2. 山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 山西 太原 030006;
3. 地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室, 山西 太原 030006
2. The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
3. The Key Laboratory of Effective Substances Research and Utilization in TCM of Shanxi Province, Taiyuan 030006, China
脑衰老是一个高度复杂的生物过程, 可导致认知功能下降和神经退行性疾病的发生。神经炎症是神经退行性疾病的主要特征, 与中枢神经系统中小胶质细胞的激活和炎性因子的过度分泌有关[1, 2]。
小胶质细胞是脑内关键的免疫细胞, 小胶质细胞的激活可增加促炎因子和活性氧的生成, 进而引发神经元凋亡或坏死[3, 4]。因此, 抑制小胶质细胞的异常激活可以延缓多种衰老相关疾病的病程。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 是一种来源于革兰阴性菌的内毒素, 通过诱导促炎因子的分泌, 从而引发神经炎症。因此, LPS诱导的BV-2小胶质细胞和原代小胶质细胞模型常用于神经炎症的研究[5]。
黄芩素是从黄芩根中分离得到的一种黄酮类化合物, 具有抗氧化和抗炎作用[6]。课题组前期研究发现, 黄芩素不仅可减轻D-半乳糖诱导的衰老大鼠认知障碍[7], 还可改善快速老化小鼠SAMP8的学习和记忆功能[8]。同时, 课题组证明黄芩素通过抑制LPS诱导的BV-2细胞促炎因子的释放而表现出抗炎作用[9]。但是, 黄芩素改善神经炎症的具体分子机制尚不明晰。
基因差异表达是指在一定刺激下, 基因的mRNA表达水平发生显著性改变的现象。大量文献报道[10-12], LPS可诱导BV-2细胞的许多基因发生差异表达, 一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 和环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 是差异表达最显著的基因之一。iNOS和COX-2是重要的炎症介质, 均受信号转导子和转录激活子1/核因子κB (signal transducer and activator of transcription 1/nuclear factor kappa-B, STAT1/NF-κB) 信号通路的调控[13]。NADPH氧化酶2 (NADPH oxidase-2, NOX2) 是一个关键的酶系统, 当LPS激活小胶质细胞后会迅速导致活性氧的产生增加[14], 进一步激活STAT1/NF-κB信号通路[15, 16]。此外, iNOS和COX-2的过度激活会使前列腺素E2 (prostaglandin E2, PEG2) 和一氧化氮(nitric oxide, NO) 的合成增加, 这也是导致神经元损伤和神经炎症发生的主要原因[17, 18]。
基于文献报道的LPS激活BV-2细胞相关的差异表达基因, 本研究进行了生物信息学分析和网络分析, 寻找在该过程中发挥核心作用的靶点; 同时采用分子对接方法, 根据蛋白质与小分子的形状匹配和能量匹配原理, 计算结合亲和力, 预测小分子化合物的作用靶点[19]。通过上述方法, 预测黄芩素在LPS诱导的BV-2细胞中调节的潜在靶点和通路, 进行实验验证, 以阐释黄芩素抗神经炎症的分子机制。
1 材料与方法药品与试剂 小鼠小胶质细胞株(BV-2细胞)、MEM培养基、特级胎牛血清、青霉素-链霉素溶液(100×) 和BCA试剂盒购自上海生工生物工程有限公司; 黄芩素(批号JZ20150711, 质量分数 > 98%) 购自南京景竹生物科技有限公司; LPS购自Sigma公司; Hoechst 33342、细胞膜/细胞浆蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术(上海) 公司; iNOS、COX-2、NF-κB/p65、phospho - NF - κB (p- NF - κB)、STAT1、phospho-STAT1 (p-STAT1)、gp91phox抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司; p47phox抗体购自上海英骏生物技术有限公司; 荧光标记IgG二抗购自美国英杰生命技术有限公司。
