药学学报  2021, Vol. 56 Issue (11): 3074-3081 DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0509 |
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, HUA Zi-chun1,2,3
肺癌是最常见的一种癌症死亡原因, 主要分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) 和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC) 两种类型, 其中NSCLC所占比例高达85%[1]。NSCLC的预后较差, 5年生存率在4%~17%之间变化[2, 3]。NSCLC分为3种亚型, 其中肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD) 占40%~70%, 是临床最主要的肺癌, 早期不易察觉, 大多数患者在确诊时已经处于中晚期阶段或出现转移性疾病[4, 5]。早期肺癌的临床治疗手段多以手术切除为主, 中晚期则以化疗和免疫治疗为主[6-8]。但临床上的肿瘤化疗药物对患者缺乏基因个性化治疗, 所以本文主要阐述对患者基因个性化治疗, 进而调整用药方案和剂量, 更加合理地针对每个个体。
依托泊苷(etoposide, VP16) 是鬼臼毒素的半合成衍生物, 作为最早发现的拓扑异构酶Ⅱ抑制剂之一, 是治疗多种癌症类型的一线化疗药物, 包括肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、卵巢癌、胃癌和急性髓细胞性白血病等。VP16可以与拓扑异构酶Ⅱ、DNA形成三元复合物, 阻碍DNA修复, 从而诱导细胞死亡[9]。但是VP16对心脏、血液和胃肠道存在明显的毒副作用, 限制了其在临床上的应用, 目前研究人员主要通过将依托泊苷与顺铂、紫杉醇、沙利度胺等其他化疗药物联用, 或降低细胞耐药性, 或优化药物递送的方法, 提高药物的靶向性以减轻其毒副作用[9-14]。
Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain, FADD) 是肿瘤坏死因子受体家族介导的细胞凋亡途径中的受体蛋白, 它通过自身的死亡结构域(death domain, DD) 募集到死亡受体(death receptors, DRs), 如Fas和肿瘤坏死因子受体1 (tumor necrosis factor receptor-1, TNF-R1), 然后通过其死亡效应结构域(death effector domains, DED) 募集下游的半胱氨酸蛋白酶, 形成诱导死亡的信号复合物(death-inducing signaling complex, DISC), DISC可以触发半胱氨酸蛋白酶级联反应致使细胞死亡[15]。除了在细胞凋亡中的经典功能以外, FADD还参与了多种非细胞凋亡的过程, 如细胞周期、增殖、基因表达的调节、代谢途径的控制和免疫等[16, 17]。FADD的非细胞凋亡功能大多数都独立于DRs, 并且由FADD的亚细胞定位以及磷酸化状态决定[18]。此外, 近年来有研究显示FADD的表达水平还与多种癌症的预后相关, 如FADD磷酸化水平与T细胞淋巴母细胞淋巴瘤的不良预后相关[19]; FADD表达上调是手术切除的肺腺癌患者的独立不良预后因素[20, 21]。
为探究FADD表达水平与肺癌细胞对凋亡诱导剂敏感性的关系及其机制, 本研究构建了FADD敲除的A549细胞, 在细胞水平上探究了FADD KO对A549细胞生长、增殖、迁移以及细胞对依托泊苷诱导凋亡的敏感性变化。结合GEPIA数据库得到的Kaplan-Meier (KM) 生存曲线分析, 初步判定LUAD患者的FADD基因表达水平较低时, 对化疗药物的敏感性增加, 有利于患者的预后。
材料与方法质粒 Lenti-CRISPR-v2-FADD质粒和Lenti-CRISPR-v2质粒来自本实验室保存。
细胞系 野生型非小细胞肺癌细胞株A549细胞, 来自ATCC细胞库。细胞复苏后, 用RPMI1640 (含10% FBS+1%青链霉素混合液) 培养基培养, 置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养12 h后更换培养基。当细胞生长至70%以上时, 消化传代, 进行后续实验。
主要试剂 依托泊苷、青链霉素混合液100× (江苏凯基生物技术股份有限公司); 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)、嘌呤霉素、CCK-8 (cell counting kit-8)、胰酶消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA)、Western blot及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司); RPMI-1640培养基(上海生工生物工程有限公司); Polyjet (Invitrogen公司) 胎牛血清(FBS, 美国Gibco公司); 细胞级二甲基亚砜(DMSO, 上海索莱宝生物科技有限公司); BCA protein assay kit、EndoFree plasmid midi kit (康为世纪生物科技有限公司); BSA (南京生兴生物技术有限公司); 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(29∶1; 30% m/v) (上海捷瑞生物工程有限公司); ECL发光液(上海天能科技有限公司); 碘化丙啶PI (Sigma公司); Annexin Ⅴ为本实验室纯化; anti-FADD抗体(Abcam公司); anti-β-actin、anti-cleaved-caspase-3 (cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3)、anti-cleaved-caspase-9、anti-BCL2 (B-cell lymphoma 2)、anti-c-Raf (raf proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)、anti-p-ERK (extracellular signal-regulated kinase of phosphorylation)、anti-MMP2 (matrix metalloproteinase 2) (美国Cell Signaling Technology公司); HRP-鼠二抗、HRP-兔二抗(南京翼飞雪生物科技有限公司)。
