药学学报  2022, Vol. 57 Issue (4): 1054-1062     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1632   PDF    
烟碱型乙酰胆碱受体α3[K152E, E184D, Q195T]β4突变型的构建及其功能研究
陈舒苗1, 于津鹏2, 张笑凡1, 朱晓鹏2, 罗素兰1,2, 长孙东亭1     
1. 海南大学药学院, 海南大学热带生物资源教育部重点实验室, 海南 海口 570228;
2. 广西大学医学院, 广西 南宁 530004
摘要: α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs) 是成瘾、癌症和肥胖等重要疾病的潜在新靶点。本研究对大鼠(rat, r) α3β4 nAChRs的α3亚基上的3个氨基酸位点同时进行突变, 将这3个位点分别突变为rα6亚基上与α3亚基上相对应的氨基酸种类, 构建α3[K152E, E184D, Q195T]β4三点突变型受体, 并研究其功能。利用PCR介导的定点突变方法构建了α3[K152E, E184D, Q195T] 三点突变体载体, 体外转录获得相应的cRNA, 与野生型β4亚基的cRNA按相同比例注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行重组表达, 然后用双电极电压钳技术检测其受体活性和功能。测定α3β4 nAChRs野生型和突变型在乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱3种不同激动剂的诱导下, 其配体门控电流的大小以及门控特征, 比较野生型和突变型受体之间的功能差异。α3[K152E, E184D, Q195T] 三点突变体的功能与野生型相比存在显著差异。乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱对α3β4 nAChR野生型的半数最大效应浓度(EC50) 分别为277.5、34.02和23.05 µmol·L-1; 针对三点突变体, 3种激动剂的EC50分别为170.5、26.6和98.45 µmol·L-1。3种激动剂对突变体的EC50与野生型受体的EC50相比, 其活性变化分别为0.6、0.8和4.3倍。其中突变型受体对金雀花碱的活性影响最显著, 其激动剂活性下降了77%。此外, 与1 mmol·L-1乙酰胆碱诱导的峰值电流幅度相比, 金雀花碱对野生型和突变型α3β4 nAChRs的最大激动效率(Emax) 从94.12%提升至155.08%。α3[K152E, E184D, Q195T]β4三点突变型明显降低了对金雀花碱的敏感性, 但其最大激动电流幅度明显变大。三点突变型略微增强了对乙酰胆碱和尼古丁的敏感性, 说明α3亚基上的这3个氨基酸对α3β4 nAChRs的配体结合功能影响较大, 对不同激动剂的影响情况各异, 这为今后探究α3β4 nAChRs重要受体的精细结构和功能以及相关疾病的发病机制研究提供了很好的线索。
关键词: PCR介导定点诱变    α3β4烟碱型乙酰胆碱受体突变型    电生理学功能研究    激动剂    通道开放分子机制    
Construction and functional evaluation of an α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nicotinic acetylcholine receptor mutant
CHEN Shu-miao1, YU Jin-peng2, ZHANG Xiao-fan1, ZHU Xiao-peng2, LUO Su-lan1,2, ZHANGSUN Dong-ting1     
1. Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, School of Pharmaceutical Sciences, Hainan University, Haikou 570228, China;
2. Medical College, Guangxi University, Nanning 530004, China
Abstract: α3β4 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are potential therapeutic targets in diseases such as addiction, cancer, and obesity. In this study, by replacing three amino acids of the α3 subunit with the corresponding positions of the rα6 subunit simultaneously, an α3[K152E, E184D, Q195T] subunit mutant was constructed by PCR-mediated site-directed mutagenesis and its cRNA was obtained by in vitro transcription. The cRNA of mutant subunits mixed in equal molar ratios with β4 subunits were microinjected into Xenopus oocytes. The pharmacological activity and function of α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nAChR was evaluated by a two-electrode voltage clamp electrophysiological technique. Acetylcholine, nicotine, and cytisine were used as agonists to evaluate the magnitude of ligand-gated currents and gating characteristics of wild-type and mutant α3β4 nAChRs. The half-maximal effective concentrations (EC50) of acetylcholine, nicotine, and cytisine on wild-type α3β4 nAChRs were 277.5, 34.02 and 23.05 µmol·L-1, respectively, while their EC50 values with α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nAChR were 170.5, 26.6, and 98.45 µmol·L-1, respectively. Thus these EC50 values for the three agonists towards the mutant receptor were changed 0.6-fold, 0.8-fold, and 4.3-fold, respectively, compared with the wild-type receptor; cytisine was most strongly affected, with a 77% decrease in potency. However, the maximum agonistic efficiency (Emax) of cytisine on wild-type and mutant α3β4 nAChRs was increased from 94.12% to 155.08% relative to the peak current amplitude induced by 1 mmol·L-1 acetylcholine. Thus, although the α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nAChR had significantly reduced sensitivity to cytisine, the maximum current amplitude induced by cytisine was clearly increased. This mutant had slightly increased sensitivity to acetylcholine and nicotine. The results indicate that these three amino acids of the α3 subunit have important and varying effects on ligand binding to the α3β4 nAChR, providing a basis for further structure-functional research on α3β4 nAChR, as well as the pathology of related diseases.
Key words: PCR mediated site-directed mutation    the mutant of α3β4 nicotinic acetylcholine receptor    electrophysiological evaluation    agonist    molecular mechanism of channel opening    

