药学学报  2022, Vol. 57 Issue (2): 541-546     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0011   PDF    

●新药发现与研究实例简析●

新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

本刊在2020年2月发表了瑞德西韦的案例, 当时处于疫情暴发初期, 由同情用药进行了III期临床研究, 实属应急之需。结果表明, 瑞德西韦对防治新冠肺炎的效果并不理想, 本品Paxlovid是FDA批准的第一个治疗COVID-19感染的药剂, Paxlovid是由首创药物尼马曲韦和已上市的药物利托那韦的复方药, 尼马曲韦是辉瑞公司用不到两年时间创制出针对COVID-19的特异性靶标SARS COV-2 3Cpro蛋白酶的抑制剂, 得益于十多年前研制SARS药物积累的成果和经验, 针对新冠病毒的特征量体裁衣式地演化出全新作用机制的口服药物, 并与小剂量的CYP450抑制剂利托那韦配伍, 提高了治疗效果。丰富的研发经验和娴熟的技术运用, 得以在短时间内创制出全球亟需的口服用药。

(编者按)

尼马曲韦的研制和首创的抗COVID-19药物
郭宗儒     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
1 引言 1.1 SARS CoV-1和SARS CoV-2

2020年开始的全球性呼吸道传染病, 病原体为冠状病毒。基因组分析表明, 该病毒与2002~2003年流行的严重急性呼吸道症候(SARS) 病原体SARS CoV-1的基因有高度的相似, 称作SARS CoV-2。SARS CoV-1和SARS CoV-2基因组编码都有两个多聚蛋白(PP1a和PP1ab) 和4个结构蛋白, 含有3C样的半胱氨酸蛋白酶(3Cpro), 3Cpro催化裂解PP1a和PP1ab成较短的功能性蛋白, 后者对病毒复制至关重要。所以, 抑制3Cpro功能成为研制抗SARS CoV-1/2的靶标。由于SARS CoV-1和SARS CoV-2的3Cpro活性中心的构成相同, 因而辉瑞公司研制抗SARS CoV-2药物沿用了当初研究SARS CoV-1抑制剂的积累和技术。

1.2 3Cpro蛋白酶活性中心的特征

所有冠状病毒的3Cpro活性部位具有高度保守性, 与底物结合是由4个位点构成: S1、S2、S1′和S2′, 如图1所示。酶的剪切位点是S1′处的Cys145的肽键。半胱氨酸的巯基具有较强的亲核性, 可作为研制3pro抑制剂的把手, 与具有适度亲电性基团的抑制剂作共价结合, 项目的研究依此作为出发点 (Dai WH, Zhang B, Jiang XM, et al. Structure-based design of antiviral drug candidates targrting the SARS-CoV-2 main protease. Science, 2020, 368: 1331-1335)。

Figure 1 Subsite nomenclature for proteolytic enzymes is shown. Amino acid residues to the left of the polypeptide scissile amide bond are numbered sequentially, beginning with P1 and increasing toward the N-terminus. Amino acid residues to the right of the scissile bond are numbered sequentially, beginning with P1′ and increasing toward the C-terminus. Complimentary regions of the protease active site employ the corresponding S numbering
1.3 与巯基发生共价结合的基团和片段

与巯基生成可逆(或不可逆) 共价结合的基团或片段有醛基、硫代或氧甲基酮、胺酰基甲基酮、氰基以及1, 2-二羰基结构等, 共价结合的牢固性取决于这些基团所处的化学环境。图 2是与巯基作共价结合的常用基团。

Figure 2 Typical weak electrophilic groups
2 先导物的产生

2003年暴发SARS疫情, 辉瑞为研究SARS CoV-1 3Cpro抑制剂, 借鉴了1997年默克研制的对人鼻病毒(HRV) 3Cpro有选择性不可逆抑制作用的芦平曲韦(1, rupintrivir, 未上市), 分析1与另一种冠状病毒传染性胃肠炎病毒(TGEV) 的3Cpro复合物的晶体结构, 用来同源建模SARS CoV-1 3Cpro蛋白酶的三维结构。虽然SARS CoV-1 3Cpro与HRV-3Cpro的同源性较低, 但两个底物蛋白的序列有共性。推论1有可能成为设计SARS CoV-1 3Cpro抑制剂的起始物, 然而实验结果表明芦平曲韦对SARS CoV-1 3Cpro蛋白酶活性很低, 需要进行较大的结构改造。为此, 保留了1中的迈克尔亲电基团, 将对应于S1和S1′的P1和P1′结构部分加以变换, 对应于S2和S2′的P2和P2′作较大的结构删除以降低分子尺寸, 经构效关系分析得到了活性化合物2 (代号PF-00835231), 是具有中等强度的不可逆抑制剂[kobs/I = 586 (mol·L-1)-1s-1]。图 3是化合物2与SARS CoV-13Cpro复合物晶体结构图(Anand K, Ziebuhr J, Wadhwani P, et al. Coronavirus main proteinase (3CLpro) structure: basis for design of anti-SARS drugs. Science, 2003, 300: 1763-1767)。