仪器 Infinite M200 Pro多功能酶标仪(瑞士Tecan公司); ECLIPSE Ti荧光显微镜(日本Nikon公司); 电泳仪、光成像系统Chemi Doc TM XRS + (Bio-Rad公司); CytationTM 5细胞成像多功能检测仪(美国伯腾仪器有限公司)。
靶点收集 在PubMed[20] (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) 数据库以关键词“LPS、BV- 2 cell、differentially expressed genes”收集LPS激活BV-2细胞相关差异表达基因。将所得差异基因汇总, 并删除重复基因。使用SwissTargetPrediction数据库[21] (http://www.swisstargetprediction.ch/) 和SEA数据库[22] (http://sea.bkslab.org/) 预测黄芩素的靶点, 并与LPS激活BV-2细胞的差异基因取交集, 从而得到黄芩素抗神经炎症的潜在靶点。
蛋白- 蛋白互作 (protein-protein interaction, PPI) 网络构建 使用STRING11.0数据库[23] (https://string-db.org/) 获得靶点与靶点之间的作用关系, 并用Cytoscape 3.7.2软件构建蛋白与蛋白互作网络[24]。应用Network Analyzer[25]插件计算网络中的拓扑参数, 并使用MCODE插件获得关键子网络[26]。
分子对接 使用ZINC数据库[27] (http://zinc.docking.org/) 获得黄芩素的结构, RCSB PDB数据库[28] (https://www.rcsb.org/) 获得COX-2 (PDB ID: 5KIR) 和iNOS (PDB ID: 3E7G) 蛋白的3D结构。采用AutoDock Vina (version 1.1.2) 软件[29]预测黄芩素与COX-2、iNOS的结合能值和结合模式, 并用PyMOL (version 0.99)[30]可视化对接结果。
GO富集分析 采用DAVID数据库[31] (https://david.ncifcrf.gov/) 预测黄芩素发挥抗神经炎症作用涉及的重要生物过程。
细胞培养和药物处理 将BV-2细胞以每毫升1.2×106个细胞的密度接种于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 的MEM培养基中, 并在含5% CO2的37 ℃培养箱中培养。根据前期研究结果[9], 给予4 μmol·L-1黄芩素预处理2 h后, 再加入0.1 μg·mL-1 LPS共孵育24 h进行后续实验。
Western blot实验 收集细胞样品, 按照制造商的说明书提取细胞膜蛋白与胞浆蛋白, 具体步骤如下: 向细胞中加入1 mL含1%苯甲基磺酰氟(phenyl methanesulfonyl fluoride, PMSF) 的裂解缓冲液A, 反复冻融5次破坏细胞后, 置冰上裂解15 min, 700 ×g离心10 min, 收集上清液, 再以12 000 ×g离心10 min, 收集胞浆蛋白。之后将200 μL裂解缓冲液B加入细胞膜沉淀物中, 置冰上裂解10 min, 12 000 ×g离心5 min, 收集膜蛋白。通过BCA蛋白质测定法确定蛋白质浓度。
收集细胞样品, 加入RIPA裂解液在冰上裂解30 min, 每10 min涡旋一次, 用BCA法测定蛋白浓度。通过10%或12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(每孔上样量为50 μg), 并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h后, 分别加入iNOS、COX-2、NF-κB/p65、p-NF-κB、STAT1、p-STAT1、p47phox、gp91phox抗体, 并在4 ℃孵育过夜。TBST洗去一抗后, 加入二抗在37 ℃孵育条带1 h, 再次用TBST洗涤3次后, 在凝胶成像仪上显影成像, 并运用Image J对条带进行分析。
免疫荧光染色 将BV-2细胞以每毫升1.2×106个细胞的密度接种于96孔板中, 4 μmol·L-1黄芩素预处理2 h后用0.1 μg·mL-1 LPS刺激24 h。弃去上清液后, 用4%多聚甲醛固定细胞20 min, 并用PBS洗涤。使用0.1% TritonX-100透化细胞, 并封闭1 h, 加入一抗p47phox在4 ℃孵育过夜。清洗掉一抗后, 加入荧光二抗置于摇床上在37 ℃孵育2 h。最后加入10 μmol·L-1 Hoechst 33342与细胞共孵育15 min。使用CytationTM 5细胞成像多功能检测仪检测荧光强度和拍摄荧光图像。
