2021, Vol. 56
失眠是影响身心健康的一大重要问题[1]。据统计, 全世界至少有6%的人遭受失眠和睡眠紊乱的困扰[2]。临床上常用镇静催眠类化学药治疗失眠, 但该类药物不良反应强, 依赖性高, 并存在戒断反应[3], 因此, 不良反应小、疗效好的中药越来越受到人们的关注。
复方酸枣仁汤是治疗失眠的经典名方, 张仲景《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》[4]记载“虚劳虚烦不得眠, 酸枣仁汤主之”。该方剂临床疗效显著, 沿用至今。复方酸枣仁汤由酸枣仁、知母、茯苓、川芎、甘草五味药组成, 方中酸枣仁养血补肝, 为君药; 茯苓安神通阴, 知母滋阴润燥、清热除烦, 二者共为臣药; 川芎调肝血疏肝气, 为佐药; 甘草和中缓急, 调和诸药, 为使药[5], 各药味相辅相成, 能够起到养血补肝, 治疗失眠的功效。
复方酸枣仁汤成分繁多, 目前含量测定指标的选取未能很好地揭示药物与靶点、疾病之间的关联性, 不能体现中药复方“多靶点、多通路”的作用特点[6], 因此, 本研究采用HPLC-Q-TOF MS/MS法鉴定了复方酸枣仁汤的化学成分, 采用网络药理学方法建立了“化学成分-疾病靶点”相关性网络[7], 预测了复方酸枣仁汤的药效物质, 并根据传统水提取方法, 建立了基于药效物质的高效、快速的含量测定方法, 为复方酸枣仁汤质量评价体系的完善提供参考。
材料与方法仪器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ (美国安捷伦公司)-Q-TOF 5600 (AB Sciex公司)、Agilent 1290 Infinity Ⅱ (美国安捷伦公司); PeakViewTM v 1.1软件(AB Sciex公司); AB135-S十万分之一天平(Mettler TOLEDO仪器有限公司); DZTW电子调温加热套(北京市永光明医疗仪器有限公司); TDZ24 WS低速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); EYELA N-1100型旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社); SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂); KQ-300E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
试剂 酸枣仁皂苷A (批号CHB191210); 酸枣仁皂苷B (批号CHB190125); 斯皮诺素(批号CHB171011); 6'''-阿魏酰斯皮诺素(批号CHB180324); 知母皂苷BⅡ (批号CHB18115); 新芒果苷(批号CHB160910); 芒果苷(批号CHB160628); 阿魏酸(批号CHB180206); 洋川芎内酯A (批号CHB180615); 洋川芎内酯Ⅰ (批号CHB170926); 甘草苷(批号CHB180608); 甘草酸(CHB170606); 芹糖甘草苷(批号CHB180109)。所有的对照品均购自成都克洛玛生物有限公司, 含量质量分数均不低于98.0%。纯净水(杭州娃哈哈有限公司); 乙腈(色谱纯, 美国Fisher有限公司); 甲酸(色谱纯, 天津市博迪试剂有限公司); 甲醇(色谱纯, 美国Sigma-Aldrich公司); 磷酸(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司)。
材料 酸枣仁、知母、茯苓、甘草饮片均由某企业提供, 川芎饮片购自沈阳市各大药房, 所有饮片均由沈阳药科大学中药学院王东教授鉴定, 分别为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子、百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎、伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。
化学成分鉴定色谱条件 色谱柱: Aglient Zorbax Eclipse Plus C18 (150 mm × 4.6 mm, 3.5 μm); 流动相: 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B); 流速为1.0 mL·min-1, 柱温30 ℃, 梯度洗脱, 洗脱程序: 0~3 min, 7%~9% B; 3~8 min, 9%~15% B; 8~16 min, 15%~20% B; 16~28 min, 20%~55% B; 28~38 min, 55%~70% B; 38~48 min, 70%~90% B; 48~51 min, 90% B。进样量: 5 μL。
