药学学报  2022, Vol. 57 Issue (5): 1336-1343     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0664   PDF    
引用本文
ZHU Zi-yu, YU Yuan-zhi, YUAN Yue, ZHANG Jian-jun. YZG-330 regulates the TRPM8 ion channel through the P38 MAPK signaling pathway to reduce body temperature in mice[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022, 57(5): 1336-1343.  
朱子玉, 虞远智, 袁月, 张建军. YZG-330通过P38 MAPK信号通路调节TRPM8离子通道发挥降温作用[J]. 药学学报, 2022, 57(5): 1336-1343.  
YZG-330通过P38 MAPK信号通路调节TRPM8离子通道发挥降温作用
朱子玉#, 虞远智#, 袁月, 张建军     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 新药作用机制研究和药效评价北京市重点实验室, 北京 100050
收稿日期: 2021-10-14; 修回日期: 2022-01-11
基金项目: 国家自然科学基金项目资助(81773715); 中国医学科学院创新工程项目(2021-I2M-1-028)
*通讯作者: 张建军, Tel: 13522110127, E-mail: jjzhang@imm.ac.cn
#共同第一作者.
摘要: 实验室前期研究发现化合物YZG-330能够使小鼠降低体温, 该作用可被腺苷A1受体(adenosine A1 receptor, A1R) 拮抗剂DPCPX拮抗, 本文基于A1R下游信号通路对YZG-330的作用机制进行进一步探究。通过测量小鼠肛温进行YZG-330药效学评价; 采用Western blot技术检测小鼠下丘脑组织匀浆中瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP) 离子通道和P38蛋白及其磷酸化水平; 通过Ca2+荧光探针Fluo-3AM负载细胞, 检测YZG-330对小鼠下丘脑细胞内Ca2+含量的影响。YZG-330可剂量依赖性地降低小鼠体温, P38选择性抑制剂SB-203580 (20 mg·kg-1, i.p.) 可显著抑制YZG-330的降温作用。TRPM8拮抗剂(每只小鼠0.1 μg, i.c.v.) 可以部分拮抗YZG-330 (0.25 mg·kg-1和1 mg·kg-1, i.p.) 的降温效果。腹腔注射给予小鼠YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p.) 可显著上调小鼠下丘脑组织中P38磷酸化水平, A1R拮抗剂DPCPX (5 mg·kg-1, i.g.) 可有效抑制该变化; YZG-330还可显著上调小鼠下丘脑组织中TRPM8表达量, SB-203580可非常显著地抑制YZG-330引起的TRPM8上调; YZG-330 (0.1~10 μmol·L-1) 可剂量依赖性地升高小鼠下丘脑细胞内Ca2+浓度, A1R抑制剂DPCPX (0.5和1 μmol·L-1) 与TRPM8拮抗剂(1 μmol·L-1) 均可抑制YZG-330的升高胞内Ca2+浓度的作用。综上所述, YZG-330发挥降温作用的机制之一是通过激活A1R, 促进P38蛋白磷酸化, 进而上调TRPM8离子通道表达量并激活该通道开启, 导致胞内Ca2+含量上升, 通过负调节下丘脑体温调定点导致体温下降。本文中所有动物实验均获得中国医学科学院药物研究所伦理委员会批准。
关键词: 腺苷A1受体    丝裂原活化蛋白激酶P38    瞬时受体电位离子通道亚家族8    Ca2+离子    
YZG-330 regulates the TRPM8 ion channel through the P38 MAPK signaling pathway to reduce body temperature in mice
ZHU Zi-yu#, YU Yuan-zhi#, YUAN Yue, ZHANG Jian-jun     
Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Preliminary research in our laboratory found that compound YZG-330 can reduce mouse body temperature, which could be blocked by adenosine A1 receptor (A1R) antagonist DPCPX. Based on the downstream signaling pathway of the A1R, the mechanism by which YZG-330 lowers body temperature was further studied. The pharmacodynamics of YZG-330 was evaluated by measuring the rectal temperature; expression of the transient receptor potential (TRP) ion channel, the P38 protein and its phosphorylated form in mouse hypothalamic homogenate were detected by Western blotting. A Ca2+ fluorescent probe, Fluo-3AM, was added to cells to detect the effect of YZG-330 on the Ca2+ content of mouse hypothalamic cells. YZG-330 dose-dependently reduced the body temperature in mice, and the selective P38 inhibitor SB-203580 (20 mg·kg-1, i.p.) significantly inhibited the hypothermic effect of YZG-330. A TRPM8 antagonist 2 (0.1 μg per mouse, i.c.v.) markedly attenuated the hypothermic effect of YZG-330 (0.25 or 1 mg·kg-1, i.p.). YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p.) significantly increased the phosphorylation of P38, an effect that could be attenuated by the A1R antagonist DPCPX (5 mg·kg-1, i.g.) in mouse hypothalamus. In addition, YZG-330 also prominently enhanced the expression of TRPM8, which could be blocked by SB-203580; YZG-330 (0.1-10 μmol·L-1) increased intracellular Ca2+ concetration in mouse hypothalamic cells in a dose-dependent manner, and was inhibited by the A1R inhibitor DPCPX (0.5 and 1 μmol·L-1) and TRPM8 antagonist 2 (1 μmol·L-1). In conclusion, YZG-330 exerts its hypothermic effect by activating the A1R to promote the phosphorylation of P38 protein and thereby up-regulating the expression and activity of the TRPM8 ion channel, resulting in increased intracellular Ca2+ concentration to stimulate mouse hypothalamus cells to down-regulate body temperature. All animal experiments were approved by the Ethics Committee of the Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences.
Key words: adenosine A1 receptor    P38 MAPK    transient receptor potential M8    Ca2+ ion    