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs) 广泛分布于中枢和外周神经系统, 属于五聚体跨膜配体门控离子通道型膜蛋白, 存在于哺乳动物身体的各个组织器官和体液中, 发挥着极其重要的生理功能[1, 2]。nAChRs激活多种神经递质的释放, 包括多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸和乙酰胆碱等; 介导众多中枢和外周神经系统的生理功能, 包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs因此而成为筛选、诊断和治疗很多重要疾病药物的关键靶点, 包括疼痛、成瘾、抑郁、帕金森症、痴呆、智障、癫痫、精神病、癌症、重症肌无力和前列腺肥大等疑难杂症。

nAChRs的结构和功能异常复杂, 由很多亚型组成。至今已发现用于构成哺乳动物nAChRs的亚基共16种: 9种α亚基(α1~α7、α9、α10)、4种β亚基(β1~β4) 以及γδε亚基[3]。根据组成方式的不同, nAChRs可分为由同一种亚基组成的同源五聚体[如(α7)5], 以及由至少两种不同亚基组成的异源五聚体[如肌肉型(α1)2β1δε、(α3)3(β4)2和(α3)2(β4)3等], nAChRs的每个亚基均含有4个约由20个氨基酸构成的疏水跨膜区(M1~M4, 呈α-螺旋结构), 以及位于胞外的N端和C端结构域。nAChRs的N端胞外区负责配体的识别与结合, 对受体的功能起着关键作用。

nAChRs各个亚型的结构非常相似, 但却发挥着截然不同的药理学功能, 至今各个亚型的精细结构和生理病理学功能尚不清楚, 严重阻碍了各种nAChRs亚型在相关疾病发病机制的研究以及新型治疗药物的开发进程。nAChRs受体上某个或某些氨基酸的突变, 往往导致离子通道配体门控活性的改变, 从而诱发离子通道功能异常相关疾病。因此, 研究清楚特定氨基酸对nAChRs功能活性的影响和作用, 对某种亚型的结构和功能之间的关系阐明具有非常重要的意义[4]

研究发现, α3β4 nAChR亚型与成瘾[1, 5]、小细胞肺癌、宫颈癌和肺癌等癌症[6-8]以及与食欲控制有关的肥胖[9]等重要疾病密切相关, 是这些疑难杂症的潜在新靶点。nAChRs αβ亚基α的胞外配体结合区(ligand binding domain, LBD) 是配体结合的主要区域[10]。鼠源α3和α6亚基的LBD具有较高的同源性(~67%), 是配体难于区分两种亚型的主要原因。β4亚基参与组成α3β4和α6β4两种亚型, 如何发现配体区分两种亚型的药理机制, 确定配体结合的关键位点, 是针对两种亚型进行分子设计的关键。为了确定α亚基上的这些关键位点, Azam等[11, 12]设计并制备了一系列α6→α3亚基LBD的单点置换突变体, 并利用电生理技术评估了特异性配体芋螺毒素与受体结合的活性变化。结果显示, α6亚基上第152、184、195位氨基酸的单点突变, 会显著降低α-芋螺毒素[S4A, E11A, L15A]MII和[N11R]PeIA对α6β2β3 nAChR亚型的阻断作用。单个氨基酸的改变使α-芋螺毒素[S4A, E11A, L15A]MII对α6β2β3 nAChR的活性下降了近90%, 而将3个氨基酸位点同时改变后, α-芋螺毒素[S4A, E11A, L15A]MII对该受体的活性几乎丧失。单个氨基酸的改变影响了拮抗剂芋螺毒素与受体的结合活性, 3个位点同时改变则起到了协同作用, 影响着拮抗剂α-芋螺毒素[S4A, E11A, L15A]MII与受体的结合活性。3个位点的改变是否会影响激动剂对受体功能的调控, 尚未见有相关研究报道。本研究通过对大鼠(rat, r) α3β4 nAChR亚型的α3亚基上胞外区的3个氨基酸位点同时进行突变, 将这3个位点分别突变为与之最相近的α6亚基上相对应的氨基酸种类, 构建α3[K152E, E184D, Q195T]β4三点突变型受体, 并研究其激动剂门控功能。期望获知α3亚基上这些特定氨基酸对α3β4受体功能的作用和影响情况, 为今后探究α3β4 nAChRs这个重要亚型的精细结构和生理功能以及阐明与之相关疾病的发病机制, 提供有益的线索和研究基础。α3β4 nAChRs的结构图如图 1所示[12, 13]