主要仪器 CO2恒温细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific公司); 台式普通离心机、台式低温冷冻离心机(Eppendorf公司); 倒置光学显微镜(Carl Zeiss AG公司); 酶标仪(多功能TECAN公司); NovoCyte流式细胞仪(艾森生物公司); 凝胶成像仪(Tanon公司)。
构建FADD敲除的A549细胞株 分别将Lenti-CRISPR-v2-FADD质粒和Lenti-CRISPR-v2质粒转化到Stabl3感受态细胞中, 在LB培养基中扩大培养, 提取质粒用于后续的转染实验。在6孔板中接种3×105个野生型A549细胞, 待细胞生长至70%时, 利用转染试剂Polyjet分别将Lenti-CRISPR-v2-FADD质粒和Lenti-CRISPR-v2质粒转染到野生型A549细胞中, FADD基因的sgRNA序列如表 1所示。转染24 h后加入2 μg·mL-1嘌呤霉素, 继续培养48 h, 进行抗性筛选。将筛选后存活的细胞在不含嘌呤霉素的培养基中培养, 通过Western blot鉴定转染的Lenti-CRISPR-v2-FADD是否表达。若已经表达, 则在96孔板中进行单细胞克隆筛选, 待细胞在96孔板中生长至90%时, 选择其中的单细胞克隆转到6孔板中培养, 后续通过Western blot检测基因敲除结果。
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Table 1 The sgRNA primer sequences of Fas-associated death domain protein (FADD) gene |
CCK-8法检测细胞活力 胰蛋白酶消化并收集对数生长期的control A549细胞和FADD KO A549细胞, 以每孔9×103个的细胞量接种到96孔板中。细胞贴壁后更换培养基, 分别加入10、20、50和100 μg·mL-1依托泊苷, 每组设置6个复孔, 每个浓度设置不同的作用时间, 分别为0、12、24、48 h。作用相应时间后, 更换为150 μL含10% CCK-8的新鲜培养基, 在培养箱中避光孵育, 期间采用双波长(450和650 nm) 检测各组吸光值, 计算细胞存活率。
| $ \begin{array}{l} {细胞存活率}\left({\%}\right)=\\ \;\;\;\;\frac{{\left({A}_{450}-{A}_{650}\right)}_{{实验组}}-{\left({A}_{450}-{A}_{650}\right)}_{{空白组}}}{{\left({A}_{450}-{A}_{650}\right)}_{{对照组}}-{\left({A}_{450}-{A}_{650}\right)}_{{空白组}}}\times 100{\%} \end{array}$ |
划痕实验检测细胞的平面迁移能力 将control A549细胞和FADD KO A549细胞以3×105个/孔分别接种到6孔板中, 待细胞生长至90%及以上时, 用200 μL枪头在底部画出“井”字形状的互相垂直的4条线, 然后用PBS轻轻洗去漂浮细胞, 加入用无血清RPMI 1640培养基配制的浓度分别为10、20、50和100 μg·mL-1 VP16, 并于0、24、48 h的3个时间点拍照取样, 测量划痕距离并计算迁移率。
| $ {迁移率}\left({\%}\right)=\frac{{划痕宽度}\left(0{ \;{\rm{h}}}\right)-{划痕宽度}\left(24{ \;{\rm{h}}}\right)}{{划痕宽度}\left(0{ \;{\rm{h}}}\right)}\times 100{\%} $ |
流式细胞术检测细胞凋亡 将control A549细胞和FADD KO A549细胞以3×105个/孔的细胞密度分别接种到6孔板中, 当细胞处于对数生长期时, 加入浓度为10、20、50和100 μg·mL-1 VP16, 作用24 h后, 收集细胞, PBS溶液洗涤2次, 用500 μL结合缓冲液重悬细胞沉淀, 每管加入2 μL Annexin Ⅴ染液, 冰上避光孵育30 min, 在检测前加入2 μL PI染液, 轻轻混匀后, 用流式细胞仪检测。
Western blot实验检测蛋白表达 收集10、20、50和100 μg·mL-1 VP16处理24 h后的两种细胞, PBS溶液洗涤3次以去除残留的培养基。根据收集的细胞量加入适当的细胞裂解液, 冰上裂解40 min, 提取细胞总蛋白, BCA法检测蛋白浓度。每个样品取30 μg在SDS-PAGE胶中进行电泳分离。电泳完成后, 冰上转膜, 条件为300 mA、90 min。将转膜后的PVDF膜置于PBST溶液配制的5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。根据抗体说明书配制相应一抗溶液, 将封闭好的PVDF膜放在一抗溶液中, 4 ℃过夜孵育或室温孵育4~6 h。一抗孵育完毕后, 室温在摇床上用PBST溶液洗膜, 洗膜完毕后, 在摇床上室温孵育二抗1 h, 用PBST洗去未与一抗结合的二抗后, 利用化学发光法在凝胶成像仪上曝光。