质谱条件 采用AB Sciex Q TOF系统, 离子源为电喷雾离子源(ESI源); 检测方式为正、负离子检测; 离子喷雾电压为-4 500 V和5 000 V; 离子源温度: 550 ℃; 雾化气(N2) 压力: 55 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 辅助气(N2) 压力: 55 psi; 气帘气(N2) 压力: 35 psi; TOF MS模式下扫描范围为m/z 100~1 500 Da; 去簇电压(DP): 60 V (正离子)/-60 V (负离子); 碰撞能(CE): 10 V (正离子)/-10 V (负离子); TOF MS/MS模式下扫描范围为m/z 100~1 000 Da; 去簇电压(DP): 60 V (正离子)/-60 V (负离子); 碰撞能(CE): 35 V (正离子)/-35 V (负离子)。
对照品溶液的制备 分别取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素、知母皂苷BⅡ、芒果苷、新芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷13种对照品适量, 用甲醇溶解, 摇匀配制成浓度均为25 μg·mL-1的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备 将收集的酸枣仁、知母、茯苓、川芎、甘草多批饮片按复方酸枣仁汤处方比例, 随机组合成10批次样品。精密称取各味饮片于圆底烧瓶中, 加入8倍体积的水, 浸泡80 min, 加热回流30 min, 采用七号药筛滤过。向药渣中继续加入6倍体积的水, 加热回流25 min, 滤过, 合并两次滤液, 减压浓缩至0.83 g·mL-1 (生药材), 即得复方酸枣仁汤。精密量取复方酸枣仁汤2.0 mL于10 mL量瓶, 加入甲醇适量, 超声20 min, 放冷, 定容, 摇匀, 4 000 r·min-1离心5 min, 取上清, 过0.22 μm微孔滤膜, 取续滤液即得。
按照上述色谱条件和质谱条件, 进样分析, 通过与对照品保留时间、高分辨准分子离子及碎片离子等信息进行比对, 并参考文献, 进行结构鉴定。
网络药理学分析流程 通过查阅文献, 在已鉴定出来的化合物中, 寻找复方酸枣仁汤组方饮片水提入血成分, 作为潜在的活性成分。通过PubChem[8]查询潜在活性成分的3D结构, 导入PharmMapper数据库[9]预测成分的靶点(仅选择“人源基因”)。通过GeneCards数据库和OMIM数据库, 以“insomnia”和“sleepless”为关键词, 搜索与失眠有关的靶点。成分靶点与疾病靶点取交集得到共同靶点, 将这些共同靶点视为复方酸枣仁汤治疗失眠的关键靶点, 利用Cytoscape 3.7.2软件[10]构建“化学成分-疾病靶点”网络并进行通路富集分析, 筛选药效物质。
UHPLC法测定6种药效物质UHPLC色谱条件 色谱柱: Waters Cortecs T3 (2.1 mm × 150 mm, 1.6 μm); 流动相: 0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B); 流速为0.3 mL·min-1, 柱温30 ℃, 梯度洗脱, 洗脱程序: 0~3 min, 7%~8% B; 3~8 min, 8%~8.5% B; 8~13 min, 8.5% B; 13~16 min, 8.5%~9% B; 16~20 min, 9% B; 20~23 min, 9%~10% B; 23~27 min, 10%~11% B; 27~40 min, 11%~15% B; 40~55 min, 15%~17% B; 55~60 min, 17%~19% B; 60~62 min, 19%~22% B; 62~66 min, 22%~90% B。进样量1 μL, 检测波长275 nm。
混合对照品溶液的制备 分别取新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素对照品适量, 精密称定, 用甲醇溶解、稀释定容, 配制成质量浓度分别为386.9、271.9、44.32、28.74、93.15和33.87 μg·mL-1的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备 按照“化学成分鉴定”项下“供试品溶液的制备”方法, 制备供试品溶液。
