前列腺癌(prostate cancer, PC) 是目前全球男性最常见的恶性肿瘤。根据2020年全球癌症统计数据显示, 新发病例估计141.4万例, 其发病率(约占7.3%) 位居全球癌症第4位; 约37.5万例患者死于前列腺癌, 其死亡率(约占3.8%) 位居第8位^[1]。近年来, 随着人口老龄化、饮食和生活方式的改变, 前列腺癌的发病率已呈显著上升趋势。早期的前列腺癌患者可以通过根治性手术或放疗, 达到良好的治疗效果, 然而大多数前列腺癌患者在确诊时已处于晚期^[2]。目前常见的前列腺癌的治疗方法包括内分泌治疗(醋酸阿比特龙、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺)、化学疗法(多西他赛、卡巴他赛)、靶向治疗和免疫疗法等, 仍有部分患者出现复发和转移的情况, 甚至转化为激素抵抗性前列腺癌, 因此亟须新的疗法来改善前列腺癌患者的生存率^{[3, 4]}。

传统的中药是开发有效抗肿瘤药物的天然宝库, 中药单体的分离和药理作用研究对开发新型的抗肿瘤药物具有重要意义^[5]。蟾酥是从动物蟾蜍的皮肤和耳后腺提取和分离的药物, 蟾毒灵(bufalin) 是从传统中药蟾酥中分离得到的一种蟾蜍二烯内酯。蟾毒灵作为一种甾体类化合物, 不仅具有强心、抗炎、镇痛和调节免疫等生理活性, 越来越多的研究证实蟾毒灵在肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌和黑色素瘤等癌症患者中的抗肿瘤作用^[6-8]。然而, 蟾毒灵抑制前列腺癌体外生长和迁移侵袭能力的作用机制尚未完全阐明。本研究旨在研究蟾毒灵对前列腺癌PC3细胞增殖、迁移和侵袭, 并对其相关机制进行探讨。

细胞培养   人前列腺癌细胞株PC3购于ATCC公司, 于含有10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司) 中置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养, 定期观察细胞。

MTT实验   取对数生长期的PC3细胞, 胰酶消化后按照4 000个/孔的细胞密度接种于96孔板中, 培养至一定时间后分别加入不同浓度的蟾毒灵, 每组设6个复孔, 并设立空白对照组。处理68 h后, 加入浓度为5 mg·mL^-1 MTT溶液(MP Biomedicals公司) 20 μL, 继续孵育4 h后吸弃上清液, 每孔加入DMSO溶液100 μL, 室温震荡10 min, 在490和655 nm波长下测定吸光度(A)。细胞增殖活力(%) = (1–A_实验组/A_对照组) × 100, 计算蟾毒灵对PC3细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)^[9]。

划痕实验   首先在6孔板背后用marker笔均匀地画5条横线, 取对数生长期的PC3细胞, 胰酶消化后按照4×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔板中, 当细胞融合率接近90%时, 用枪头垂直于背后的横线划3道痕。PBS润洗2次后加入含有不同浓度药物的低血清培养基, 于0、12和24 h在倒置显微镜下拍照^[10]。

Transwell实验   取对数生长期的PC3细胞, 胰酶消化后用无血清培养基重悬细胞, 按照6×10⁴个/孔的细胞密度接种于上室(未铺胶), 加入无血清培养基稀释的不同浓度的蟾毒灵溶液, 下室加入600 μL完全培养基, 于培养箱中孵育24 h后取出小室(Corning公司), 移到含甲醇的孔板中室温固定30 min, 接着移到含0.5%结晶紫的孔板中染色1 h, 轻轻用PBS冲洗浸泡数次, 用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞, 底面朝上晾干, 于倒置显微镜下拍照。评估细胞的侵袭能力需要将基质胶(Corning公司) 和无血清培养基按照1∶8的比例稀释, 取45 μL铺在上室于培养箱放置2 h使其凝固后再重复上述步骤^[11]。