统计学分析 所有实验数据均用
有研究通过对头颈部鳞状细胞癌和肺ADC患者的样本组织进行免疫组织化学分析发现, FADD表达上调在这两种疾病中可作为一种独立的不良预后生物标志物[21, 22]。基于此, 本研究利用GEPIA对TCGATM数据库统计分析, 探究FADD表达水平对肺腺癌患者生存情况的影响。结果显示, 高表达FADD基因的肺腺癌患者生存期较短(图 1)。由此可推测, FADD基因高表达可作为LUAD的一种不良预后生物标志物。
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Figure 1 The association between FADD expression and overall survival in patients with lung adenocarcinoma (LUAD). P < 0.001, high-FADD expression group vs low-FADD expression group. TPM: Transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads |
Western blot实验结果证实, 构建的FADD KO A549细胞中FADD表达水平极低(图 2A)。倒置显微镜下观察FADD KO A549细胞形态与control A549细胞无显著差别(图 2B)。CCK-8法检测FADD KO A549细胞和control A549细胞的细胞活力, 结果显示: 在24 h后, FADD敲除后会抑制细胞活力(P < 0.05, 图 2C)。流式细胞仪检测control A549细胞和FADD KO A549细胞在24和48 h时的凋亡情况, 结果显示FADD敲除后A549细胞在48 h的凋亡明显增加(P < 0.05, 图 2D、F)。细胞划痕实验显示: 在24 h时, control A549细胞和FADD KO A549细胞之间的迁移率无显著性差异; 在48 h时, control A549细胞的迁移率显著大于FADD KO A549细胞, 提示FADD敲除后A549细胞迁移率降低(P < 0.01, 图 2E、G)。
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Figure 2 The effect of FADD knockout (KO) on viability, apoptosis and migration of A549 cells. A: Knockout efficiency was validated by Western blot; B: Comparison of morphology between FADD KO A549 cells and control; C: The effect of FADD knockout on viability of A549 cells was detected by the cell counting kit-8 (CCK-8) assay; D: The effect of FADD knockout on apoptosis of A549 cells was detected using Annexin V/PI staining; E: The effect of FADD knockout on migration of A549 cells was detected using the scratch wounding assay; F: Quantitative results of (D); G: Quantitative results of (E). |
依托泊苷作为一种广泛用于治疗多种癌症的一线化疗药物, 同样也被用于治疗非小细胞肺癌, 因此本实验选用依托泊苷作为治疗药物来探究FADD敲除后对A549细胞药物敏感性的影响。
不同浓度(10、20、50、100 μg·mL-1) 的VP16作用24 h后CCK-8法检测细胞活力, 结果显示VP16可抑制control A549细胞和FADD KO A549细胞的活力, 且FADD KO A549细胞对VP16更加敏感。VP16浓度在100 μg·mL-1时对FADD KO A549细胞活力抑制率在60%左右, 而对control A549细胞活力抑制率在25%左右(P < 0.001, 图 3A)。
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Figure 3 The effects of FADD knockout on etoposide (VP16)-induced apoptosis in A549 cells. A: Comparison in viability between FADD KO and control A549 cells stimulated with VP16 at indicated concentrations for 24 h; B: Comparison in sensitivity to VP16-mediated apoptosis between FADD KO and control A549 cells; C: Quantitative results of (B). |
不同浓度(10、20、50、100 μg·mL-1) 的VP16作用24 h后, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况, 结果显示VP16可诱导control A549细胞和FADD KO A549细胞凋亡, 但FADD KO A549细胞对VP16的敏感性显著增加。100 μg·mL-1 VP16作用时, FADD KO A549细胞的凋亡率在22%左右, 而control A549细胞的凋亡率在6%左右, 二者相比, 差异具有统计学意义(图 3B、C, P < 0.01)。
