2. 北京大学, 天然药物及仿生药物国家重点实验室, 北京 100191;
3. 河北大学, 药物化学与分子诊断教育部重点实验室, 河北 保定 071002
2. State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, Beijing 100191, China;
3. Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry of Education, Hebei University, Baoding 071002, China
靛红即二氢吲哚-2, 3-二酮, 在多种植物中广泛分布, 是一类重要的氮杂环化合物[1]。其衍生物具有多种生物活性, 在抗肿瘤、抗病毒、神经保护等方面具有重要的意义, 其中最突出的作用是抗肿瘤活性[2, 3]。最近几年研究表明, 靛红衍生物在体内体外均具有良好的抗肿瘤活性, Fares等[4]将靛红与喹唑啉结构进行杂合, 制备了一系列新颖的靛红衍生物, 实验结果表明化合物1具有较强的体外抗肿瘤活性。Solomon等[5]将靛红与苯并噻唑进行缀合, 合成了新型的希夫碱类衍生物2, 对人体的乳腺癌细胞具有一定程度的抑制活性。Eldehna等[6]利用药效团杂合的原理, 将靛红与吡啶基团进行杂合得到化合物3, 对肿瘤细胞也有一定的细胞毒活性。有些靛红衍生物已经用于临床, 例如辉瑞制药研发的多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(sunitinib) 于2006年被FDA批准上市, 用于治疗晚期肾细胞癌等疾病; 勃林格殷格翰公司研发的三联血管生成抑制剂尼达尼布(nintedanib) 于2014年11月在德国获批上市, 用于治疗特定类型的晚期肺癌。因此, 设计以不同片段修饰的靛红衍生物, 合成了具有代表性的抗肿瘤化合物, 具体结构如图 1所示[7]。
棕榈酰化修饰是一种广泛存在并且可逆的蛋白质翻译后脂质修饰, 对蛋白质的定位、扩散和稳定性的动态调控至关重要。多种癌细胞的增殖、迁移和侵袭都依赖于癌症相关蛋白的棕榈酰化, 大量数据证明, 与正常细胞比较, 在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌和前列腺癌中DHHC20表达水平均上调[8]。人类棕榈酰基转移酶家族的23个成员多数都参与肿瘤的调节, 使得靶向棕榈酰基转移酶成为潜在的肿瘤治疗策略。Ducker等[9]发现了5个棕榈酰基转移酶抑制剂, 其结构如图 2所示。Jennings等[10]对5个化合物进行的棕榈酰基转移酶抑制活性实验显示, 所有化合物对棕榈酰基转移酶均有不同程度的抑制作用, 其中化合物Ⅴ的抑制作用最强。进一步的作用机制研究显示, 化合物Ⅴ对酶的抑制作用是可逆的, 且安全性更高。分子对接分析其与棕榈酰基转移酶的作用方式, 发现这5个化合物均可进入3'-磷酸腺苷-5'-二磷酸(PAP) 结合位点, Ⅰ、Ⅲ仅与His155有氢键作用; Ⅱ仅与Ser143有氢键作用; Ⅳ仅与His154有π-π共轭作用; Ⅴ与Lys135、His140、His141、Ser143有氢键作用且打分值最高, 同时也与PAP作用方式更为接近, 因此, 以化合物Ⅴ的结构为基础, 通过生物电子等排的方法将苯并氢化噻吩酮骨架替换成靛红结构, 并围绕此结构进行修饰, 有可能寻找到特异性更好、抑制作用可逆的棕榈酰基转移酶抑制剂。