Western blot实验   取对数生长期的PC3细胞, 胰酶消化后按照4×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔板中, 不同浓度的蟾毒灵溶液处理细胞48 h后, 加入80 μL配制好的裂解液(RIPA∶PMSF∶PI = 100∶1∶2), 冰上裂解30 min, 12 000 r·min^-1离心20 min后取上清液用BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司) 进行蛋白浓度定量。按照每孔25 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离后, 将凝胶中的蛋白湿转到PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 一抗4 ℃孵育过夜, TBST洗膜3次, 每次10 min, 二抗室温孵育1 h, TBST洗膜3次, 每次10 min, 使用ECL发光液显色, 凝胶成像系统成像。以β-肌动蛋白(β-actin, Affinity公司, AF7018) 表达作为内参对照^[12]。本研究所采用的一抗E-钙黏附素(E-cadherin, 3195S)、N-钙黏附素(N-cadherin, 13116S)、β-连环蛋白(β-catenin, 8480S)、基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9, MMP9, 13667S)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2, MMP2, 40994S)、癌基因c-myc (9402S)、锌指转录因子Snail (3879S)、整合素α2 (integrin α2, ITGA2, 88228S)、整合素β1 (integrin β1, ITGB1, 9699S)、整合素β3 (integrin β3, ITGB3, 13166S)、整合素β5 (integrin β5, ITGB5, 3629S)、Yes相关蛋白/转录共激活因子PDZ结合基序(Yes-associated protein/transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif, YAP/TAZ, 8418S)、磷酸化类固醇受体辅激活因子(phospho-steroid receptor coactivator, p-Src, 2105S)、蛋白激酶B (protein kinase B, Akt, 4685S)、磷酸化蛋白激酶B (phospho-protein kinase B, p-Akt, 13038S) 购自Cell Signaling Technology公司; 整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK, DF6141)、局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK, AF6397)、磷酸化局部黏着斑激酶(phospho-focal adhesion kinase, p-FAK, AF3398)、类固醇受体辅激活因子(steroid receptor coactivator, Src, AF6161) 购自Affinity公司。

统计学分析   采用GraphPad Prism 7.0软件对实验数据进行统计分析, 符合正态分布的计量资料以均数±标准差($ \stackrel{-}{x}\pm s $) 表示。两组均数比较, 如果每一组资料都呈正态分布并且方差齐性, 组间比较采用t检验; 多组均数比较, 各组定量资料都呈正态分布并且方差齐性, 采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

为了确定蟾毒灵(图 1A) 对前列腺癌PC3细胞活力的影响, 利用MTT实验考察了蟾毒灵处理细胞后细胞生存率的变化。结果表明, 随着蟾毒灵浓度的增高, PC3细胞活力逐渐递减(图 1B)。蟾毒灵对PC3细胞的IC₅₀为0.26 ± 0.03 μmol·L^-1, 本研究将0.10、0.20和0.40 μmol·L^-1作为后续实验的浓度。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Chemical structure of bufalin and its inhibitory effect on the growth of prostate cancer PC3 cells. A: Chemical structure of bufalin; B: Bufalin could inhibit the cell viability of PC3 cells in a concentration-dependent manner with a half maximal inhibitory concentration (IC50) value of 0.26 ± 0.03 μmol·L-1

划痕实验结果表明, 随着蟾毒灵处理浓度增加, PC3细胞的迁移速度逐渐变慢, 说明蟾毒灵能够浓度依赖性地抑制PC3细胞的平面迁移能力(图 2)。蟾毒灵作用12 h后, 对照组、0.10、0.20和0.40 μmol·L^-1处理组的相对迁移率分别为41.11% ± 2.40%、24.74% ± 1.01%、21.67% ± 0.85%、17.86% ± 1.30%; 蟾毒灵作用24 h后, 对照组、0.10、0.20和0.40 μmol·L^-1处理组的相对迁移率分别为71.77% ± 1.91%、33.11% ± 0.78%、22.33% ±1.16%、19.20% ± 0.31%。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Bufalin inhibited the horizontal migration of PC3 cells in a concentration-dependent manner. A: Wound healing assay was applied to investigate the effect of bufalin on the horizontal migration of PC3 cells. Scale bar: 50 μm; B: The statistical results of A, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

Transwell实验结果表明, 随着蟾毒灵浓度的增加, 穿过微孔滤膜的PC3细胞数量逐渐减少, 且呈现剂量依赖效应, 说明蟾毒灵能够明显抑制PC3细胞的空间迁移能力和侵袭能力(图 3)。Transwell小室未铺基质胶时, 对照组、0.10、0.20和0.40 μmol·L^-1处理组的穿膜细胞数分别为587 ± 45.3、320 ± 26.2、228 ± 16.6、161 ± 25.1个; Transwell小室铺基质胶时, 对照组、0.10、0.20、0.40 μmol·L^-1处理组的穿膜细胞数分别为457 ± 18.5、210 ± 10.8、111 ± 12.3、42 ± 5.0个。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Bufalin inhibited the spatial migration and invasion of PC3 cells in a concentration-dependent manner. A: Transwell assay was used to investigate the effect of bufalin on the spatial migration and invasion of PC3 cells. Scale bar: 50 μm; B: The statistical results of A, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