Figure 3 Co-crystallography of SARS-CoV-1 3Cpro with compound 2 (PF-00835231)

分析图 3的结合信息, P2′域甲氧基吲哚(帽基) 结合于S2′, 环上NH与酶的Glu189形成氢键结合; P1处的内酰胺环替换底物谷氨酰胺环仍能很好地适配于S1腔穴。迈克尔基团(丙烯酸乙酯) 与巯基发生加成反应, 生成的两个sp3杂化的α, β-碳原子呈重叠式构象, 这种较高能量的构象对活性不利。羰基氧的孤电子对与3Cpro蛋白氧阴离子穴的氢键给体之间的空间排布未成180° (不利于氢键结合), 而且其他一些氢键键长明显超过最适的2.8Å, 这些都需要进一步提高。

下面叙述的是对SARS CoV-1 3Cpro靶标活性的结构优化, 虽然优化出高活性的候选物, 因SARS疫情结束而未作临床研究, 却为2020年COVID-19的流行, 研制针对SARS CoV-2 3Cpro靶标的药物打下了坚实的基础。

3 先导物的优化

以化合物2作为先导物继续优化对SARS CoV-1 3Cpro的抑制作用, 变换结构考虑两个方面, 一是不同的迈克尔亲电基团的反应性能, 另一是分子结构对酶的亲和力, 二者良好的匹配是兼具高活性和高选择性的保障。

首先是变换迈克尔基团, 由于Cys145是蛋白剪切的位点, 裂解过程的过渡态形成碳四面体结构, 为模拟过渡态的结构特征, 选择用O-酰化羟甲基酮作为亲电基团, 羰基和酰氧基的拉电子效应, 提高了中间的亚甲基亲电性, 以与巯基发生亲电取代, 导致可逆或不可逆性共价结合(Krantz A, Copp LJ, Coles PJ, et al. Peptidyl (acyloxy) methyl ketones and the quiescent affinity label concept: the departing group as a variable structural element in the design of inactivators of cysteine proteinases. Biochemistry, 1991, 30: 4678-4687)。

3.1 迈克尔亲电基团的变换

首轮变换的结构部分是P1′处的迈克尔亲电基团, 设计合成的化合物列于表 1。活性测定是用连续荧光共振能量转移实验评价对SARS CoV-1 3Cpro的抑制。kobs为一级速率常数, 代表SARS CoV-1 3C酶失活的速率, kobs与化合物浓度[I] 作图(kobs/I) 的斜率代表化合物对酶反应不可逆的抑制程度, 数值越大活性越强。IC50表示酶的活性被可逆性抑制50%时化合物的摩尔浓度, 数值越小活性越强。

Table 1 SARS CoV-1 3Cpro inhibition data for acyloxymethylketone compounds. a: Continuous fluorescence resonance energy-transfer assay. The kobs is the first-order rate constant for the proteolytic reaction and represents the rate of inactivation of coronavirus 3C protease. The slope (kobs/I) of a plot of kobs vs [I] is a measure of the activity of the inhibitor for an enzyme

结果表明, 脂肪酸酯的化合物3~5的烷基由于电性相近, 对亚甲基的亲电效应变化不大, 因而活性相近。化合物6~12为单(或无) 取代苯甲酸酯, 与活性部位的结合是可逆性抑制, 其中2-氰基苯基(12) 的活性最高, IC50达到17 nmol·L-115~18是在苯环上有两个吸电子基团, 亲电性强, 与酶的亲核中心发生不可逆的共价结合, 其中二氯代的15活性最强。15对SARS CoV-1感染Vero 76细胞的活性EC50 = 0.29 μmol·L-1, 是个很强的化合物, 因为Vero 76细胞对外源性物质的外排作用很强。15还显示较高的选择性, 对谷胱甘肽和在血浆中都有很高的稳定性。然而15的溶解性太差, 不宜深入临床研究。苯环上双取代化合物1314是推电子基团, 是可逆性抑制剂。