Figure 1 Structures of the α3β4 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR). A: Cryo-EM structures of the α3β4 nAChR in lipidic and detergent environment; B: Homology binding model of α-conotoxin to α3β2 nAChR, and the residues shown in blue are Glu184 and Gln195 of the C-loop, and Lys152 of the B-loop, shown as a stick model
材料与方法

实验材料、试剂与仪器  含有rα3、rβ4 nAChRs亚基基因的质粒克隆, 由美国Salk生物研究所的Stephen F. Heinemann教授提供。实验用雌性非洲爪蟾(Xenopus laevis) 购自美国Nasco公司, 在实验室17 ℃环境下饲养1个月以上。饲养用水经过滤、沉淀处理。ND-96缓冲液组成为96 mmol·L-1 NaCl、2.0 mmol·L-1 KCl、1.0 mmol·L-1 MgCl2·6H2O、1.8 mmol·L-1 CaCl2·2H2O、5 mmol·L-1 HEPES, pH 7.5。OR-2缓冲液组成为82.5 mmol·L-1 NaCl、2.0 mmol·L-1 KCl、1.0 mmol·L-1 MgCl2·6H2O、5 mmol·L-1 HEPES, pH 7.5。

大肠杆菌DH5α感受态细胞、质粒小量提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司); 乙酰胆碱、胶原酶A、阿托品(美国Merck公司); 金雀花碱(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); DNA片段纯化试剂盒MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 [宝日医生物技术(北京) 有限公司]; DNA体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit、RNA纯化试剂盒MEGA Clear Kit (美国Thermo Fisher Scientific公司); Q5超保真聚合酶、质粒线性化所需的限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ、Dpn Ⅰ、DL 15000 DNA Marker (宝日医工程大连有限公司); DNA marker Ⅳ [天根生化科技(北京) 有限公司]; Ampicillin (北京索莱宝科技有限公司); HEPES、BSA [生工生物工程(上海) 有限公司]; 其他生物试剂均为国产分析纯。突变所需引物由生工生物工程(上海) 有限公司合成。主要仪器包括: Digidata 1550B数模转换器、Axon 900A放大器(美国Molecular Devices公司); Nanodrop微量分光光度计(美国ThermoFisher公司); 小型水平电泳系统(美国Bio-Rad公司); FluorChem E凝胶成像分析系统(美国ProteinSimple公司); PCR仪(德国Eppendorf公司); KCL-2000A恒温恒湿培养箱(日本EYELA公司)。

突变体引物的设计  对比rα3和rα6亚基的胞外N-端配体结合区域(ligand binding domain, LBD) 的氨基酸序列(图 2), 确定对应位点氨基酸的差异。α3和α6亚基的氨基酸序列同源性最高, 相似度最大, 极难区分。图 2有差异的氨基酸位置用粉红色高亮显示。根据编码拟突变位点氨基酸的密码子信息, 采用Primer Premier 5.0软件, 设计制备α3亚基点突变体的上下游引物(表 1)。采用分步突变的方法, 将α3亚基胞外N-端LBD区第152位的赖氨酸(lysine, Lys)、第184位的谷氨酸(glutamic acid, Glu)、第195位的谷氨酰胺(glutamine, Gln) 按顺序突变为α6亚基上的对应氨基酸残基, 构建α3[K152E, E184D, Q195T] 三点突变体亚基的质粒载体。