体温调节是人体内分泌系统自主神经和行为调节共同作用的结果, 调节中枢位于下丘脑视前区(preoptic area, POA), 温度信号经由初级感觉神经元传至脊髓或三叉神经背角(dorsal horn, DH) 后继续传导至外侧臂旁核(lateral parabrachial nucleus, LPB), 刺激LPB区中分别调节冷热信号的神经元后投射到体温调节中枢POA, 经由下丘脑背内侧核(dorsomedial hypothalamus, DMH), 传至中缝苍白球(rostral Raphe Pallidus, rRPa), 作用于棕色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT), 通过促进或抑制BAT产热, 进而调节体温[1-3]。腺苷作为内源性的神经递质, 在调节机体生理状态的过程中扮演了重要的角色。整体水平给予小鼠腺苷可以导致一系列的生理反应, 包括自主活动的减少、镇静及体温的降低。有文献表明, 激活小鼠下丘脑区域的腺苷A1受体(adenosine A1 receptor, A1R) 可导致体温降低[4, 5]。本实验室前期针对腺苷母核进行了一系列设计和优化, 得到了化合物YZG-330 (化学结构见图 1), 在整体动物药效学研究过程中, 发现YZG-330可以显著降低动物的体温, 且实验证明这种降温作用是通过激活中枢A1R实现的[6], 但其具体作用机制尚未完全明确。

Figure 1 ‍Chemical structure of YZG-330 [(2R, 3S, 4R, 5R)-2-(hydroxymethyl)-5-(6-(((R)-1-phenylpropyl) amino)-9H-purin-9-yl) tetrahydrofuran-3, 4-diol]. Molecular weight: 385.42

A1R可介导丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 信号通路激活[7], MAPK是一组能被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶, 是调节正常和病理状态下多种细胞过程(如增殖、分化、凋亡和应激反应) 的关键信号通路。MAPK可分为4个亚族: 细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)、P38蛋白(protein 38, P38)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK) 和ERK5[8], 其中P38以及ERK信号通路均可介导瞬时受体电位M8 (transient receptor potential M8, TRPM8) 及瞬时受体电位A1 (transient receptor potential A1, TRPA1) 激活[9]。TRP通道是瞬时感受器电位离子通道家族中的成员, 主要位于细胞膜上, 其主要功能是感受温度和其他物理及化学伤害性刺激, 可参与机体温度感觉及体温调节等重要生命活动[10]。TRP通道共有28个亚基, 分为7个亚家族: TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPN、TRPP和TRPV[11]。这些亚型的离子通道有着不同的温度敏感性, 且TRP每一种亚型只针对特定范围的温度变化有反应: TRPV 1/2/3/4和TRPM 2/4/5是热激活通道, 而冷刺激主要激活TRPA1和TRMP8亚型[12]。TRP离子通道是一种非选择性阳离子通道, 可介导阳离子尤其是Ca2+的转运[13]。细胞膜内外尤其是胞内Ca2+浓度的改变可引发许多生理及病理性改变。Ca2+是一种重要的体温负调节介质, 有实验表明小鼠中枢神经系统胞内Ca2+含量上升可刺激下丘脑体温调定点导致体温下降[14]。