Western blot实验结果表明, 与对照组比较, 0.10、0.20和0.40 μmol·L^-1蟾毒灵处理后, EMT相关蛋白包括E-cadherin的表达水平上调和N-cadherin、β-catenin、MMP9、MMP2、c-myc、Snail的表达水平下调, 整合素家族蛋白包括ITGA2、ITGB1、ITGB3、ITGB5、YAP/TAZ和ILK的表达水平均下调(图 4)。以上结果提示, 蟾毒灵对PC3细胞迁移侵袭的抑制作用与其调控EMT和整合素家族蛋白的表达相关。

Figure 4

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Figure 4 Expression changes of epithelial-mesenchymal transformation (EMT) and integrin family protein level in PC3 cells treated with different concentration of bufalin. MMP: Matrix metalloproteinase; ITGA: Integrin α; ITGB: Integrin β; YAP: Yes-associated protein; TAZ: Transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif; ILK: Integrin-linked kinase

本研究接着通过Western blot检测蟾毒灵处理后PC3细胞内FAK/Src/PI3K/Akt信号通路的影响。与对照组比较, 蟾毒灵可抑制p-FAK/FAK、p-Src/Src、p-Akt/Akt的蛋白表达水平, 这表明蟾毒灵可能通过FAK/Src/PI3K/Akt通路抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭(图 5)。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Expression changes of key protein level in FAK/Src/PI3K/Akt pathway in PC3 cells treated with different concentration of bufalin. FAK: Focal adhesion kinase; Src: Steroid receptor coactivator; Akt: Protein kinase B

肿瘤细胞发生EMT后具有明显的侵袭和转移能力, 是肿瘤恶化的重要标志。蟾毒灵是从中国传统中药蟾酥中分离出来的一种具有生物活性的多羟基类固醇, 其抗肿瘤活性引起了许多研究者的关注。据报道, 蟾毒灵对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用。Wang等^[13]发现蟾毒灵能抑制胃癌AGS细胞的侵袭和转移, 抑制裸鼠皮下移植瘤的生长, 可能与下调Wnt/β-catenin信号通路, 抑制无刚毛鳞甲样转录因子(Achaete scute-like2, ASCL2) 表达和EMT有关。Qian等^[14]发现蟾毒灵可能通过抑制p-c-Met的表达进而抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular signal regulated protein kinases, MEK/ERK) 和PI3K/Akt信号通路的激活, 对胆囊癌GBC-SD细胞的生长、侵袭、迁移和成球能力有一定的抑制作用。此外, c-myc的表达下调可通过抑制缺氧诱导因子-1α/基质细胞衍生因子-1/CXC趋化因子受体4通路, 进而增强蟾毒灵在胰腺癌PANC-1和SW1990细胞中的抗肿瘤活性^[15]。然而, 有关蟾毒灵对前列腺癌侵袭和转移的抑制作用研究还比较少, 本研究发现蟾毒灵能够抑制前列腺癌PC3细胞增殖, 其IC₅₀值为0.26 ± 0.03 μmol·L^-1。划痕实验和Transwell实验结果显示, 相比于对照组, 蟾毒灵以浓度依赖性的方式减慢PC3细胞的迁移速度和减少PC3细胞的穿膜数量, 这表明蟾毒灵能够显著抑制PC3细胞的迁移能力和侵袭能力。

EMT过程的表型分子表达改变包括上皮表型E-cadherin表达下调, 同时间充质表型N-cadherin表达上调, 主要表现为E-cadherin表达向N-cadherin表达转移, 诱导β-catenin进入胞核, 参与基因的转录与调控^[16]。在缺失Wnt信号的情况下, 大部分β-catenin与E-cadherin蛋白结合参与细胞的黏附作用, 磷酸化的β-catenin随后被泛素连接酶-蛋白酶体系统识别和降解。一旦Wnt蛋白与受体结合, β-catenin在细胞核中积累, 与T细胞因子/淋巴因子增强子形成复合物开启Wnt响应基因的转录^[17]。本研究结果发现, 蟾毒灵PC3细胞内E-cadherin蛋白表达上调, N-cadherin和β-catenin蛋白表达下调, 说明EMT过程可能被蟾毒灵所抑制。MMPs家族蛋白可通过降解细胞外基质成分, 或调节细胞信号通路等途径增强肿瘤细胞的侵袭转移能力, 其中MMP9和MMP2是常见的肿瘤治疗靶点^[18]。本研究结果表明, 蟾毒灵作用后, 调控肿瘤细胞迁移侵袭的MMP9和MMP2蛋白表达下降。c-myc具有调节细胞增殖分化和促进细胞凋亡的作用, 在前列腺癌组织中呈现过度表达的状态^[19]。Snail在多种恶性肿瘤中表达上调, 可以诱导间充质和侵袭相关基因表型的表达, 亦是重要的E-cadherin转录调节抑制基因^[20]。c-myc和Snail的蛋白表达下调也提示了蟾毒灵可能具有抑制PC3细胞体外生长和迁移的作用。