Figure 2 The amino acid sequence comparison of ligand binding domain between rat (r)α3 and α6 nAChR subunits

Table 1 The primer sequences for mutations at position 152, 184 and 195 of α3 nAChR subunit

PCR介导的定点突变  以包含α3亚基序列的质粒为模板, 对α3亚基上第152位氨基酸进行定点突变, 突变引物序列见表 1。在PCR反应体系中, 依次加入模板100 ng, 正向引物125 ng, 反向引物125 ng, Q5聚合酶预混液(2× mix) 25 µL, 最后用超纯水(ddH2O) 补足至总体积50 µL。PCR反应条件为: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性20 s, 60 ℃退火10 s, 68 ℃延伸3 min, 18个循环; 末次循环68 ℃再延伸5 min。反应结束后, 向反应体系中加入1 µL Dpn Ⅰ, 37 ℃反应2 h, 以去除甲基化模板。将PCR产物转入DH5α感受态细胞后, 涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上, 37 ℃培养14~16 h, 选取单克隆菌落, 提取质粒并送生工生物工程(上海) 有限公司测序, 确定目标位点是否突变正确。三点突变亚基的质粒通过DNA测序验证无误后, 进行后续实验。

以测序正确的、包含α3[K152E] 单点突变亚基的质粒为模板, 使用上述方法按顺序分别对第184和195位的氨基酸差异位点进行突变, 最终获得包含α3[K152E, E184D, Q195T] 三点突变亚基的重组质粒。大量培养含三点突变亚基的重组菌, 扩增目的质粒并提取纯化, 然后用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测目的质粒的浓度和纯度。

α3[K152E, E184D, Q195T]三点突变亚基cRNA (体外转录的mRNA)的制备  使用限制性内切酶EcoR Ⅰ切割α3[K152E, E184D, Q195T] 突变体亚基质粒, 使其线性化, 用试剂盒MiniBEST DNA Fragment Purification Kit回收线性化产物。然后用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度后, 用作体外转录的线性化DNA模板。根据试剂盒mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit说明书, 构建20 μL体外转录反应体系: 模板(1~1.5) µg, 10× Reaction Buffer 2 µL, 2× dNTP 10 µL, Enzyme Mix 2 µL, 用ddH2O补足至总体积20 μL。37 ℃恒温条件下反应6 h后, 向转录产物加入2 µL Turbo DNase, 继续反应60 min水解质粒模板。体外转录合成的终产物cRNA, 经MEGA Clear Kit纯化后, 利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测cRNA的浓度和纯度。将制备好的cRNA分装成小份, 并于-70 ℃保存待用。用类似的方法, 制备了α3、β4亚基的cRNA。

非洲爪蟾卵母细胞的分离和显微注射  选取性成熟的非洲爪蟾, 冰浴麻醉60 min, 待其完全麻醉后做手术, 在其下腹部一侧距中线1~2 cm处切开, 小心取出部分成团卵母细胞, 然后缝好伤口让其静养。将成团卵母细胞剪成小团块, 置于OR-2溶液中冲洗至澄清, 随后转入含0.5 g·L-1胶原酶的OR-2溶液中, 于室温下100 r·min-1振荡消化约20~40 min, 直至大部分呈单个分离细胞状态, 使用OR-2溶液洗去酶液。在显微镜下挑选状态良好、动植物极分明的卵母细胞进行显微注射。野生型或突变型α3分别与β4亚基的cRNA按照1∶1的质量进行混合, 混匀后注射到非洲爪蟾卵母细胞质中, 每个卵母细胞注射55.2 nL cRNA混合液。

α3β4 nAChRs野生型及其三点突变型的表达与电生理学检测  将注射后的卵母细胞置于含抗生素的ND-96培养液中, 所含抗生素的种类和浓度分别为青霉素10 µg·mL-1、链霉素10 µg·mL-1、庆大霉素100 µg·mL-1。17 ℃下培养48 h以上, 让受体进行充分表达, 用于下一步的电生理学活性检测。将已注射cRNA、培养过的非洲爪蟾卵母细胞置于容积为50 µL的细胞槽中, 用含有0.1 mg·mL-1 BSA的ND-96溶液灌流, 流速为2~4 mL·min-1。每1 min的灌流时间内, 首先给予卵母细胞2 s的激动剂脉冲刺激, 使其膜上通道开放产生内向电流, 随后58 s用ND-96冲洗。反复进行此过程, 用双电极电压钳电生理学技术, 记录不同浓度的激动剂诱导α3β4 nAChRs野生型及其三点突变型的电流大小。电流记录采用Clampfit 11.3软件, 每个浓度针对每个受体, 记录6~8个卵母细胞的电流数据。