本文将基于A1R下游信号通路对YZG-330的作用机制进行进一步探索。

材料与方法

实验动物  雄性ICR小鼠SPF级, 体重24~26 g; 购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号: SCXK (京) 2016-0006]。动物饲养环境保持12 h昼夜节律, 室温保持在(24 ± 1) ℃, 相对湿度为(60 ± 5) %。标准小鼠饲养盒内喂养动物, 自由进食和进水。动物实验均获得中国医学科学院药物研究所伦理委员会批准。

药品与试剂  化合物YZG-330, 由中国医学科学院药物研究所石建功教授实验室合成, HPLC检测纯度大于99%。1, 3-二丙-8-环戊黄嘌呤(8-cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine, DPCPX) (9A/70155, Tocris公司); TRPM8拮抗剂2 (HY-112430)、SB-203580 (HY-10256)、磷酸酶抑制剂(HY-K0022)、蛋白酶抑制剂(HY-K0010) (MCE公司); N6-环戊基腺苷(N6-cyclopentyladenosine, CPA) (ab120398)、抗TRPA1兔多抗(19124-1-AP)、抗TRPM8兔单抗(ab109308) (Abcam公司); 抗phospho-P38 (4511S)、抗P38兔单抗(8690S) (Cell Signaling Technology公司); 抗β-tubulin抗体(ab1017t, 北京博奥锐京公司); 山羊抗兔IgG (ZB-2301, 中山金桥公司); 山羊抗鼠IgG (SA00001-1, Proteintech公司); RIPA裂解液(强) (P0013B)、DMSO (ST038) (上海碧云天生物技术研究所); BCA蛋白浓度检测试剂盒(CW0014S, 康为世纪生物技术有限公司); D-Hanks液(H-1045, 北京Solarbio公司); Fluo-3AM ester (50013, 北京博知源公司); Pluronic F-127增溶剂(P300MP, 赛默飞公司)。

仪器  动物智能数字测温计(TH212, 恒进达海创高科); DYY-7C型电泳仪(北京六一厂); 酶标仪(MQX200, 美国Bio-Tek公司); ECL (Image Quant LAS4000, 美国GE公司); 脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。

动物体温测定  雄性ICR小鼠随机分为4组, 每组6只, 分别为溶剂对照组、YZG-330 (0.25、1和4 mg·kg-1, i.p.) 组。实验时, 首先抓取小鼠测量两次肛温, 取平均值作为基础体温, 后腹腔注射给予YZG-330, 每10 min抓取小鼠记录其肛温。

雄性ICR小鼠随机分为8组, 每组6只, 分别为溶剂对照组、P38磷酸化拮抗剂SB-203580组(20 mg·kg-1, i.p.)、YZG-330组(2 mg·kg-1, i.p.)、阳性对照CPA组(1 mg·kg-1, i.p.)、SB-203580 (5和20 mg·kg-1, i.p.) + YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p.) 组、SB-203580 (5和20 mg·kg-1, i.p.) + CPA (1 mg·kg-1, i.p.) 组。实验时, 首先抓取小鼠测量两次肛温, 取平均值作为基础体温, 后按组别腹腔给予不同剂量拮抗剂, 20 min后按组别给予YZG-330、CPA和溶剂, 每10 min抓取小鼠记录其肛温。

雄性ICR小鼠随机分为6组, 每组6只, 分别为溶剂对照组、TRPM8拮抗剂2 (每只小鼠0.1 μg, i.c.v.)、YZG-330组(1 mg·kg-1, i.p.)、YZG-330组(0.25 mg·kg-1, i.p.)、TRPM8拮抗剂2 (每只0.1 μg, i.c.v.) + YZG-330 (1 mg·kg-1, i.p.) 组、TRPM8拮抗剂2 (每只0.1 μg, i.c.v.) + YZG-330 (0.25 mg·kg-1, i.p.) 组。实验时, 首先抓取小鼠测量两次肛温, 取平均值作为基础体温, 后按组别侧脑室注射给予拮抗剂或溶剂, 5 min后按组别给予YZG-330或溶剂, 每10 min抓取小鼠记录其肛温。