整合素是一种异二聚体Ⅰ型跨膜蛋白, 能够介导细胞与细胞外基质的黏附和激活, 在癌症的黏附、侵袭和转移过程中扮演关键的角色^[21]。目前, 已经发现整合素的18个α亚基和8个β亚基, 可结合产生至少24种不同的整合素^[22]。YAP/TAZ是Hippo信号通路级联的下游效应因子, 其激酶级联反应通过磷酸化YAP/TAZ来抑制活性, 从而调控器官和肿瘤的形成。研究表明, 整合素可通过Ras相似物GTP酶(Ras homologue GTPases, Rho GTPases) 对YAP/TAZ发挥调控作用^[23]。ILK是细胞内具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的信号蛋白, 可通过激活整合素信号通路, 参与调控肿瘤细胞恶性表型^[24]。本研究结果表明, 与对照组相比, 蟾毒灵作用后, PC3细胞内ITGA2、ITGB1、ITGB3、ITGB5、YAP/TAZ和ILK等蛋白表达下调, 推测整合素相关通路被抑制, 改变了细胞的运动能力, 降低了细胞的迁移侵袭能力。

FAK与Src在结构和功能上相互作用, 形成FAK/Src复合体, 接着诱导PI3K的募集, PI3K的活化导致侵袭性肿瘤细胞的转移表型。PI3K可催化磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸(phosphatidylinositol-4, 5-bis-phosphate, PIP2) 肌醇环的30位点磷酸化, 使其转化为磷脂酰肌醇-3, 4, 5-三磷酸(phosphatidylinositol-3, 4, 5-trisphosphate, PIP3)。PIP3水平升高可通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1, PDK1) 激活Akt, 从而调节细胞的代谢、生长和转移等诸多生理过程^[24]。Wu等^[25]的研究表明, RNA聚合酶Ⅰ的转录活性是由整合素信号密切控制, 在整合素激活过程中, FAK/Src/PI3K/Akt/mTOR信号通路控制RNA聚合酶Ⅰ活性, 进而参与细胞的生长和发展过程。近年来, 越来越多研究表明FAK/Src/PI3K/Akt信号通路是治疗肿瘤侵袭转移的重要靶点。FAK是整合素介导的癌细胞信号转导途径的主要控制因子, 首先FAK与整合素结合形成局部黏附复合体时, 接着Src磷酸化FAK, 进而激活PI3K/Akt、MEK/ERK等信号通路, 调控癌细胞的黏附、迁移和侵袭。Huang等^[26]发现肉桂子三萜化合物antcin K降低integrin β1、β3、α5和αv蛋白表达, 抑制FAK、Src、PI3K、Akt等磷酸化, 还可抑制MMP2和MMP9蛋白激活, 影响EMT通路相关蛋白包括E-cadherin和vimentin的表达水平, 抑制人肝癌Hep 3B细胞的侵袭迁移。基于本研究的Western blot结果显示, 蟾毒灵处理后细胞内FAK、Src、Akt的蛋白表达与对照组相差不大, 而p-FAK、p-Src、p-Akt的蛋白表达呈现出被显著抑制的趋势, 因此推测蟾毒灵可能通过FAK/Src/PI3K/Akt信号通路调控前列腺癌PC3细胞的体外生长和迁移侵袭过程。

综上所述, 初步研究显示蟾毒灵能够抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移与侵袭能力, 且呈现浓度依赖效应。此外, 蟾毒灵能影响EMT和整合素家族蛋白的表达, 推测这在一定程度上是通过FAK/Src/PI3K/Akt信号通路进行调控的。以上结果提示, 蟾毒灵在抗前列腺癌转移治疗中具有良好的应用前景, 这对于开发新的抗肿瘤药物具有重要意义, 为探索新的治疗靶点提供参考价值。

作者贡献: 张建业负责课题的实验设计; 王海临负责数据分析和文章撰写; 周雯敏负责文献查阅和稿件修改; 扶佳俐和叶阳娇负责划痕和Transwell实验; 扈新和高慧林负责Western blot实验。

利益冲突: 本文所有作者均声明无利益冲突。