统计学方法 实验结果采用x ± SEM表示, 使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析和Tukey's检验比较组间差异, P < 0.05表明有统计学意义。
2 结果 1 黄芩素抗神经炎症靶点PPI网络构建从PubMed数据库共收集到2 463个差异表达基因, 利用SwissTargetPrediction和SEA数据库预测得到黄芩素的作用靶点139个。通过取交集, 得到38个共同靶点, 见表 1[10-12]所示。基于STRING数据库构建蛋白-蛋白互作网络, 删除网络中未连接的节点, 得到黄芩素抗神经炎症的靶点网络(图 1A)。网络聚类分析显示, 核心子网络[top 1, molecular complex detection (MCODE) 得分= 6.75] 由9个节点组成(图 1B), 其中COX-2和iNOS在核心子网络中具有较高的度值(degree), 且已报道这两个基因在LPS诱导的BV-2细胞中发生明显的差异表达。
为了进一步探索黄芩素与COX-2 (PDB ID: 5KIR)、iNOS (PDB ID: 3E7G) 的结合模式, 采用AutoDock Vina对结合能进行预测, 并与相应的阳性小分子(罗非昔布和AR-C102222) 进行比较。所有对接结果的均方根偏差(RMSD) 均小于2, 表明对接结果是可靠的[32]。Morris等[33]研究发现, 当结合能小于-5.0 kcal·mol-1时, 代表对接良好。结果显示, 黄芩素和阳性小分子罗非昔布与COX-2的结合能分别为-9.9和-8.4 kcal·mol-1, 黄芩素和阳性小分子AR-C102222与iNOS的结合能分别为-7.2和-7.1 kcal·mol-1, 表明黄芩素与COX-2和iNOS对接良好。黄芩素与iNOS、COX-2的最佳结合模式如图 2所示。
运用DAVID数据库对38个靶点进行GO富集分析, 根据P < 0.05, 得到11个显著富集的生物过程。结果显示, 黄芩素可调节氧化还原过程(oxidation-reduction process)、炎症反应(inflammatory response)、NF-κB入核的正向调节(positive regulation of NF-κB import into nucleus)、iNOS生物合成过程的正向调节(positive regulation of nitric-oxide synthase biosynthetic process), 这些生物过程与氧化应激和神经炎症的发生密切相关(图 3)。
为了验证黄芩素对炎症介质iNOS、COX-2的抑制作用, 采用Western blot技术进行检测。结果显示, 0.1 μg·mL-1 LPS处理细胞后, iNOS和COX-2表达水平分别显著升高132.94%和105.52%。然而, 用4 μmol·L-1黄芩素预处理后可使iNOS表达水平显著降低40.09% (图 4A), COX-2表达水平显著降低42.80% (图 4B), 这表明黄芩素可以显著抑制iNOS和COX-2的表达。
iNOS和COX-2是NF-κB信号通路中两种重要的分子, iNOS和COX-2蛋白的过表达可激活NF-κB信号通路, 诱导神经炎症反应。本课题组前期采用免疫荧光技术发现4 μmol·L-1黄芩素可使LPS诱导的NF-κB/p65表达显著降低且有效抑制NF-κB/p65的核易位[9]。本研究采用Western blot对NF-κB信号通路的关键蛋白进行检测。结果显示, LPS诱导BV-2细胞后, NF-κB/p65和p-NF-κB表达水平分别上调74.03%和92.63%。然而, 黄芩素给药后可使NF-κB/p65和p-NF-κB的表达水平显著下调31.12%和38.22% (图 5), 这表明黄芩素能有效抑制NF-κB/p65的表达和NF-κB的磷酸化。
LPS可诱导NF-κB蛋白过表达, 并快速激活其上游蛋白STAT1的表达, 从而加剧神经炎症。采用Western blot技术对STAT1信号通路的关键蛋白p-STAT1进行检测。结果显示, LPS诱导BV-2细胞后能使p-STAT1的表达显著上调1 222.45%。然而, 黄芩素处理后可使p-STAT1的表达水平显著降低48.97% (图 6), 这表明黄芩素能明显下调LPS诱导的BV-2细胞STAT1蛋白的磷酸化。