3.2 变换化合物15的P2'片段

为了克服15溶解度低的缺点, 固定P1、P1′和P2的结构不变, 改变P2′帽基4-甲氧基吲哚片段为水溶性或极性片段, 例如表 2列出的叔丁氧基(19) 或甲基(20), 结果是显著降低了活性; 苯并咪唑(21) 仍保持不可逆抑制活性(略低), 但没有改善溶解性。四氢呋喃化合物22活性虽然比15降低了10倍, 但溶解度提高了20倍, 对病毒感染Vero 76细胞的EC50为2.4 μmol·L-1

Table 2 SARS CoV-1 3Cpro inhibition for P2′- modified acyloxymethylketone compounds

病毒生物学分析表明, 不可逆抑制剂虽然具有良好的药效学表现, 但如果病毒蛋白的再合成速率低于药物的清除率, 那么对3Cpro蛋白的抑制不一定拘泥于不可逆抑制的机制。新表达的病毒多聚蛋白经3Cpro催化裂解固然对病毒复制至关重要, 但它呈现活性只是在细胞被感染后病毒生命周期的单个环节, 病毒颗粒本身并不依赖3Cpro蛋白的活性, 其他环节也不受控制, 因为细胞每当被感染后就启动重新合成3Cpro蛋白。由于这个动力学过程尚不完全清楚, 所以辉瑞研究者决定同时研发可逆的和不可逆的抑制剂, 不局限于不可逆抑制剂。

3.3 含有羟甲基酮片段的可逆性抑制剂

基于化合物18与SARS CoV-1 3Cpro的共晶结构的分析, 氰基苯甲酰基已不复存在, 是由于亚甲基碳与Cys135的巯基形成C-S共价键结合时氰基苯甲酰基为离去基团, 酮基与酶骨架的Gly143和Cys145 NH形成氢键网络, 起催化作用的His41经咪唑环上的N-H与结构水形成氢键, 水分子又同时与Asp187的侧链和Asp176骨架上的羰基形成氢键网络将抑制剂固定在活性部位。然而根据组织蛋白酶(cathepsin) 与含有羟甲基酮片段的抑制剂的晶体结构特征, 巯基并没有与亚甲基形成共价键(羟基的亲电子性弱于氰基苯甲酰氧基), 羟基只是与His41形成氢键。此外, P2处的亲脂性有利于同底部的疏水腔结合。分子模拟显示, S2部位(R1) 可容纳直链、叉链或环状的烷基, 例如表 3列出的化合物23、26~28显示有较好的抑酶活性, 但平面性的苯环(29) 活性弱。25的R2为甲基, 比相应的R2为氢原子的24活性弱20倍, 这是由于失去了NH参与同S2处Gln189发生氢键结合的缘故, 同时N-CH3也改变了帽基4-甲氧基吲哚的空间取向。

Table 3 SAR of the compounds with different substituent at the peptide skeleton. a: SARS CoV-1 infected Vero 76 cells

表 324的活性最强, 对酶抑制活性IC50 = 4 nmol·L-1, 抗病毒感染细胞的活性EC50 = 5 μmol·L-1。酶与细胞活性之差上千倍, 提示24的过膜性较差, 是由于分子中极性基团和氢键因素多, 以及感染的细胞外排作用强的缘故。

3.4 化合物24与SARS CoV-1 3Cpro的结合特征

化合物24是抑酶活性最强的化合物, 24与SARS CoV-1 3Cpro的共晶结构分析, 以及后来测定的24与SARS CoV-2 3Cpro的共晶结构(这是本文最关注的) 表明, 二者的结合方式是相同的, 原因是这两个蛋白酶与底物蛋白的结合位点是相同的(底物被裂解的部位的氨基酸序列相同)。图 4a是24与SARS CoV-1 3Cpro晶体结构的X-射线衍射图, 图 4b是24与CoV-2蛋白酶结合的模式图。

Figure 4 a: Cocrystal structure of the covalent adduct of 24 bound to SARS CoV-2 3Cpro. b: Sketch of binding mode of compound 24 in the binding site

