2. 中兽医药现代化山西省重点实验室, 山西 太谷 030801
2. Shanxi Key Lab for Modernization of TCVM, Taigu 030801, China
柴胡(Bupleurum chinense DC.) 为伞形科(Umbelliferae) 柴胡属(Bupleurum L.) 植物, 有2 000多年的药用历史, 《中国药典》记载, 中药材柴胡为柴胡和狭叶柴胡的干燥根[1], 具有多种药理作用[2]。近年来随着柴胡药用价值的不断发现, 市场对于柴胡的需求量也逐渐增加。但其野生资源由于过度采挖以及生境破坏等原因数量锐减[3], 中药材柴胡的供应主要依赖人工栽培, 柴胡栽培种质混杂情况严重, 造成药材混淆以及用药安全等问题, 亟需开展柴胡种质资源收集整理与鉴定, 为柴胡优良种质创新提供支撑。另外, 对柴胡种质进行遗传多样性研究, 有助于探究柴胡的起源与进化关系, 为种质鉴定、分类提供理论依据, 同时为良种选育、资源保护等提供有效参考[4]。
种质资源遗传多样性可通过表型性状或者分子标记等多种方法进行研究, 表型性状具有不稳定性, 易受外界环境影响, 从而导致评价结果缺乏稳定性[5]。分子标记技术可以在DNA水平上揭示植物的遗传变异, 受外界环境影响小, 是一种稳定可靠的遗传分析方法[6]。随着研究技术的发展, 多种分子标记技术已经普遍运用于植物的遗传多样性分析[7-10]。简单重复序列(simple sequence repeats, SSR) 分子标记技术为共显性标记, 具有重复性好、多态性高、稳定性强等优点, 是常用的遗传标记方法[11], 广泛用于图谱构建、种质资源评价与鉴定、遗传多样性分析、辅助育种等领域[12]。SSR分子标记技术已经成功运用于甘草[13]、党参[14]、黄芪[15]、萱草[16]等多种药用植物的研究中。
因此, 本实验收集了来自于山西、甘肃、河北、陕西、内蒙古等柴胡主产区的62个柴胡栽培和野生居群共619份样本, 利用SSR分子标记对柴胡进行遗传多样性及居群遗传结构分析, 研究不同居群柴胡的遗传多样性水平、遗传分化、变异程度以及居群结构组成, 以期为柴胡种质资源研究及核心种质构建、优良品种选育等提供一定的理论基础。
材料与方法材料 本研究使用62个柴胡居群的619份材料, 其中栽培种质来自于山西、陕西、甘肃、河北以及内蒙古的51个产地, 野生种质采集于山西运城、长治、晋中等地。每个产地均随机选取10株柴胡植株, 用无水乙醇擦拭干净新鲜叶片表面, 晾干后采集叶片放入自封袋中, 带回实验室进行柴胡DNA提取。材料采集详细信息见表 1。材料由乔永刚副教授根据形态鉴定为柴胡属柴胡, 本实验室利用ITS2序列鉴定为柴胡属柴胡。
基因组总DNA提取 采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrime-thylammonium bromide, CTAB) 法[17]对收集来的柴胡叶片进行基因组总DNA的提取。用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性, 用核酸蛋白检测仪检测DNA的质量和浓度。将DNA浓度统一稀释至50 ng·μL-1, 保存于-20 ℃备用。
PCR扩增及产物检测 依据SSR通用性的特征, 搜集文献[18-20]中所报道的柴胡引物信息, 选用35对SSR引物利用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳进行引物多态性筛选, 最终确定18对多态性较好、重复性较高的SSR引物用于实验。筛选出的引物详细信息如表 2所示。在每对引物的前引5′端标记荧光染料, 进行荧光PCR扩增, 将扩增后的荧光产物利用ABI 3730型遗传分析仪进行检测, 使用Genemapper 4.0[21]软件分析扩增片段峰型, 结合分子质量内标进行DNA片段长度计算。普通引物由上海生工生物有限公司合成, 荧光标记引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