下丘脑蛋白匀浆制备  ICR小鼠随机分组, 按组别给予相应化合物, 15 min或1 h后脱颈处死取脑, 置于冰上分离下丘脑, 称重。RIPA裂解液中加入1×蛋白酶抑制剂、1×磷酸酶抑制剂混合物混合置于冰上备用, 样品称重后按1∶10 (w/v) 比例向组织中加入相应体积的RIPA裂解液, 在冰浴条件下超声破碎, 功率250 W, 每次3 s, 间隔10 s, 反复2~3次, 之后置于冰上10 min使蛋白充分裂解, 在4 ℃条件下12 000 ×g离心20 min, 离心后取蛋白上清液。

蛋白质免疫印迹(Western blot)  Western blot使用BCA法测定待检测蛋白浓度, 加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液后37 ℃水浴15 min, 采用等量上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜, 用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜70 min后, TBST洗涤3次, 每次5 min; 将膜放于TBST稀释的一抗中, 4 ℃孵育过夜; 回收一抗, TBST洗涤3次, 每次5 min; 将膜放于TBST稀释的二抗中(二抗按1∶8 000稀释), 室温震荡孵育1 h, TBST洗3次, 每次5 min; 在PVDF膜中滴加配好的ECL发光液, 利用化学发光成像系统采集化学发光图像。用Image J软件处理目的蛋白条带。

下丘脑细胞Ca2+含量测定  将取出的新鲜下丘脑组织迅速置于4 ℃ D-Hanks液中, 研磨成匀浆, 过200目网筛滤至培养皿中, 滤液在4 ℃下1 000 r·min-1离心10 min, 弃上清, 在沉淀物中加入Krebs-Ringer-HEPES-glucose buffer (KRH-glc) 400 μL, 吹打均匀后, 取20 μL细胞悬液加入20 μL 0.04%台盼蓝, 混匀后进行细胞计数检测活细胞浓度。

将细胞稀释至每毫升2×106个, 分为空白组、对照组、YZG-330组(0.1、0.3、1、3、6.5和10 μmol·L-1) 和CaCl2阳性对照组(2 mol·L-1)。除空白组外每100 μL细胞液中加入25 μL Fluo-3AM稀释液及25 μL CaCl2 (1.2 mol·L-1), 使探针终浓度为5 μmol·L-1, CaCl2终浓度为0.2 mol·L-1; 空白组每100 μL细胞液中加入25 μL Fluo-3AM稀释液及25 μL KRH-glc, 使探针终浓度为5 μmol·L-1。避光震荡孵育20 min, 按组别分别加入50 μL KRH-glc、各浓度YZG-330及CaCl2溶液。采用荧光分光光度计测定, 激发波长为488 nm, 发射波长为526 nm。根据公式可计算[Ca2+]。[Ca2+] = Kd [(F-Fmin)/(Fmax-F)]。Kd值为450 nmol·L-1, Fmin为空白组荧光强度, Fmax为加入2 mol·L-1 CaCl2后测得的荧光强度。

细胞提取步骤同上, 将细胞稀释至每毫升2×106个, 共分为对照组、YZG-330组(6.5 μmol·L-1)、DPCPX组(1 μmol·L-1) 和DPCPX (0.5和1 μmol·L-1) +YZG-330 (6.5 μmol·L-1) 联合给药组。每100 μL细胞液中加入25 μL Fluo-3AM稀释液及25 μL各浓度DPCPX或KRH-glc, 使探针终浓度为5 μmol·L-1。避光震荡孵育20 min, 分别加入YZG-330或KRH-glc。采用荧光分光光度计测定, 激发波长为488 nm, 发射波长为526 nm。计算DPCPX抑制率Ri。Ri = [FYZG-330-FYZG-330+DPCPX]/[FYZG-330-FCon]。F为各组荧光强度值。