2018年Rana等[11]报道了棕榈酰基转移酶的结构, 其蛋白晶体结构(PDB ID: 6BML) 中的配体小分子PAP所处的活性口袋是棕榈酰CoA的结合位点。本项目以配体小分子PAP所处的口袋作为活性位点, 利用生物电子等排理论, 将化合物Ⅴ的苯并氢化噻吩酮骨架替换为生物电子等排体靛红, 根据PAP的结构及其与氨基酸残基的相互作用特点, 在靛红的1位引入碱性基团二级胺结构; PAP所在口袋含有多种极性氨基酸(如组氨酸、丝氨酸、精氨酸等), 氨基硫脲带有1个硫原子和3个氮原子, 可以与周围的氨基酸残基形成良好的相互作用, 如氢键、p-π共轭等, 分子对接结果也进一步验证了这一猜想: 3位引入氨基硫脲结构可以增加与PAP结合位点Ser143、His141等极性氨基酸的相互作用。再在此结构基础上利用分子对接对其进行结构优化, 将3位氨基硫脲的部分结构环化形成噻唑烷酮, 增加的羰基氧原子还可以和PAP结合位点的氨基酸残基形成氢键, 增强与靶蛋白的相互作用, 设计了的靛红衍生物类棕榈酰基转移酶抑制剂。结构如图 3所示。
目标化合物4a~4h、5a~5d的合成路线如图 4所示。中间体2、3的合成采用文献报道的方法进行[12, 13]。以靛红为原料, 在碱性条件下, 分别与1, 2-二溴乙烷、1, 3-二溴丙烷或1, 4-二溴丁烷发生取代反应, 得到中间产物2; 再在碱性条件下引入吗啉环等二级胺得到中间产物3; 中间产物3与氨基硫脲经过缩合反应得到目标化合物4; 化合物4与2-溴乙酸乙酯在碱性条件下环合生成化合物5。目标化合物4a~4h、5a~5d的结构经1H NMR、13C NMR和HR-MS进行了确证, 其收率、性状、熔点及波谱数据见表 1。
本部分实验以顺铂为阳性对照药物, 选取MGC-803、HeLa、MCF-7、RBL-2H3和L-929细胞对目标化合物进行细胞毒性实验, 结果见表 2。抗增殖结果表明, 目标化合物对所测试的细胞具有不同程度的抑制活性, 其中化合物5a、5b对MCF-7细胞表现出较好的抗增殖活性, IC50值分别为15.2和12.0 μmol·L-1; 化合物4b、4d、5b对HeLa细胞表现出较好的抑制活性, IC50值分别为8.1、14.7和12.6 μmol·L-1; 化合物4f对L-929细胞体现出一定程度的毒性, 其IC50值为11.5 μmol·L-1, 遗憾的是目标化合物对RBL-2H3细胞的抑制活性都比较差。目标化合物中5b对MCF-7细胞抑制活性最好, 其IC50为12.0 μmol·L-1, 与阳性对照相当。它对棕榈酰基转移酶高表达的癌细胞具有较好的活性, 因此具有成为棕榈酰基转移酶抑制剂先导化合物的潜质。
本实验选择化合物5b来评估它对MCF-7癌细胞的影响, 如图 5所示。由图可知, 在30 μmol·L-1浓度下, 化合物5b能明显引起视野内MCF-7癌细胞的减少, 一定程度上促进其凋亡, 且化合物5b的对MCF-7细胞的IC50为12.0 μmol·L-1, 其结果与抗增殖活性结果一致。
在抗增殖活性实验中, 化合物5b表现出较好的抗癌活性, 故本实验选择化合物5b来评估其对MCF-7癌细胞迁移的影响, 如图 6所示。与阴性对照相比, 化合物5b在15 μmol·L-1浓度下能明显抑制MCF-7癌细胞的迁移, 并且相同浓度下化合物5b对MCF-7细胞的抑制作用比顺铂效果好, 与实验预期的结果一致。
目标化合物的分子对接结果如表 3、图 7所示。由表中数据可知, 化合物均能进入PAP活性口袋内, 并且能与周围氨基酸残基产生相互作用力。从图 7可知, 化合物4b靛红结构上的羰基、侧链取代基上的两个氨基都可与氨基酸残基Ser143形成氢键, 将其线性结构进一步改造成环时, 化合物5b母核结构上的羰基保持着与氨基酸残基Ser143的氢键作用, 并且其噻唑烷酮结构上的硫原子可与氨基酸残基His141形成氢键, 羰基可与Lys135形成氢键。与化合物4b相比, 化合物5b与6BML的相互作用和PAP与6BML的相互作用(PAP与氨基酸残基His141、Lys135、Ser143等形成氢键) 更加吻合, 这可能是化合物5b对MCF-7细胞的抗增殖活性强于化合物4b的原因。