SSR数据统计及分析 利用GenAlEx 6.503[22]对18对SSR引物和619份柴胡种质资源的遗传多样性和遗传分化进行分析, 获得遗传多样性指数: 等位基因数(number of aelle, Na)、有效等位基因数(number of effect aelle, Ne)、Shannon's信息指数(Shannon's information index, I)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)、观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、无偏期望杂合度(unbiased expected heterozygosity, uHe) 和遗传多样性指数(gene diversity, H); 利用GenAlEx 6.503进行居群间及居群内分子变异方差检验(AMOVA), 分析居群内和居群间的遗传变异分布, 并进行主坐标分析(PCoA) 来进一步评估和聚类。利用Power Marker[23]软件分析SSR位点的多态性信息含量(polymorphic information content, PIC), 计算柴胡各居群间的Nei's遗传距离, 并基于Nei's遗传距离在MEGA X[24]构建Neighbor-Joining聚类树[25]。利用STRUCTURE V2.3.4[26]软件分析居群遗传结构, 推测最佳群体数目, 其中将群体数目(K) 设为1~10, 每个K值进行模拟运算10次, MCMC值分别设为10 000、100 000次, 将分析结果转入在线网站Structure Harvester (http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/) 进行预测确定最佳居群数[27]。
结果与讨论 1 SSR引物筛选结果根据文献[18-20]中所报道的柴胡引物信息, 选用35对SSR引物利用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳进行引物多态性筛选。使用产地SXYC06、SXLL03、SXYC08、SXJZ04的10个样品混样对引物SSR1~SSR9进行PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测, 电泳结果如图 1A、B所示。引物SSR1~SSR9扩增产物稳定性和多态性良好, 可用于后续实验。
其次用产地SXYC07的10个样品混样对引物SSR10~SSR35进行PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图 2A、B所示。26对引物中共有7对引物没有产生扩增产物或者扩增效果较差, 剩余19对引物进行后续毛细管电泳筛选。将上步筛选出的19对SSR引物对产地SXYC06、SXLL03、SXYC08、SXJZ04的10个柴胡样品混样进行PCR扩增以及利用岛津DNA/RNA分析专用微芯片电泳仪MCE-202 MultiNA进行毛细管电泳分析, 电泳结果在MultiNA Viewer软件中进行可视化处理, 结果如图 3。引物SSR13、SSR16、SSR18、SSR19、SSR20、SSR22、SSR25、SSR26、SSR27电泳结果条带明亮, 扩增产物稳定性及多态性较好, 可用于后续实验。
最终从35对SSR引物中筛选出SSR1~SSR9、SSR13、SSR16、SSR18、SSR19、SSR20、SSR22、SSR25、SSR26、SSR27共18对引物进行实验。将18对SSR引物重新进行命名以便后续数据分析。
2 SSR扩增产物的多态性本实验利用所筛选出的18对引物对619个柴胡个体进行SSR产物扩增, 结果表明, 扩增产物长度在89~385 bp之间, 18对SSR引物扩增出的等位基因数范围是8~54, 共扩增出558个等位基因, 平均每个引物扩增出的等位基因数为31, 引物CH1扩增出的等位基因数最多, 共扩增出54个等位基因, 而引物CH15扩增出的等位基因数最少, 为8个等位基因。
对18对柴胡SSR引物进行遗传多样性分析, 结果如表 3所示, 18对引物中多态性最高的为CH8, 多态性最低的为CH14, 所有引物的多态性信息含量范围为0.228 (CH14)~0.964 (CH8), 平均值为0.791。所有引物的等位基因数的范围为2.532 (CH15)~8.290 (CH9), 平均为5.564; 有效等位基因数的范围为1.351 (CH14)~6.967 (CH1), 平均为4.031; Shannon's信息指数范围为0.408 (CH14)~1.967 (CH8), 平均为1.389; 遗传多样性指数的范围为0.230 (CH14)~0.965 (CH8), 平均为0.804。综合多个指数发现, 18对SSR引物中引物CH14和CH15的多态性较低, 其他引物均含有较高的多态性信息含量。