细胞提取步骤同上, 将细胞稀释至每毫升2×106个, 共分为对照组、YZG-330组(6.5 μmol·L-1)、TRPM8拮抗剂2组(0.1 μmol·L-1)、TRPM8拮抗剂2组(1 μmol·L-1) 和TRPM8拮抗剂2 (0.1和1 μmol·L-1) + YZG-330 (6.5 μmol·L-1) 联合给药组。每100 μL细胞液中加入25 μL Fluo-3AM稀释液及25 μL不同浓度的TRPM8拮抗剂2或KRH-glc, 使探针终浓度为5 μmol·L-1。避光震荡孵育20 min, 分别加入YZG-330或KRH-glc。采用荧光分光光度计测定, 激发波长为488 nm, 发射波长为526 nm。计算TRPM8拮抗剂2抑制率Ri。Ri = [FYZG-330-FYZG-330+TRPM8 antagonist 2]/(FYZG-330-FCon)。F为各组荧光强度值。

统计与分析  动物行为学实验数据以均数±标准误表示, 其余实验结果数据以均数±标准差表示, 应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。使用软件中Student's t-test方法进行统计处理, 显著性结果分别以P < 0.05、P < 0.01或P < 0.001表示有差异、显著性差异和极显著性差异。

结果 1 YZG-330可剂量依赖性地降低小鼠体温

腹腔注射给予小鼠YZG-330 (0.25、1和4 mg·kg-1), 与对照组相比, YZG-330可以显著降低小鼠体温(图 2)。YZG-330在0.25 mg·kg-1剂量下, 20 min后小鼠体温表现出显著性降低, 降温幅度最大达1.8 ± 1.1 ℃ (P < 0.01), 40 min后小鼠体温与对照组无差异。YZG-330在1 mg·kg-1剂量下, 小鼠体温在整个检测过程中与对照组小鼠相比均具有显著性差异, 给药50 min后小鼠体温降至最低点, 降温幅度达3.4 ± 1.9 ℃ (P < 0.001)。YZG-330在4 mg·kg-1剂量下, 10 min后小鼠体温显著降低, 在整个检测过程中体温持续降低, 90 min后, 降温速率减缓, 体温趋于稳定。YZG-330 (1和4 mg·kg-1) 各剂量组间具有显著性差异(图 2)。以上结果提示, YZG-330可剂量依赖性地降低小鼠体温。

Figure 2 The effect of YZG-330 (i.p.) on body temperature in mice. The mouse basal body temperature was measured before the administration of YZG-330, and then mice were administered YZG-330 (0.25, 1 and 4 mg·kg-1, i.p.), respectively, and the body temperature was measured every 10 minutes. n = 6, $ \stackrel{-}{x} $ ± SEM. **P < 0.01, ***P < 0.001 vs vehicle group
2 YZG-330可显著上调小鼠下丘脑P38磷酸化水平

如图 3所示, 给予小鼠YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p.) 15 min和1 h后, Western blot法检测小鼠下丘脑组织匀浆中P38蛋白表达及其磷酸化水平。与对照组相比, 给药15 min和1 h后小鼠下丘脑中总P38表达量均无明显变化, P38磷酸化水平以及P-P38/P38比值显著升高, 相对于给药后15 min, 给药1 h后P38磷酸化水平增幅较大, 且与对照组相比均具有显著性差异。

Figure 3 Effect of YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p) on the expression of P38 and its phosphorylated level in mouse hypothalamic. A: Expression of P38 and P-P38; B: Quantification of P-P38/P38 expression. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs vehicle group
3 A1R拮抗剂DPCPX可抑制YZG-330引起的P38磷酸化水平上调

灌胃给予A1R拮抗剂DPCPX (5 mg·kg-1, i.g.), 20 min后给予YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p.) 或CPA, Western blot检测小鼠下丘脑匀浆中P38表达及其磷酸化情况。如图 4所示, DPCPX可显著抑制YZG-330促进小鼠下丘脑P38磷酸化的作用, 同时降低了P-P38/P38比值, 与YZG-330组相比具有显著性差异。提示A1R参与了YZG-330调控小鼠下丘脑组织中P38磷酸化的作用, 确定A1R激活后下游信号为P38蛋白的磷酸化。

Figure 4 Effect of DPCPX (5 mg·kg-1, i.g) on YZG-330-induced change of expression of P38 and its phosphorylation in mouse hypothalamus. A: Expression of P38 and P-P38; B: Quantification of P-P38/P38 expression. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs vehicle group; #P < 0.05 vs YZG-330 only group
4 YZG-330可上调TRPM8和TRPA1表达

