而发挥调控hERG的作用。综上所述, HRU对hERG通道的瞬时作用主要是通过加快通道失活过程, 从而抑制hERG电流。HRU对hERG通道的长期抑制作用主要通过降低转录因子Sp1表达, 导致hERG通道在转录过程出现障碍, 使hERG mRNA水平降低, 导致蛋白表达量降低。

临床上应用吴茱萸等这类含大量生物碱的药物治疗疾病时, 有必要进行血药浓度监测, 尤其和具有抑制hERG通道风险的药物联用时, 需要及时调整用药剂量, 尽量避免不良反应的产生。

作者贡献: 李相花负责实验设计、实验操作以及论文初稿的完成; 战歌、李加欣、任家成负责部分分子生物学及膜片钳等实验工作; 樊攀、李宝馨负责课题设计指导以及稿件的修改等工作。

利益冲突: 所有作者均不存在利益冲突。