对不同居群的柴胡材料进行遗传多样性分析, 结果如表 4所示, 不同居群的柴胡等位基因数的范围为4.389~6.833, 平均为5.564; 有效等位基因数范围为3.001~4.959, 平均为4.031; 等位基因数和有效等位基因数的变化表明柴胡居群间存在有等位基因差异, 但遗传差异不大。Shannon's信息指数值最高为1.685, 最低为1.130, 平均为1.389; 观察各居群间的期望杂合度、观测杂合度以及Shannon's信息指数值可知, 不同的柴胡居群的遗传多样性水平较高。且各居群之间的观测杂合度均小于期望杂合度, 且固定指数F均大于0。
对柴胡的62个居群进行遗传分化分析, 结果如表 5所示, 居群内近交系数(Fis) 的范围为-0.038~0.979, 柴胡在引物CH11的居群内近交系数最小, 说明其在引物CH11表现的杂合不足最明显, 而在引物CH8的居群内近交系数最大, 说明其在引物CH8表现的杂合过量最明显, 居群内近交系数的平均值为0.419, 表明柴胡各居群总体表现为杂合子不足。总居群近交系数(Fit) 的范围为0.095 (CH17)~0.981 (CH8), 柴胡各居群的总居群近交系数为0.531, 也同样说明总居群表现为杂合子不足。居群间遗传分化系数(Fst) 的范围为0.099 (CH17)~0.358 (CH15), 柴胡总居群的居群间分化系数为0.182, 表明柴胡遗传分化有81.8%来自居群内, 18.2%来自居群间。基因流(Nm) 的范围为0.447 (CH15)~2.263 (CH17), 柴胡居群总的基因流为1.305 (Nm > 1), 表明柴胡居群间的基因流处于较高的水平。
利用GenAlEx 6.503软件对柴胡62个居群进行分子方差分析(AMOVA), 结果如表 6所示, 62个柴胡居群间的遗传变异率为13%, 居群内的遗传变异率为87%, 居群内的遗传变异率大于居群间的遗传变异率, 说明柴胡的遗传变异主要发生在居群内, 这与遗传分化的分析结果是一致的。
为了进一步研究柴胡不同居群在遗传方面的相似性和进化情况, 将结果进行可视化, 使其清晰明了, 利用GenAlEx 6.503软件依据Nei's遗传距离对柴胡62个居群进行主坐标分析(PCoA)。结果显示对总变异率贡献较多的3个主坐标特征值共为68.37%, 其中第一主坐标占总变异率的50.05%, 第二主坐标占总变异率的11.61%, 第三主坐标解释了总变异率的6.71%。根据结果绘制二维坐标图, 如图 4所示, 柴胡62个居群被分为3大类, 第一类为图中标记为红色的柴胡居群, 主要由来自山西各地的野生柴胡居群组成; 第二类由标记为绿色的16个柴胡居群组成, 主要来自山西运城、河北、陕西、辽宁等地; 剩下的34个标记为蓝色的柴胡居群组成第三类, 主要来自山西长治、山西大同、甘肃等地。
使用STRUCTURE V2.3.4软件对柴胡62个居群的遗传结构进行分析, 将分组数K值的范围设为1~10, 对每个K值进行10次重复模拟运算, 并且绘制K值与ΔK的关系图。STRUCTURE软件是基于贝叶斯模型进行群体结构的分析, 当ΔK值达到最大时的K值即为模拟最佳的群体数。如图 5A所示, 当ΔK最大时(ΔK = 533.066), K = 2, 表明可以将62个柴胡居群分为2组, 分组结果如图 5B所示, 第一组主要包括来自山西长治、山西大同、甘肃、内蒙古等地的34个栽培居群, 其组成与主坐标分析中分为第三类的居群相同。第二组则主要由来自山西运城、河北、陕西、辽宁的栽培柴胡居群以及收集于山西各地的野生柴胡居群组成, 第二组包括主坐标分析中的第一类和第二类居群。由上说明, STRUCTURE软件的群体预测结果与主坐标分析的结果一致。
使用MEGA X软件基于不同居群间的Nei's遗传距离对柴胡62个居群构建NJ树, 结果如图 6所示, 62个柴胡居群被分为3类, 第一类由来自山西各地的野生柴胡居群以及来自河北的4个栽培居群组成, 第二类由来自山西晋中、运城、大同和甘肃陇西的6个栽培居群组成, 剩下的42个柴胡栽培居群聚为第三类。