基于化合物Ⅴ的化学结构, 利用生物电子等排体原理, 结合分子对接技术设计合成了12个靛红衍生物类棕榈酰基转移酶抑制剂, 测定了其体外抗肿瘤活性并进行了分子对接研究。采用MTT法对该类化合物进行抗肿瘤活性测试, 结果表明, 大部分化合物具有中等的抗肿瘤活性, 其中化合物5b对MCF-7的IC50值小于15 μmol·L-1, 和顺铂抑制活性相当。细胞划痕实验表明, 在15 μmol·L-1浓度下, 化合物5b能明显抑制MCF-7癌细胞的迁移。AO/EB染色实验表明, 化合物5b的浓度为30 μmol·L-1时能显著引起MCF-7癌细胞的凋亡。分子对接结果表明, 化合物均能完全进入PAP活性口袋内, 且生物活性结果越好的化合物, 其作用方式与配体PAP与棕榈酰基转移酶的相互作用方式越吻合, 这为后续研究设计更高效的棕榈酰基转移酶抑制剂提供了思路。
实验部分SGW X-4显微熔点仪(上海精密仪器科技有限公司, 未校正); Bruker AVIII-600 MHz核磁共振波谱仪(Bruker); QEXACTIVE高分辨质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific); LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器厂); W-CJ-ZDF型超净台(上海贺德实验设备厂); 其他试剂和溶剂未经特别说明均为国产或进口分析纯与生物级, 无水试剂均按常规方法处理。
1 化合物合成 1.1 N-(2-溴乙基) 靛红(2)向250 mL圆底烧瓶中加入7.36 g (50 mmol) 化合物1, 用50 mL的N, N-二甲基甲酰胺溶解后, 加入8.29 g (60 mmol) K2CO3, 室温搅拌10 min, 再加入60 mmol 1, 2-二溴乙烷(1, 3-二溴丙烷或1, 4-二溴丁烷), 室温反应, TLC监测反应进程[12]。反应完全后向反应液里倒入100 mL水, 静置过夜, 析出沉淀, 抽滤得粗品。粗品用200目硅胶色谱[V (乙酸乙酯)∶V (石油醚) = 1∶5] 纯化得化合物2。收率54%~75%。
1.2 N-(4-吗啉乙基) 靛红(3)将5 mmol化合物2、6 mmol Na2CO3和6 mmol二级胺置于50 mL圆底烧瓶中, 加入10 mL无水乙腈, 室温反应, TLC监测反应进程[13]。反应完全后抽滤除去固体, 滤液减压蒸馏, 除去溶剂得粗品。粗品用200目硅胶色谱[V (乙酸乙酯)∶V(石油醚) = 1∶2] 纯化得化合物3。产率60%~65%。
1.3 N-(4-吗啉乙基) 靛红-3-缩氨基硫脲(4a)将1 mmol化合物3、1 mmol氨基硫脲置于25 mL圆底烧瓶中, 加入5 mL无水乙醇溶解, 搅拌下滴加5滴冰醋酸, 滴加完毕后升温至80 ℃反应, TLC监测反应进程。反应完全后趁热过滤, 热乙醇洗涤, 得粗品。粗品用200目硅胶色谱[V (二氯甲烷)∶V (甲醇) = 100∶1] 纯化得化合物4a。化合物4b~4h参照此法合成, 收率60%~90%。
1.4 2-(N-(4-吗啉乙基) 靛红-3-二亚甲基肼) 噻唑烷-4-酮(5a)向25 mL圆底烧瓶中加入0.5 mmol化合物4、0.5 mmol无水乙酸钠、5 mL甲醇, 搅拌下滴加0.6 mmol溴乙酸乙酯, 室温反应, TLC监测反应进程, 反应结束后将反应体系倒入冰水中, 二氯甲烷萃取3次, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥后回收溶剂, 经200目硅胶色谱[V (二氯甲烷)∶V (甲醇) = 100∶1] 纯化得化合物5a。化合物5b~5d参照此法合成, 收率60%~80%。