统计学分析  以1 mmol·L-1乙酰胆碱(acetylcholine, ACh) 或金雀花碱(cytisine, Cyt) 诱导产生的电流为受体通道开放最大电流, 按100%计算。对于尼古丁(nicotine, Nic) 激动剂, 以100 µmol·L-1诱导产生的峰值电流作为100%。用不同浓度的激动剂对相应受体产生的门控电流, 除以受体通道开放最大电流, 所得的百分比为该浓度的电流反应率, 即Response%。不同浓度激动剂的范围在1~1 000 µmol·L-1之间。

将激动剂诱导通道开放的电流反应率导入GraphPad Prism7.0软件(美国GraphPad Software) 进行统计分析。采用非线性方程Response% = 100/[1+ (EC50 /[agonist])nH] (其中nH代表Hill系数), 计算激动剂对α3β4 nAChR及其突变体的半数最大效应浓度(half maximum effect concentration, EC50); 浓度反应曲线图中Response%为平均数±标准误(mean ± SEM)。组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果 1 α3亚基基因的定点突变

以载有野生型α3亚基基因的质粒为模板, 通过PCR介导的定点突变技术分步制备α3[K152E, E184D, Q195T] 突变型亚基基因。将PCR产物用Dpn Ⅰ酶消化后, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测(图 3), 突变体的PCR产物大小均为5 000 bp左右。经过DNA测序验证, α3三点突变体基因的序列完全正确, 突变型亚基基因的重组载体构建成功(图 3D)。

Figure 3 The agarose gel electrophoresis of α3 subunit mutants. A-C: The agarose gel electrophoresis. M: DNA marker; 1, 4, 7: α3 subunit plasmid; 2, 5, 8: α3 subunit linear DNA; 3: α3[K152E] subunit PCR product; 6: α3[K152E, E184D] subunit PCR product; 9: α3[K152E, E184D, Q195T] subunit PCR product; D: Sequence alignment of α3 subunit and its mutant. Query is the gene sequence after mutation, Sbjct is the wild type gene sequence, and the red box is the mutated region successfully
2 野生型和突变型α3亚基质粒的提取和酶切线性化

大量提取测序正确的野生型α3和突变型α3[K152E, E184D, Q195T] 亚基基因的质粒, 并用EcoR Ⅰ酶切使之线性化。取野生型和突变型α3亚基基因质粒及对应酶切产物各3 μL, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 4)。结果显示, 突变型α3亚基基因质粒大小为2 500 bp左右, 酶切线性化后为单一条带, 说明酶切线性化彻底。线性化质粒(图 4中的第2和第6泳道) 在电泳图上运动速度比螺旋结构的环状质粒要慢。紫外分光光度计测定了野生型和突变型质粒以及线性化DNA的浓度和A260/A280比值。这些DNA的浓度在(0.2~0.3) μg·μL-1, A260/A280比值在1.86~1.88之间, 其质量和纯度符合要求。

Figure 4 The agarose gel electrophoresis of α3 subunit and linearized DNA. M: DNA marker; 1: α3 subunit plasmid; 2: α3 subunit linear DNA; 3: α3[K152E] subunit plasmid; 4: α3[K152E, E184D] subunit plasmid; 5: α3[K152E, E184D, Q195T] subunit plasmid; 6: α3[K152E, E184D, Q195T] subunit linear DNA
3 野生型和突变型α3亚基cRNA的制备

以酶切纯化后的线性DNA分子作为模板, 以SP6为启动子, 在体外转录人工合成了野生型α3和突变型α3[K152E, E184D, Q195T] 亚基的mRNA, 简称cRNA。α3 cRNA的浓度较高, 为0.8 μg·μL-1α3[K152E, E184D, Q195T] cRNA的浓度稍低, 为0.43 μg·μL-1。用相同的方法制备了α3[K152E]、α3[E184D]、α3[Q195T] 和β4亚基的cRNA。这些cRNA的A260/A280比值>2, 在2.08~2.1之间。所获得的cRNA的浓度和纯度均符合要求, 可用于卵母细胞显微注射表达相应的受体。