腹腔注射给予小鼠YZG-330 (0.25、2和4 mg·kg-1), 1 h后检测小鼠下丘脑组织中TRPM8和TRPA1的表达量, 如图 5所示, 在0.25、2和4 mg·kg-1三个剂量下YZG-330均上调了TRPA1和TRPM8的表达量, 且与溶剂对照组相比均具有显著性差异。

Figure 5 Effect of YZG-330 on the expression of transient receptor potential A1 (TRPA1, A) and transient receptor potential M8 (TRPM8, B) in mouse hypothalamus. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs vehicle group
5 选择性P-P38抑制剂SB-203580仅可抑制YZG-330上调TRPM8表达的作用

腹腔注射给予选择性P-P38抑制剂SB-203580 (5和20 mg·kg-1), 20 min后腹腔注射给予YZG-330 (2 mg·kg-1)。如图 6所示, 在20 mg·kg-1剂量下SB-203580可有效抑制YZG-330上调TRPM8的表达, 与单独给予YZG-330组相比具有显著性差异; SB-203580 (5 mg·kg-1) 对YZG-330上调TRPM8表达的抑制作用无统计学意义。但是SB-203580 (5和20 mg·kg-1) 对YZG-330上调TRPA1表达无显著抑制作用。结果提示, P38 MAPK信号通路介导了YZG-330上调TRPM8表达的作用, 即P38蛋白磷酸化后可以上调TRPM8离子通道的表达。

Figure 6 The effect of SB-203580 (5, 20 mg·kg-1, i.p.) on YZG-330-induced change of expression of TRPA1 (A) and TRPM8 (B) in mouse hypothalamus. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05 vs vehicle group; #P < 0.05 vs YZG-330 only group
6 YZG-330促进下丘脑细胞Ca2+内流, 既可被A1R拮抗剂阻断, 又可以被TRPM8拮抗剂阻断

如图 7所示, 小鼠下丘脑细胞与YZG-330共孵育10 min后, 在0.1~10 μmol·L-1剂量区间内, YZG-330组细胞内荧光强度的增加呈剂量依赖性, 与溶剂对照组相比均具有显著性差异。先加入DPCPX (0.5和1 μmol·L-1) 或者TRPM8拮抗剂2 (0.1和1 μmol·L-1), 20 min后再加入YZG-330 (6.5 μmol·L-1), 10 min后检测荧光强度, 如表 1所示, 与YZG-330组相比, DPCPX+YZG-330细胞内荧光强度显著降低, 且具有量效关系; TRPM8拮抗剂2 (1 μmol·L-1) + YZG-330细胞内荧光强度显著降低。

Figure 7 The effect of YZG-330 on Ca2+ level in mouse hypothalamic cells. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± SEM. **P < 0.01, ***P < 0.001 vs vehicle group

Table 1 The inhibition of DPCPX or TRPM8 antagonist 2 on YZG-330-induced influx of Ca2+ in mouse hypothalamic cells. Incubate A1R inhibitor DPCPX (0.5 and 1 μmol·L-1) or TRPM8 antagonist 2 (0.1 and 1 μmol·L-1) in advance, add YZG-330 (6.5 μmol·L-1) 20 minutes later to detect the fluorescence intensity in mouse hypothalamus cells. n = 3, $ \stackrel{-}{x} $ ± s. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs vehicle group
7 选择性P38抑制剂SB-203580可抑制YZG-330的降温作用

如图 8所示, 给药10 min后, 单独给予SB-203580 (20 mg·kg-1) 对小鼠体温无明显影响, YZG-330 (2 mg·kg-1) 组和SB-203580 (5和20 mg·kg-1, i.p.) + YZG-330组小鼠体温均明显下降。与YZG-330组相比, SB-203580 (20 mg·kg-1) + YZG-330组小鼠在给予YZG-330 30 min后降温速率开始明显减缓, 在50 min时体温降至最低, 降幅达4.90 ± 0.55 ℃, 随后体温回升。SB-203580 (5 mg·kg-1) + YZG-330组小鼠体温与YZG-330组相比无显著性差异。结果提示, YZG-330的降温作用可部分被P38抑制剂拮抗, P38蛋白的磷酸化在YZG-330致小鼠体温降低过程中发挥了重要作用。