2 化合物活性评价 2.1 体外抗增殖活性采用MTT法进行体外抗增殖活性研究[14, 15]。选取人胃癌细胞(MGC-803)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7) 和大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3) 4种肿瘤细胞进行抗肿瘤活性实验和小鼠成纤维细胞(L-929) 对目标化合物进行细胞毒性实验。将细胞悬液(每毫升4×104个) 接种到96孔板中, 每孔90 μL。在37 ℃、CO2相对浓度为5%、相对湿度为95%的培养箱中培养, 当显微镜观察到细胞单层铺满96孔板底部时, 每孔加入10 μL的不同浓度的化合物。将96孔板放置于培养箱中, 显微镜观察细胞形态, 培养48 h后, 每孔加入10 μL浓度为5 mg·mL-1的MTT的PBS溶液(现配现用, 避光), 继续培养4 h。4 h后, 弃掉96孔板内的培养基, 每孔加入100 μL的DMSO后, 置于摇床轻摇20 min使结晶充分溶解。待结晶溶解, 把96孔板放置在酶标仪上, 设置波长为490 nm, 测定吸光度, 重复测定4次。使用软件GraphPad Prism 8.3计算每个化合物的IC50值。
2.2 AO/EB染色实验将细胞悬液接种到12孔板中, 每孔900 μL。将12孔板置于CO2恒温培养箱中, 37 ℃、CO2相对浓度为5%、相对湿度为95%的条件下培养细胞。12 h后每孔加入100 μL不同浓度的化合物, 孵育48 h。弃掉上层培养基, PBS清洗细胞2次, 使用1×Buffer重悬细胞。避光, 加入等量混合均匀的AO/EB染色液, 轻轻混合均匀后室温孵育5 min, 使用荧光倒置显微镜观察拍照[16]。
2.3 划痕实验将6孔板置于CO2恒温培养箱中, 37 ℃、CO2相对浓度为5%、相对湿度为95%的条件下培养细胞。直至观察细胞密度达到90%左右后。事先用Marker笔在6孔板底部均匀的划3条平行直线, 用200 μL枪头在与标记线垂直的地方划3条平行线, 划后除去培养基, 用PBS清洗3次, 加入无血清培养基和药物(空白组加入DMSO)。将其放入37 ℃、CO2相对浓度为5%、相对湿度为95%的培养箱中, 按0、12、24、48 h观察结果并拍照。
3 分子对接研究分子对接使用Maestro 11.9版本的Schrödinger Suite软件。选取DHHC20晶体结构(Protein Data Bank, ID: 6BML) 作为受体, 与目标化合物进行分子对接研究。首先利用Schrödinger Suite软件中的LigPrep模块对目标化合物进行准备优化; 然后, 利用Schrödinger Suite软件中的Protein Preparation Wizard模块对受体蛋白进行能量优化、修复丢失的氨基酸残基和loop区、加氢、删除水分子; 再利用Schrödinger Suite软件中的Glide模块进行受体格点设置; 最后, 利用Glide模块中的Ligand Docking工具进行Glide-XP模式的分子对接。选取打分值最高的构象用PyMoL软件(http://www.pymol.org/) 进行作图[17]。
作者贡献: 余伟、董金娇、朱昕悦、宋亚丽负责化合物的设计合成、活性研究及稿件撰写与修改, 杨侃、刘振明和乔晓强参与化合物的合成及分子对接分析。
利益冲突: 本文作者声明无任何利益冲突。
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