缺味对照溶液的制备 按照“化学成分鉴定”项下“供试品溶液的制备”方法, 分别制备缺少酸枣仁饮片、缺少知母饮片、缺少川芎饮片的缺味对照溶液。
系统适用性 取混合对照品溶液, 按照“UHPLC色谱条件”, 连续进样6次, 记录理论塔板数(n)、相邻色谱峰的分离度(R)、各色谱峰信噪比、拖尾因子、计算各待测成分峰面积的RSD。
分析方法验证专属性 分别取混合对照品溶液、供试品溶液、各缺味对照溶液, 按照“UHPLC色谱条件”, 进样分析, 比较色谱图。
线性与范围 分别精密量取上述混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0和7.5 mL置于10 mL量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 将这5种溶液及“混合对照品溶液的制备”项下的溶液作为标准系列溶液。按照“UHPLC色谱条件”进样分析, 记录峰面积。
检测限和定量限 取混合对照品溶液, 用甲醇进行逐步稀释, 以信噪比为3∶1和10∶1为参考, 配制溶液, 分别测得各化合物的检测限和定量限。
稳定性 取供试品溶液, 4 ℃放置, 分别于0、2、4、8、12和24 h进样分析, 计算各待测成分峰面积的RSD。
精密度 精密量取同一批复方酸枣仁汤1.0、2.0和3.0 mL, 按“化学成分鉴定”项下“供试品溶液的制备”方法, 制备低、中、高3个浓度的供试品溶液, 每一种浓度平行制备3份, 按照“UHPLC色谱条件”进样分析, 计算各成分含量, 并计算RSD, 作为重复性实验。精密量取同一批复方酸枣仁汤2.0 mL, 按“化学成分鉴定”项下“供试品溶液的制备”方法, 每天制备相同浓度的供试品溶液3份, 平行制备3天, 按照“UHPLC色谱条件”连续3天进样分析, 计算各成分含量, 并计算RSD, 作为中间精密度实验。
准确度 取已知各待测成分含量的复方酸枣仁汤9份, 精密量取1.0 mL, 分别按约为已知含量的50%、100%和150%等3个水平加入对照品, 制备低、中、高3种不同浓度的供试品溶液, 每一种浓度平行制备3份, 按照“UHPLC色谱条件”进样分析。计算各待测成分的平均回收率及RSD。
耐用性 分别考察色谱条件在不同进样体积(0.9、1和1.1 μL), 不同检测波长(274、275和276 nm), 不同体积分数的磷酸溶液流动相(体积分数为0.09%磷酸溶液、体积分数为0.10%磷酸溶液和体积分数为0.11%磷酸溶液), 不同柱温(29、30和31 ℃) 的条件下, 测定待测成分的含量, 并计算不同条件的RSD。
含量测定 分别取混合对照品溶液, 按供试品溶液制备方法制备10批不同批次饮片提取的复方酸枣仁汤供试品, 按“UHPLC色谱条件”进样分析, 记录各待测成分峰面积, 采用外标法计算各待测成分的含量。
结果 1 化学成分鉴定在复方酸枣仁汤中初步鉴定了103个化合物, 通过与对照品保留时间、高分辨准分子离子及碎片离子等信息进行比对, 准确鉴定了13个化合物, 所有化合物的质量误差均小于5.0×10-6。鉴定结果及成分信息如表 1[11-18]所示。对103个化合物的来源进行归属[16-18], 发现有27个化合物来源于酸枣仁, 14个来自知母, 5个来自茯苓, 20个来自川芎, 33个来源于甘草, 化合物100、101、102、103为酸枣仁和甘草两种饮片的共有成分。
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Table 1 Identification of 103 chemical compounds in Compound Suanzaoren Decoction by HPLC-Q-TOF MS/MS. aIdentified with reference standard. SZR: Ziziphi Spinosae semen; ZM: Anemarrhenae Rhizoma; FL: Poria; CX: Chuanxiong Rhizoma; GC: Glycyrrhizae Radix et Rhizoma |
依据实验室的前期研究成果[13]以及文献报道, 在已鉴定的化合物中查找到入血成分27个, 如表 2[19-26]所示, 每种成分选取排名靠前的35个靶点。以“insomnia”和“sleepless”为关键词, 得到与失眠有关的靶点5 052个。成分靶点与疾病靶点取交集得到156个关键靶点, 将27个入血成分及关键靶点导入Cytoscape 3.7.2, 构建“化学成分-疾病靶点”的可视化网络, 该网络有183个节点, 460条边, 如图 1所示。图中绿色菱形代表关键靶点, 粉色圆形代表入血成分。针对关键靶点进行通路富集分析, 筛选P < 0.01的通路, 最终富集到49条信号通路, 如图 2所示。选取度值高于24的6个成分作为复方酸枣仁汤的药效物质对其进行质量控制, 它们依次为新芒果苷(28)、芒果苷(27)、洋川芎内酯Ⅰ (27)、斯皮诺素(26)、6'''-阿魏酰斯皮诺素(25)、阿魏酸(25)。