通过细胞划痕实验检测不同浓度(10、20、50、100 μg·mL-1) 的VP16作用后, control A549细胞和FADD KO A549细胞的平面迁移能力, 考虑到药物作用48 h时细胞几乎全部死亡, 所以选择分别在0和24 h拍照取样, 结果显示(图 4A): 在VP16作用24 h后, FADD KO A549细胞的迁移率拟合直线的斜率小于control A549细胞(图 4B, P < 0.05), 即VP16可以一定程度地抑制control A549细胞的平面迁移能力, 显著抑制FADD KO A549细胞的平面迁移能力(图 4C)。
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Figure 4 The role of FADD in regulating VP16-attenuated migration in A549 cells. A: FADD KO and control A549 cells were treated with VP16 at indicated concentrations for 24 h, and then cell migration was detected and compared using the scratch wounding assay; B: Quantitative results of (A). In the presence of VP16, the migration rate of FADD KO A549 cells has a smaller slope than that of control A549 cells. KFADD KO A549=-0.220 3, Kcontrol A549=-0.124 1; C: Quantitative results of (A). Intra-group comparison of control A549 groups and FADD KO A549 group. |
Western blot检测VP16作用24 h后control A549细胞和FADD KO A549细胞中凋亡相关蛋白BCL2、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的蛋白水平, 结果显示: control A549细胞和FADD KO A549细胞中BCL2蛋白水平下调, cleaved-caspase-9蛋白水平上调, 且VP16对FADD KO A549细胞中BCL2和cleaved-caspase-9蛋白水平的影响更加显著; 当VP16浓度为100 μg·mL-1时FADD KO A549细胞的cleaved-caspase-3蛋白水平显著性上调, 而control A549细胞的cleaved-caspase-3蛋白水平无显著性变化(图 5)。
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Figure 5 The role of FADD in regulating the apoptotic pathways activated by VP16 treatment. A: FADD KO and control A549 cells were stimulated with VP16 at indicated concentrations for 24 h, and then the expression level of B-cell lymphoma 2 (BCL2), cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 9 (cleaved-caspase-9), and cleaved-caspase-3 was detected by Western blot; B-D: Quantification data normalized to β-actin. |
Western blot检测VP16作用24 h后control A549细胞和FADD KO A549细胞中增殖相关蛋白c-Raf和p-ERK的蛋白水平, 结果显示: VP16均能抑制两株细胞中c-Raf和p-ERK的蛋白水平, 且对FADD KO A549细胞中c-Raf和p-ERK的蛋白水平的抑制效果更加显著(图 6)。
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Figure 6 The role of FADD in regulating raf proto-oncogene serine/threonine-protein kinase (c-Raf) and extracellular signal-regulated kinase of phosphorylation (p-ERK) expression with the presence of VP16. A: FADD KO and control A549 cells were stimulated with VP16 at indicated concentrations for 24 h, and then the expression level of c-Raf and p-ERK was detected by Western blot; B, C: Quantification data normalized to β-actin. |