遗传多样性是评价生物多样性的一个重要部分, 也是造成生物多样性的基础原因。广义的遗传多样性是指所有生物中所包含遗传信息的总和, 而狭义的遗传多样性是指物种之间存在的遗传变异, 即种内的不同居群之间或者居群内不同的个体之间的遗传变异[28]。丰富的遗传多样性是物种适应环境变化的物质基础, 物种为了适应环境的变化而发生进化, 遗传变异就产生在进化的过程中, 变异的丰度越大, 物种的遗传多样性越高, 则说明物种适应环境的能力越强[29]。遗传多样性可以通过形态学特征、生化特征、分子标记等方法进行研究, 而随着分子标记技术的发展, 其在种群遗传多样性研究、物种鉴定以及物种起源等方面得到了广泛的应用[30, 31]。
对柴胡种质资源进行遗传多样性研究, 可以为开发利用以及保护柴胡资源提供理论依据。前人曾利用不同的分子标记对多种药用植物进行了遗传多样性分析。Song等[32]利用简单序列间重复(ISSR)、序列相关扩增多态性(SRAP) 相结合的方法研究发现博落回具有较高的遗传多样性, 群体内遗传多样性水平最高的前两个群体为云南孟连和云南芒市, 其个体可作为种质筛选和保存过程中的优良种质候选。朱巧等[33]利用49对SSR分子标记探讨了黄精属6种植物的遗传多样性和群体结构, 4个地区来源群体间的遗传多样性指数从大到小依次为西部地区 > 华中地区 > 华南地区 > 华东地区。分子标记技术在柴胡种质资源研究方面的应用也很广泛, 战晴晴等[18]经多态性筛选, 获得28条ISSR和14对SSR多态性引物并构建柴胡遗传图谱。吴素瑞等[19]以2个柴胡选育品系和4份其他柴胡栽培种质为材料, 筛选扩增效果好、多态性高的SSR引物并依据遗传距离构建聚类树图。但利用SSR对柴胡居群的遗传多样性进行研究还未有报道。
多态性信息含量是反映分子标记能力的一个重要参数, 如果该标记的PIC值> 0.5, 则该标记被认为是高度多态的, 如果PIC值在0.25~0.5之间, 则该标记具有中度多态性, 如果PIC值< 0.25, 则该标记为低度多态性标记[34]。本实验中所选取的18对SSR引物中, CH14的PIC值为0.228, 为低多态性引物, CH15的PIC值为0.476, 为中多态性引物, 剩余16对SSR引物的PIC值均大于0.5, 具有高度多态性, 说明可以用于柴胡遗传多样性的研究。
本实验利用18对SSR引物对来自不同省份的62个柴胡居群共619个样本进行遗传多样性分析, 结果得出柴胡居群具有丰富的遗传多样性, 说明柴胡在进化的过程中发生了复杂的遗传变异。野生柴胡居群均具有较高的遗传多样性, 对柴胡的种质资源保护和利用有重要的价值, 应当加强对野生柴胡种质资源研究, 减少无科学依据的人为采挖, 优化野生柴胡的生境条件, 同时对野生资源进行科学的移栽驯化, 从中培育优良种质, 提高柴胡药材质量。
物种的群体遗传结构与物种的起源进化、自然分布等有很大关系, 对研究物种之间的进化关系有很大帮助[35]。主坐标分析将62个柴胡居群分为3类, 其中一类主要由来自山西各地的野生柴胡居群组成。以及通过STRUCTURE软件对柴胡群体结构进行预测得到的群体最佳分组数K为2, 第一组组成与主坐标分析中分为第三类的居群相同。第二组则包括主坐标分析中的第一类收集于山西各地的野生柴胡居群和第二类的栽培柴胡居群。而基于Nei's遗传距离对柴胡62个居群构建的NJ树也将来自山西各地的野生柴胡居群聚为一类。来自山西、河北、甘肃等地的柴胡栽培居群聚在一起反映柴胡主产地相互之间种子交易频繁, 相互引种现象较为普遍。以上结果表明SSR分子标记可以将来自山西相同地区的柴胡栽培居群和野生居群明显的分类, 说明野生柴胡居群和栽培柴胡居群的遗传背景不同, 柴胡野生居群遗传多样性比柴胡栽培居群高, 具有丰富的遗传变异, 适应环境变化的能力强于栽培居群, 具有较高的进化潜力; 且山西省为柴胡的道地产区, 野生柴胡药材质量好, 有效成分含量较高, 山西野生柴胡资源单独分类对更好地利用柴胡资源, 进行核心种质研究有重要意义, 后续可将野生柴胡居群作为优良种质的候选, 进行引种驯化, 使其在保持较高的遗传多样性和适应环境变化能力的同时, 提高柴胡药材产量。
作者贡献: 宋芸负责主要实验操作、部分实验设计; 张鑫瑞负责部分实验实施、数据分析和文献检索; 李政、孙哲、李澳旋、杜晓蓉负责样品采集、参与数据统计分析; 乔永刚负责实验设计、结果分析、论文撰写与修改。
利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。
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