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Table 2 Degree and source of 27 compounds found in blood |
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Figure 1 The "component-target" network of Compound Suanzaoren Decoction |
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Figure 2 Pathways based on KEGG pathways analysis |
结果显示按新芒果苷峰计, 理论塔板数(n) 均大于4.2×104, 相邻色谱峰的分离度(R) 均大于1.5, 各色谱峰信噪比(S/N) 均大于10, 拖尾因子均介于0.95~1.05之间。新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素峰面积的RSD分别为0.8%、0.8%、0.8%、0.6%、0.9%、1.0%, 表明仪器的精密度良好。
4 分析方法验证 4.1 专属性通过对比混合对照品溶液、供试品溶液、缺味对照溶液, 结果显示, 新芒果苷、芒果苷来自知母, 阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ来自川芎, 斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素来自酸枣仁, 该方法专属性良好, 阴性溶液无干扰。典型色谱图见图 3。
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Figure 3 UHPLC chromatogram of test solution of Compound Suanzaoren Decoction (A); UHPLC chromatogram of negative solution: negative control sample of Compound Suanzaoren Decoction without Ziziphi Spinosae semen (B); negative control sample of Compound Suanzaoren Decoction without Chuanxiong Rhizoma (C); negative control sample of Compound Suanzaoren Decoction without Anemarrhenae Rhizoma (D). 1: Neomangiferin; 2: Mangiferin; 3: Ferulic acid; 4: Senkyunolide Ⅰ; 5: Spinosin; 6: 6'''-Feruloylspinosin |
以各对照品质量浓度(μg·mL-1) 为横坐标(x), 以峰面积A为纵坐标(y), 绘制标准曲线, 计算回归方程。新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素在考察范围内线性关系良好, 相关系数均大于0.999 0, 结果见表 3。
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Table 3 Results of linearity test |
结果显示, 新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素的检测限质量浓度分别为0.201 5、0.504 5、0.372 2、0.191 9、0.284 7和0.188 9 μg·mL-1, 各成分定量限质量浓度分别为0.604 6、0.756 8、0.744 5、0.383 8、0.569 4和0.377 9 μg·mL-1, 表明方法灵敏度良好。