24中的亲电基团羟甲基酮的羰基与3Cpro的Cys145的巯基发生亲电加成形成四面体的甲醇(carbinol) 结构, 该羟基与Cys145骨架上的NH形成氢键, 醇基还通过结构水分子与Gly143的NH形成氢键。P1′的亚甲羟基与催化中心的二元体(dyad) 之一His41形成氢键。P1处的内酰胺环进入S1的疏水腔中。24的两个酰胺的NH作为氢键给体与His164和Gln189形成氢键, P2处吲哚环上的NH与Glu166形成氢键, 异丁基与疏水腔发生疏水相互作用。

3.5 里程碑化合物PF-00835231

化合物24对SARS CoV-1 3Cpro的抑制活性IC50 = 4 nmol·L-1, 对SARS CoV-2 3Cpro的活性更强, IC50 = 0.27 nmol·L-1, 后者对于研制抗COVID-19病毒药物是个里程碑分子。24对包括组织蛋白酶在内的多种蛋白酶的活性很弱, IC50大于10 μmol·L-1 (数据从略), 提示对SARS CoV病毒具有高选择性, 在血浆内是稳定的, 体内清除率很低, 溶解性尚可, 遂以代号PF-00835231拟进入临床研究, 后因SARS疫情消失而终止了研发。然而, PF-00835231却成为研制COVID-19的新冠肺炎药物的开端(Hoffman RB, Kania RS, Brothers MA, et al. Discovery of ketone-based covalent inhibitors of coronavirus 3CL proteases for the potential therapeutic treatment of COVID-19. J Med Chem, 2020, 63: 12725-12747)。

4 化合物24的优化

化合物24有较高的抗病毒活性, 对SARS CoV-2 3Cpro蛋白酶的结合常数Ki = 0.271 nmol·L-1, 对COVID-19病毒感染的Vera 76细胞的半数最大有效浓度EC50 = 231 nmol·L-1。然而药代动力学的过膜吸收性很差(Papp < 0.207×10-6 cm·s-1); 动物口服生物利用度F值仅为1.4%, 口服剂量在胃肠道的吸收率(Fa × Fg) 只有3.3%。因而下一步结构优化的方向是保持或提高抗COVID-19病毒活性的前提下, 改善化合物的过膜性和生物利用度。优化的切入点是减少氢键结合的数量, 降低分子的极性。

4.1 变换α-羟甲基酮片段

分子中氢键给体的数量越多, 口服生物利用度越小(Veber DF, Johnson SR, Cheng HY, et al. Molecular properties that influence the oral bioavailability of drug candidates. J Med Chem, 2002, 45: 2615-2623)。α-羟甲基酮作为半胱氨酸蛋白酶的共价结合的基团(巯基的迈克尔亲电基团) 可以变换为其他非氢键的弱亲电性基团, 例如前述的氰基(Chuck CP, Chen C, Ke ZH, et al. Design, synthesis and crystallographic analysis of nitrile-based broad-spectrum peptidomimetic inhibitors for coronavirus 3C-like proteases. Eur J Med Chem, 2013, 59: 1-6)。合成的化合物30 (表 4) 活性略有损失, 但大鼠口服生物利用度提高到F = 7.6%, 在胃肠道的吸收率Fa × Fg = 38%, 药代有了明显的提升。综合药效和药代的效果, 30未达到预期的标准。

Table 4 Structure evolution of the candidate compound and typical parameters. a: Papp from apical to basolateral direction was determined in Madin-Darby canine kidney-low efflux (MDCK-LE) cells; b: CLint refers to total intrinsic clearance obtained from scaling of half-lives of test compounds in NADPH-supplemented HLMs
4.2 羟甲基变换成苯并噻唑和减少骨架上的氢键

苯并噻唑的2-位酮基具有亲电性, 可与巯基发生迈克尔加成, 以此替换羟甲基酮减少氢键给体, 此外, 还用6, 6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷作为环状亮氨酸的模拟物, 可进入S2处的疏水腔中, 并减少了24中骨架上的肽键。设计合成的化合物31改善了过膜性, 但清除率很高, 加之抑制酶和感染细胞的活性显著降低, 实不可取。