4 激动剂ACh对α3β4 nAChR及其突变体的活性分析

分别将野生型α3或三点突变型α3[K152E, E184D, Q195T] 亚基的cRNA与β4亚基的cRNA, 按1∶1的比例混合后, 显微注射入非洲爪蟾卵母细胞中分别表达野生型α3β4与突变型α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nAChRs, 构建电生理学活性检测实验模型。利用不同浓度的ACh刺激α3β4 nAChRs及三点突变体, 都能够诱导离子通道的正常开放, 并产生内向电流, 电流大小与ACh浓度呈正相关(图 56)。结果表明, 相同浓度的ACh对野生型α3β4受体产生的配体门控电流明显低于α3[K152E, E184D, Q195T]β4突变型受体产生的电流(图 5AB)。ACh激动野生型α3β4和突变型α3[K152E, E184D, Q195T]β4受体的EC50分别为277.5 (258.6~297) 和170.5 (157.8~184.2) μmol·L-1, 二者相差1.6倍。3个位点突变后EC50降低约40%, 说明ACh对突变型受体的激动活性增强了约40%, 突变型对ACh的敏感性增加。在1 mmol·L-1 ACh的刺激条件下, 二者都达到了其最大电流开放度(图 6A)。

Figure 5 The current traces of wide-type and mutant α3β4 nAChRs evoked by different concentrations of different agonists. A, B: Acetylcholine (ACh); C, D: Nicotine (Nic); E, F: Cytisine (Cyt)

Figure 6 Concentration response curves of wide-type and mutant α3β4 nAChRs gated by 3 agonists. A: ACh; B: Nic; C: Cyt
5 激动剂Nic对α3β4 nAChR及其突变体的活性分析

利用不同浓度的Nic刺激α3β4 nAChRs及三点突变体, 照样能够诱导离子通道的正常开放, 并产生内向电流, 电流大小与Nic浓度呈正相关(图 56)。结果表明, 相同浓度的Nic对野生型α3β4受体产生的配体门控电流与α3[K152E, E184D, Q195T]β4突变型受体产生的电流大小很接近(图 5CD)。Nic激动野生型α3β4和突变型α3[K152E, E184D, Q195T]β4受体的EC50大小相当, 分别为34.02 (30.69~39.39) 和26.6 (20.92~35.24) μmol·L-1, 二者相差仅1.3倍。3个位点突变后EC50降低约20%, 即Nic对突变型受体的激动活性略有增强(图 6B)。与ACh不同的是, Nic在较低浓度100 μmol·L-1的刺激条件下, 野生型α3β4和突变型受体就可达到其最大电流开放度, 说明这两个受体对Nic的敏感性比对乙酰胆碱的门控反应更灵敏。

6 激动剂Cyt对α3β4 nAChR及其突变体的活性分析

不同浓度的Cyt刺激α3β4 nAChRs及三点突变体, 配体门控离子通道开放产生的内向电流变化趋势与上述ACh和Nic都不相同(图 56)。结果显示, 相同浓度的Cyt, 对野生型α3β4受体产生的配体门控电流, 比α3[K152E, E184D, Q195T]β4突变型受体产生的电流明显大很多(图 5EF)。野生型受体在Cyt 50、100、1 000 μmol·L-1 3个浓度下, 其门控电流增长幅度较小, 即3个电流峰值差异较小, 随Cyt浓度增长电流增大缓慢; 而三点突变型受体在这3个Cyt浓度下, 其门控电流增长幅度较大, 即3个电流峰值差异较大, 随Cyt浓度增长电流增大较快。Cyt在浓度1 000 μmol·L-1的刺激条件下, 野生型α3β4和突变型受体均可达到其最大电流开放度。

Cyt激动野生型α3β4和突变型α3[K152E, E184D, Q195T]β4受体的EC50大小变化非常显著, 分别为23.05 (21.12~25.15) 和98.45 (82.18~119.1) μmol·L-1, 二者相差4.3倍。即3个位点突变后EC50增加了4.3倍, 也就是说Cyt对突变型受体的激动活性明显下降, 突变型对Cyt的敏感性大大降低(图 6C)。突变型的Cyt浓度反应曲线与野生型的曲线相比, 明显向右下方偏移, 两条曲线之间的距离较远。这与ACh对突变型受体敏感性增强的结果是相反的。突变型的ACh浓度反应曲线与野生型的曲线相比, 向左上方偏移。突变型的Nic浓度反应曲线与野生型的曲线相比, 向左上方稍有偏移, 且两条曲线之间的距离很近。