STAT1介导的炎症反应需要NOX2 (gp91phox/p47phox) 依赖性生成ROS, 而过量的ROS对于激活NF-κB信号通路, 促进STAT1磷酸化和核易位至关重要。采用免疫荧光和Western blot技术对p47phox、gp91phox蛋白表达进行检测。免疫荧光结果表明, LPS处理后p47phox的表达显著增加42.89%。然而, 黄芩素使p47phox的表达显著降低24.57% (图 7A)。Western blot结果表明, LPS刺激后使胞膜p47phox的表达增加了128.55%, 然而, 黄芩素处理后使胞膜p47phox水平显著下调了48.12% (图 7B)。此外, LPS刺激使总蛋白水平和胞膜gp91phox水平分别显著增加57.80%和57.21% (图 7C)。然而, 黄芩素处理使gp91phox总蛋白和膜蛋白表达显著降低了35.76%和35.48%。以上结果表明, LPS可加快p47phox从细胞质到细胞膜的转移, 并上调膜蛋白gp91phox的表达, 但给予黄芩素后能抑制p47phox从胞质到胞膜的转移, 并抑制总gp91phox蛋白和膜gp91phox蛋白的表达。
差异表达基因是在疾病发生发展过程中发挥重要作用的基因, 这些基因对于阐述疾病病理机制具有重要意义。大量文献报道, LPS可诱导BV-2细胞内大量基因发生差异表达, 这些基因为神经炎症相关靶点的发现提供了依据。对这些基因进行生物信息挖掘, 通过网络构建和网络聚类分析寻找核心靶点, 是药物靶点发现的新途径[34]。分子对接可用于模拟药物小分子和受体蛋白的结合模式, 将分子对接和生物信息分析相结合, 为黄芩素抗神经炎症潜在靶点和通路的预测提供了新的思路。预测结果显示, 黄芩素可能通过与关键靶点COX-2和iNOS结合发挥抗神经炎症的作用。
LPS可诱导小胶质细胞的过度活化, 从而引起神经变性, 导致神经元功能受损[35]。此外, 小胶质细胞的激活将引起多种炎性介质水平的升高, 包括COX-2和iNOS[36-38]。iNOS的过度累积加速NO的生成, 同时增强COX-2的活性, 进一步加重炎症的级联反应和神经系统的退行性病变[39-41]。本研究发现, LPS显著上调iNOS和COX-2的表达。然而, 给予黄芩素后可显著下调iNOS和COX-2的蛋白表达, 表明黄芩素抑制LPS诱导的BV-2细胞炎症。
NF-κB信号通路与慢性炎症和神经退行性疾病的发展高度相关。NF-κB信号通路的激活可导致炎症介质iNOS和COX-2的生成增加[42-44]。同时, NF-κB转录因子表达受胞质内STAT1的调控[45], STAT1可与NF-κB结合并激活下游基因的表达, 最终导致神经炎症和神经退行性疾病[46]。因此, 通过抑制NF-κB信号通路来调节炎症因子的生成可减轻神经毒性和减少神经元死亡, 进而延缓衰老相关疾病的发生[47, 48]。本研究发现, LPS显著增加NF-κB/p65的表达和NF-κB的磷酸化, 但给予黄芩素后显著降低NF-κB/p65的表达和NF-κB的磷酸化, 表明黄芩素可通过NF-κB信号通路抑制LPS诱导的BV-2细胞炎症。
STAT1受Toll样受体刺激后迅速磷酸化, 而磷酸化的STAT1参与调节促炎因子的释放和介导免疫反应[49]。通过抑制STAT1的磷酸化可显著减少COX-2和iNOS的生成[50]。本研究发现, LPS刺激后STAT1的磷酸化显著增加。给予黄芩素后显著抑制STAT1的磷酸化, 表明黄芩素可通过STAT1信号通路抑制LPS诱导的BV-2细胞炎症。本研究结果与前期发现黄芩素抑制STAT1信号通路减少快速老化小鼠炎症因子分泌相一致[51]。
NF-κB和STAT1信号通路的激活受ROS信号调控[52]。NOX是加快细胞中ROS产生的重要物质。当胞质组分p47phox转移到细胞膜, 并在细胞膜与gp91phox结合后, NOX的表达会迅速增加, 进而诱导细胞内产生高水平的ROS[53, 54]。因此, 抑制依赖于NOX产生ROS的通路可调控NF-κB和STAT1信号通路激活介导的炎症反应。本研究结果表明, LPS处理后胞质组分p47phox在细胞膜上的表达显著增加, 且促使胞膜gp91phox蛋白表达增加, 有利于NOX2的形成, 进而加速ROS的产生。然而, 给予黄芩素后抑制gp91phox和p47phox的表达, 从而减轻LPS诱导的BV-2细胞炎症反应。
综上, 通过结合生物信息分析和分子对接技术, 本研究结果揭示黄芩素可能通过抑制NOX2 (gp91phox/p47phox) /STAT1/NF-κB级联反应来改善LPS诱导的氧化应激和神经炎症(图 8)。
作者贡献: 杨吾燕和闫姣姣负责进行实验和数据分析, 完成文章撰写; 高丽和秦雪梅负责实验思路的指导; 所有作者均对本文有所贡献。
利益冲突: 无利益冲突。
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