4.3 帽基4-甲氧基吲哚的变换

化合物24的4-甲氧基吲哚环没有进入S2腔穴内, 这是活性低的原因之一。31的二甲基氮杂双环[3.1.0]己烷虽然进入了S2腔, 但缺少与Gln189形成氢键的因素, 为此将甲氧基吲哚换成带有甲磺酰胺和叉链烷基的片段(兼有形成氢键和疏水结合的因素), 化合物32的磺酰胺NH与Glu189形成氢键, 酶与细胞活性明显提高, 虽然过膜性降低但代谢稳定性和口服生物利用度有所提高, 尤其是提高了胃肠道的吸收率(Fa × Fg = 84%)。

或许磺酰胺的极性过强, 不利于过膜, 将甲磺酰基换成三氟甲基, 化合物33的抗感染细胞活性和过膜性、代谢稳定性和生物利用度以及胃肠道吸收率(F = 10%, Fa × Fg = 100%) 都超越了32

4.4 候选化合物的确定

基于药物化学的拼合原理, 再用氰基替换P1′处的苯并噻吩片段, 得到化合物34, 34抑制SARS-CoV-2 3Cpro蛋白和抗病毒感染细胞的活性都强于33。34的分子量MW = 499.53, 33的分子量MW = 621.67, 降低了120 Da, 34除过膜性略逊于33外(因为分子整体的亲脂性降低了), 药代动力学的其他行为都优于33。遂将34确定为候选化合物定名为尼马曲韦(nirmatrevir)。

为了确定34与酶的结合方式, 将SARS-CoV-2 3Cpro酶蛋白分别与34和前述的不可逆抑制剂22 (Ki = 2 nmol·L-1) 温孵30 min, 培养液稀释后测定酶活性显示, 34仍保持 > 50%的酶活性, 而22的活性全无, 证明34的氰基与Cys145发生的共价结合是可逆性的加成反应。图 5显示了34与SARS CoV-1 3Cpro的活性中心结合的方式(Owen DR, Allerton CMN, Anderson AS, et al. An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science, 2021, 374: 1586-1593)。

Figure 5 Reversible covalent Cys145 adduct is formed with the nitrile substituent in compound
4.5 尼马曲韦的生物学特征

为了进入临床试验, 对34进行了广泛深入的生物学研究, 内容列入表 5

Table 5 Highlight of biological property for candidate 34
5 尼马曲韦的批准和帕洛韦的上市

COVID-19引起的新冠肺炎持续流行到2022年, 由阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、德尔塔(delta) 数度变异成奥密克戎(omicron) 多位点突变株, 两年来疫情持续不断, 除预防性接种疫苗外, 患者亟需特异性治疗药。辉瑞在十多年前研究SARS治疗药的基础上, 针对新冠病毒的SARS-CoV-2 3Cpro酶蛋白进行深入研究, 在不到两年的时间完成了临床试验和规模制备。为了降低34在体内被CYP3A4的氧化代谢, 以延长尼马曲韦在体内的抗病毒时程, 将低剂量(100 mg) 的CYP3A4抑制剂利托那韦(35, ritonavir) 与本品(2×150 mg) 复合口服用药, 取名为帕洛韦(paxlovid), 每日服用两次, 持续5天, 用于治疗非住院、具有发展成重度疾病的高风险成人COVID-19的病毒感染。2021年12月美国FDA批准辉瑞对帕洛韦的紧急授权申请, 成为治疗COVID-19新冠肺炎的首创性药物。

新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

本刊在2020年2月发表了瑞德西韦的案例, 当时处于疫情暴发初期, 由同情用药进行了III期临床研究, 实属应急之需。结果表明, 瑞德西韦对防治新冠肺炎的效果并不理想, 本品Paxlovid是FDA批准的第一个治疗COVID-19感染的药剂, Paxlovid是由首创药物尼马曲韦和已上市的药物利托那韦的复方药, 尼马曲韦是辉瑞公司用不到两年时间创制出针对COVID-19的特异性靶标SARS COV-2 3Cpro蛋白酶的抑制剂, 得益于十多年前研制SARS药物积累的成果和经验, 针对新冠病毒的特征量体裁衣式地演化出全新作用机制的口服药物, 并与小剂量的CYP450抑制剂利托那韦配伍, 提高了治疗效果。丰富的研发经验和娴熟的技术运用, 得以在短时间内创制出全球亟需的口服用药。

(新药发现与研究实例简析)