4.4 稳定性新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素峰面积的RSD分别为1.6%、1.4%、2.0%、1.6%、1.4%和1.6%, 各成分在24 h内稳定(RSD < 2.0%)。
4.5 精密度重复性实验中新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素含量的RSD分别为2.1%、1.2%、1.1%、0.8%、1.1%、1.3%, 表明方法重复性良好(RSD < 3.0%)。中间精密度实验中各成分含量的RSD分别为0.6%、0.8%、1.0%、0.5%、0.7%和1.2%, 表明方法中间精密度良好(RSD < 3.0%)。
4.6 准确度测得新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素的平均回收率在104.2%~108.9%, RSD均不高于2.1%, 表明方法准确度良好。
4.7 耐用性各色谱条件下, 新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素含量的RSD均不超过2.5%, 表明方法耐用性良好。
5 含量测定结果测得10批复方酸枣仁汤中新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素的含量, 结果如表 4所示。
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Table 4 The content results of 6 compounds in ten batches |
实验研究表明, 失眠与体内神经递质如5-HT (5-羟色胺)、NO (一氧化碳)、GABA (γ-氨基丁酸) 等密切相关[27]。5-HT是引发睡眠的重要神经递质, 中缝核内的5-HT能神经元分泌的5-HT与快眼动睡眠时间成正比[28]。研究发现, 长期使用地西泮治疗失眠, 能够使神经活性配体-受体相互作用信号通路显著变化, 证明该通路和失眠存在很强相关性[29]。本研究网络药理学中通路富集分析结果最显著的是5-羟色胺能突触通路, 其次是神经活性配体-受体相互作用通路, 这与文献报道结果吻合。除此之外, 富集得到的通路还包含TNF信号通路、多巴胺能信号通路、cAMP信号通路、钙信号通路等。因而推断复方酸枣仁汤治疗失眠可能是多通路协同作用。
网络药理学中“成分-靶点-通路”相互作用不但可以预测中药复方制剂治疗疾病的机制, 还能够辅助中药复方制剂中有效成分的筛选[30-32]。有研究表明, 6'''-阿魏酰斯皮诺素能够不同程度地改变大鼠的自主活动、入睡数量和睡眠时间[33], 斯皮诺素能够作用于5-HT1A, 增强戊巴比妥钠诱导的小鼠的翻正反射丧失[34]。阿魏酸能够提高脑内5-HT的浓度[35], 影响大脑活动, 诱导睡眠。通过“化学成分-疾病靶点”网络, 推测这些化合物促进睡眠作用的发挥可能是通过作用于MAOB、PTGS1、PTGS2等靶点参与5-羟色胺能通路。大量研究发现, 细胞因子能够调节睡眠[36]。长期失眠的患者由于细胞内的炎症反应, 体内细胞因子发生明显变化, 例如IL-6、TNF-α等明显增加, 导致睡眠质量下降[37], 而芒果苷、新芒果苷、洋川芎内酯Ⅰ可以通过调节MAPK8、CASP3、MMP3、PIK3CG等靶点参与TNF信号通路, 发挥抗炎作用[38-40], 从而改善睡眠质量。这体现了中药复方“多成分、多靶点、多通路”的作用特点, 同时也为复方酸枣仁汤药效物质的选择提供了依据。
《中华人民共和国药典》2020年版[41]并未收载复方酸枣仁汤相关制剂, 只对单味饮片含量测定指标进行了规定, 酸枣仁、知母、川芎饮片中非皂苷类成分含量测定的指标分别为斯皮诺素、芒果苷和阿魏酸, 本研究依据“化学成分-疾病靶点”网络分析结果, 从质量控制指标的选择原则和实际操作出发, 选取了酸枣仁中的斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素, 知母中的新芒果苷和芒果苷, 川芎中的阿魏酸和洋川芎内酯Ⅰ这6种度值大于24的药效物质对其进行含量测定。所建立的UHPLC法能够高效、简单、快速地完成对10批复方酸枣仁汤中6种药效物质的含量测定, 为基于药效的复方酸枣仁汤的质量评价提供了依据。
作者贡献: 王茜主要进行了本文的选题与设计、方法建立、实验数据处理、撰写文章等。杨肖在前期方法摸索及数据处理方面提供了帮助。张倩对本文的实验思路、方法建立提供了指导。李清对本文选题与设计、实验思路、方法建立及文章修改提供了宝贵意见。
利益冲突: 无任何利益冲突。
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