7 三种激动剂对α3β4野生型及其突变型受体激发产生的最大门控电流比较

以1 mmol·L-1 ACh诱导产生的电流Imax作为受体全开放基准, 计为100%。分别检测并计算Nic和Cyt对α3β4 nAChRs及其突变体的最大激动效率Emax, 计算公式为: Imax (Nic)/Imax (ACh)Imax (Cyt)/Imax (ACh)。电生理结果显示(图 78), α3亚基突变后, Nic和Cyt对野生型和突变型α3β4 nAChRs的最大激动浓度不变, 分别为100 µmol·L-1和1 mmol·L-1。Nic对野生型和突变型α3β4 nAChRs的Emax无明显差异, 分别为51.55% ±4.25%、60.91% ± 2.2%。而Cyt对突变型α3β4 nAChRs的Emax由对野生型的94.12% ± 3.71%提高到155.08% ± 9.34%, 通道开放效率提高了1/2以上, Emax有极显著差异(P<0.000 1)。

Figure 7 The maximum current traces of wild-type (A, C) and mutant α3β4 (B, D) nAChRs induced by ACh, Nic and Cyt

Figure 8 The Emax of wild type and mutant α3β4 nAChR evoked by Nic and Cyt compare to ACh as 100%. n = 5, mean ± SEM. ****P < 0.000 1 vs wild type α3β4. ns: No significance
8 三种激动剂对α3β4 nAChR的单点突变体的活性分析

ACh对野生型α3β4和3个单点突变型α3[K152E]β4、α3[E184D]β4、α3[Q195T]β4受体的EC50分别为277.5、39.01、53.99和43.34 μmol·L-1, 与野生型相比突变体对激动剂ACh的激动活性分别增强了约7、5和6倍。而ACh对三点突变型的EC50为170.5 μmol·L-1, 较野生型变化了1.6倍。改变了α3亚基的第152位氨基酸位点, 使Nic对α3β4 nAChR的敏感性降低57% 而对另外两个突变型α3[E184D]β4和α3[Q195T]β4的激动活性与三点突变型一致, 增强了约20%。Cyt激动单点突变型α3[K152E]β4、α3[E184D]β4和α3[Q195T]β4受体的活性较野生型α3β4受体相比下降了约60%, 而3个位点突变后激动活性下降了77% (表 2)。

Table 2 EC50 and hillslope values of 3 agonists for wide-type and mutant α3β4 nAChRs. bEC50 mutant /α3β4
讨论

哺乳动物nAChRs的α3与β4亚基组合, 形成α3β4功能性受体亚型。该亚型主要分布于周围神经系统和中枢神经系统的部分区域, 在某些神经递质的突触释放调节中起着非常重要的作用[14]。研究表明, 在内侧缰核(medial habenula, MHb)-脚间核(interpeduncular nucleus, IPN) 通路中, α3β4 nAChR对尼古丁奖赏和戒断作用的调节过程具有重要影响; Park等[15]研究证明, α3β4 nAChR是尼古丁衍生物新烟碱类杀虫剂的作用靶点, 可能会导致哺乳动物的血压升高; 此外, 位于下丘脑的α3β4 nAChR参与尼古丁介导的食欲降低过程[16]α3亚基在中枢神经系统中还扮演着重要角色, 可参与调控机体器官的自我平衡, 但α3亚基参与调控的神经和病理机制目前尚不清楚。最新研究表明, α3β4 nAChR可能是治疗酒精成瘾的一个重要靶点[17], 足见α3β4 nAChR的重要性。α3β4 nAChR在成瘾、癌症和肥胖等许多重大疾病的发生、发展过程中起着很重要的作用, 但其相关病理生理机制尚不清楚。

本研究利用PCR介导的定点突变技术, 构建了α3亚基的三点突变型α3[K152E, E184D, Q195T], 并与野生型的β4亚基组合, 在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达。以前的研究结果显示, loop B和loop C环为α亚基N-端胞外配体结合区上, 影响配体选择性结合的关键区域[18], 而第152位氨基酸位于loop B中, 第184、195位氨基酸位于loop C中, 它们主要影响激动剂的效能[10]。基于以上研究基础, 本研究将α3亚基上第152、184和195位的3个氨基酸位点作为研究α3-α6亚基特异性的关键位点, 将以上3个位点同时进行定向突变, 构建了三点突变体亚基α3[K152E, E184D, Q195T], 并进一步利用电生理技术建立了α3[K152E, E184D, Q195T]β4活性检测模型, 可用于研究α3β4 nAChR组成中α3亚基与配体相互作用的特异性关键氨基酸位点, 阐明配体和α3β4 nAChR相互作用的分子机制, 进而可指导配体药物的设计与结构研究[19]