Western blot检测VP16作用24 h后control A549细胞和FADD KO A549细胞中迁移相关蛋白MMP2的蛋白水平, 结果显示: VP16均能抑制两株细胞MMP2蛋白水平, 且对FADD KO A549细胞中MMP2的蛋白水平抑制效果更加显著(图 7)。
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Figure 7 The role of FADD in regulating matrix metalloproteinase 2 (MMP2) expression with the presence of VP16. A: FADD KO and control A549 cells were stimulated with VP16 at indicated concentrations for 24 h, and then the expression level of MMP2 was detected by Western blot; B: Quantification data normalized to β-actin. |
肺癌是全球癌症相关性死亡的主要原因之一, 占所有癌症相关性死亡的20%左右, 肺腺癌作为非小细胞肺癌中的主要亚型, 由于其确诊时多处于中晚期阶段, 给临床治疗增加了难度, 目前的治疗手段多为化疗药物联用、纳米颗粒递送药物以及免疫疗法等, 但这些手段的目的在于降低药物毒副作用, 是对所有患者广泛适用的, 并未涉及对患者进行基因个性化治疗。根据前人提出的FADD基因表达水平在头颈部鳞状细胞癌和T细胞淋巴母细胞淋巴瘤等多种肿瘤中可作为不良预后的生物标志物[19, 22], 本文旨在探索FADD基因表达水平能否为肺腺癌患者治疗提供基因个性化治疗指标。本文通过构建FADD KO A549细胞表征FADD基因低表达, control A549细胞表征FADD基因高表达, 利用临床上用于治疗肺癌的化疗药物——VP16作用FADD KO A549细胞和control A549细胞, 从凋亡、增殖和迁移3个方面探究FADD KO A549细胞和control A549细胞之间的差异, 以及二者对VP16的敏感性, FADD KO A549细胞表现出凋亡增加、增殖与迁移减弱、对VP16更加敏感的现象。
FADD作为肿瘤坏死因子受体家族介导的细胞凋亡途径的受体蛋白, 募集下游的caspase-8, caspase-8自剪切形成活化的caspase-8, 启动下游的半胱氨酸蛋白酶级联反应, 活化的caspase-8也可以切割促凋亡的BCL2蛋白家族的Bid蛋白, 截断的Bid转移至线粒体, 促进细胞色素C的释放, 进而导致caspase-9和caspase-3被激活。线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径之间存在交叉, 本文检测到VP16作用FADD KO A549细胞和control A549细胞后, cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表现为浓度依赖性增加, 提示VP16激活了线粒体凋亡途径, 且当FADD基因敲除后, 即当死亡受体凋亡途径受到限制后, A549细胞在面对内源性凋亡诱导剂VP16时, 表现出更强的凋亡效果。
FADD的经典功能是介导细胞外源性凋亡信号的转导, 促进细胞凋亡, 所以可以合理地假设FADD能够抑制癌细胞的增殖和存活。但实际上, FADD在不同癌症中的表达水平是不同的, 比如FADD在急性髓细胞性白血病患者的白血病细胞中表达下调, 而在肺癌、头颈部鳞状细胞癌、喉癌、咽癌以及卵巢癌和乳腺癌中均上调。有研究显示在胰腺癌细胞中敲除FADD后会抑制其增殖, 表明FADD是胰腺癌细胞增殖所必需的; 且FADD敲除后的胰腺癌细胞对化疗药物多柔比星的敏感性增强[23]。FADD-/- T淋巴细胞也表现为细胞周期停滞和细胞增殖被抑制的现象[24]。细胞的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 级联反应是调节多种细胞过程(包括增殖、分化、凋亡、迁移和应激反应) 的关键信号通路, 其中ERK信号通路与细胞增殖和分化密切相关, 也是研究最为深入的MAPK信号通路[25, 26]。本研究发现, VP16能够抑制ERK信号通路中c-Raf和p-ERK的蛋白水平, 且VP16对FADD KO A549细胞中c-Raf和p-ERK的蛋白水平抑制程度更加显著, 提示FADD基因敲除后, VP16对A549细胞的增殖抑制作用更加显著, 具体机制还有待进一步研究。
研究发现, 在脑内皮细胞中利用siRNA敲低FADD的表达水平后, 其迁移能力被抑制, 提示FADD与细胞迁移之间存在关联[27]。MMP是钙依赖性的含锌內肽酶, 参与细胞外基质降解, 是细胞迁移和转移过程中主要分泌的蛋白酶。MMP2作为MMP中的一员被认为可以增强细胞迁移[28]。本文结果显示VP16能够抑制MMP2的表达, 从而降低A549细胞的迁移能力, 并且FADD KO A549细胞表现出对VP16更显著的敏感性。
结合GEPIA数据库得到的KM生存曲线分析, 本研究结果显示, FADD的表达水平可能影响LUAD患者对化疗药物VP16的敏感性, FADD表达水平下调可提高VP16对A549细胞的增殖抑制、凋亡诱导和迁移抑制, 提示LUAD患者的FADD表达水平较低时, 使用同样的治疗手段, 在排除患者自身其他疾病因素的情况下, 患者的存活率更大一些。FADD表达水平有可能作为LUAD患者的一种不良预后生物标志物。
作者贡献: 华子春负责课题的总体设计; 郭婉霜和郑伟娟负责实验设计; 郭婉霜进行具体实验、数据分析和文章撰写; 宋琬晨、詹明杰参与Western blot实验; 田静和陈露参与划痕实验; 郑伟娟和华子春负责稿件修改。
利益冲突: 本文的研究内容不涉及任何利益冲突。
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表1(Table 1)