Figure 8 The effect of SB-203580 on YZG-330-induced increase of mouse body temperature. The mouse basal body temperature was measured in advance, and then the selective P38 inhibitor SB-203580 (5, 20 mg·kg-1, i.p.) was given, followed by YZG-330 (2 mg·kg-1, i.p.) 20 min later, and body temperature was measured every 10 minutes. n = 6, $ \stackrel{-}{x} $ ± SEM. *P < 0.05 vs YZG-330 only group
8 TRPM8拮抗剂2可拮抗YZG-330的降温作用

如图 9所示, 给药30 min后, 单独给予选择性TRPM8离子通道拮抗剂2 (每只小鼠0.1 μg, i.c.v.) 对小鼠体温无明显影响, 而YZG-330组(0.25和1 mg·kg-1) 小鼠体温均明显下降, 与溶剂对照组相比有显著性差异。TRPM8拮抗剂2 + YZG-330 (0.25或1 mg·kg-1) 组小鼠体温与对应的YZG-330组(0.25或1 mg·kg-1) 均有显著性差异。结果表明, YZG-330的降温作用可部分被TRPM8拮抗剂2拮抗, TRPM8离子通道在YZG-330致小鼠体温降低过程中发挥了重要作用。

Figure 9 Effect of YZG-330 and TRPM8 ion channel on the maximum change of mouse body temperature. Antagonist was intracerebroventricularly given to mice for each group 10 min before intraperitoneal administration of YZG-330. n = 6, $ \stackrel{-}{x} $ ± SEM. ***P < 0.001 vs vehicle; ###P < 0.001 vs YZG-330 (0.25 mg·kg-1) group; $$P < 0.001 vs YZG-330 (1 mg·kg-1) group
讨论

本文首先验证了YZG-330在A1R介导下的降温作用。通过整体药效学评价, 本研究发现YZG-330可剂量依赖性地降低小鼠体温, 且P38受体拮抗剂SB-203580和TRPM8拮抗剂2均可拮抗YZG-330的降温作用。Western blot结果显示, 在给药15 min和1 h后, YZG-330可显著上调小鼠下丘脑中P38磷酸化表达, 并且可以被A1R抑制剂DPCPX拮抗。给药1 h后YZG-330可显著上调小鼠下丘脑组织中TRPM8的表达量, 且上调作用可被DPCPX和SB-203580拮抗, 说明YZG-330对TRPM8表达的调控受A1R和P38 MAPK信号通路的介导。YZG-330同样可在A1R介导下上调TRPA1的表达, 但SB-203580无法拮抗YZG-330对TRPA1的调控, 说明YZG-330对TRPA1的上调作用是通过A1R介导的, 但不受P38 MAPK信号通路的调控。荧光探针检测小鼠下丘脑细胞内Ca2+实验结果显示, YZG-330可剂量依赖性地促进小鼠下丘脑细胞中Ca2+内流, 且DPCPX或TRPM8拮抗剂均可抑制YZG-330引起的胞内Ca2+升高的作用。

实验发现, YZG-330致TRPM8和TRPA1表达上调没有量效关系, 可能是由于TRP离子通道的激活具有“Flip-flop”开关效应, 温度达到激活范围内即可激活, 不存在剂量依赖性。

A1R是一种G蛋白耦联型受体, 后续反应均通过cAMP-PKA或PI3K-AKT信号通路完成[15], 研究表明, A1R介导体温调节时, 是通过PKA-cAMP信号通路发挥作用的[16], 其下游是P38 MAPK通路[17]。基于以上实验结果得出结论: YZG-330激动A1R, 通过PKA-cAMP信号通路上调P38磷酸化水平, 上调TRPM8表达量, 激活离子通道, 促进Ca2+内流, 从而导致小鼠体温降低。最终确定的信号通路如图 10所示。由于A1R抑制剂DPCPX只能部分拮抗YZG-330的降温作用, 故YZG-330可能存在其他的作用靶点, 其具体机制还有待进一步探索。

Figure 10 YZG-330 cooling pathway in mouse hypothalmatic cells

作者贡献: 朱子玉主要负责部分动物行为学以及分子水平实验、文章撰写; 虞远智主要负责部分动物行为学、细胞水平实验以及文章整体修改; 袁月负责部分分子水平实验以及数据分析整理; 张建军主要负责指导整个实验的完成和投稿。

利益冲突: 所有作者均声明无利益冲突。

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