α3β4 nAChR是调节自主神经系统胆碱能作用最丰富的受体, 迄今为止尚不清楚它与激动剂结合的分子机制[20]。前期研究表明, 不同激动剂对受体的选择性结合方式和亲和力存在差异[21]: Lindovsky等[22]构建了双点突变体α3β4[D191N, D192N], 发现突变后激动剂Nic只能在3 mmol·L-1的浓度下诱导受体开放, 而激动剂地棘蛙素对受体的激动效果变化不大; 当α3亚基上的Phe和Tyr改变, 受体对ACh和Nic的EC50未变化, 但是对二甲基丙磷酸盐的EC50却均有下降[23]。且Costa等[20]通过分子建模, 推测出激动剂ACh、Nic、Cyt与α3β4 nAChR中α3亚基上的loop B和loop C的氨基酸位点有高亲和力的结合。因此, 本文利用PCR介导的受体定点诱变技术, 研究特定位置氨基酸种类的变化对不同激动剂的结合活性的影响。α3亚基上152、184和195三个位点的突变使α3β4 nAChR对不同激动剂的敏感性发生变化。与野生型受体相比, 突变后的α3β4 nAChR对激动剂ACh的敏感性增强, 且100 µmol·L-1 Nic激动突变体α3[K152E, E184D, Q195T]β4产生的内向电流反应率变大, 推测是由于位点的改变导致受体LBD区更有利于Nic的识别与结合, 通道的敏感性增加, 同时开放程度增大。

此外, 相比于野生型, 突变体α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nAChR对Cyt敏感性减弱, EC50为野生型受体的4.3倍。在1 mmol·L-1 Cyt刺激野生型受体产生的激发电流值与1 mmol·L-1 ACh刺激产生的电流值相似, 与先前关于Cyt可作为β4* nAChRs完全激动剂的研究结果一致[10]。但是, 突变体α3[K152E, E184D, Q195T]β4在1 mmol·L-1 Cyt激动下产生的电流值约为1 mmol·L-1 ACh刺激产生电流值的1.5倍。综上, α3亚基这3个位点的氨基酸残基可能是激动剂Cyt与α3β4 nAChR结合的关键位点, 变化后造成配体与受体结合力减弱, 进而表现为受体电流变化。

单个氨基酸位点的突变也会改变受体在激动剂诱导下的活性和功能。单点突变体α3[K152E]β4、α3[E184D]β4和α3[Q195T]β4对ACh的敏感性增强了5~10倍, 而三点同时突变后会相互冲突, 受体敏感性不如单点突变体强。针对激动剂Cyt, 三点同时突变与单个突变相比, 对α3β4 nAChR的结合活性起到了协同减弱作用。前期研究表明, nAChRs亚基中的氨基酸突变会影响亚基的折叠和空间结构[24], 综合本文研究结果, 推断三点突变对α3亚基的空间结构和折叠方式产生影响, 促使其空间构象发生变化, 从而使激动剂与三点突变体的结合活性较单点突变体产生差异, 其分子机制尚有待进一步探讨。

本研究建立了α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nAChR突变受体模型, 这不仅有助于了解配体与受体相互作用的分子机制[25], 也为研发与α3β4 nAChR亚型相关的疾病诊疗药物提供研究基础, 将为以α3β4 nAChR为靶点的新药设计和开发提供新的理论支持。本研究利用3种配体门控激动剂(ACh、Nic和Cyt), 测定了其对α3β4野生型和三点突变型受体的结合活性, 研究突变型受体的功能变化, 阐明了突变位点氨基酸种类与受体功能之间的相互关系, 将为后续研究α3β4 nAChR精细结构和功能以及揭示相关疾病发病机制提供重要线索。

作者贡献: 陈舒苗负责突变体RNA的构建、活性测定与稿件撰写; 张笑凡负责突变体质粒的提取; 于津鹏、朱晓鹏、长孙东亭和罗素兰负责实验设计、过程指导、稿件撰写与修改。

利益冲突: 本文作者声明无任何利益冲突。

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