2021, Vol. 56
2. 中国科学院大学, 中国科学院上海药物研究所, 上海 201203
2. University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences Shanghai Institute of Materia Medica, Shanghai 201203, China
甲基化是生物体非常普遍的修饰模式, 可发生在DNA、RNA和蛋白质上。利用这一简单的修饰模式, 生物体可以极大地拓展核苷酸、氨基酸的种类, 从而增加基因、蛋白质的多样性, 实现经济高效的精确调控。蛋白甲基化是研究较为充分的蛋白翻译后修饰的方式, 一般发生于赖氨酸和精氨酸的侧链。在2012年的一篇综述中, Arrowsmith等[1]这样描述: 蛋白的甲基化是一种动态的、可逆的翻译后修饰形式, 其甲基化调控的整个过程主要涉及三大类蛋白, 包括可以“写入”修饰的蛋白甲基化转移酶、“擦除”修饰的蛋白去甲基化酶和“阅读”修饰的甲基化识别蛋白。甲基转移酶将甲基从S-腺苷蛋氨酸(SAM) 转移到相应赖氨酸或精氨酸残基上, 而去甲基化酶则可通过FAD辅酶或者通过铁离子催化的方式氧化去除甲基, 二者活性的平衡控制着蛋白的甲基化状态[2, 3]。而蛋白甲基化识别蛋白一般包含多个结构域, 它们通过甲基化识别结构域来解读甲基化的信号, 再通过其他结构域传递信号给下游的蛋白或执行相应的催化功能。正是通过这三类蛋白的协同调控, 细胞可实现甲基化信号的传递, 从而对细胞的多个过程进行精确的调控。
蛋白甲基化修饰可呈现不同的修饰状态, 如图 1所示, 赖氨酸甲基化可具有单甲基化(Kme1)、双甲基化(Kme2) 和三甲基化(Kme3) 三种, 而精氨酸甲基化具有单甲基化(Rme1)、对称双甲基化(Rme2s) 以及不对称双甲基化(Rme2a)[4]。
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Figure 1 Methylation states of lysine and arginine in histones |
不同于组蛋白乙酰化修饰, 甲基化不改变氨基酸侧链的形式电荷, 仅仅改变体积、电荷分布以及亲脂性。甲基化识别蛋白可识别不同状态的甲基化修饰, 从而发挥精确调控功能[4]。随着研究的深入, 人们发现甲基化识别蛋白与多种癌症的发生发展密切相关[5, 6], 例如: HP1α (heterochromatin protein) 是一种通过染色质域介导特异性识别甲基化H3K9的甲基化识别蛋白[7], 其有α、β、γ三种亚型) 的下调与乳腺癌细胞高侵袭潜能有关[8-10]; HP1α下调也在甲状腺乳头状癌[11]、成神经管细胞瘤[12]中被发现。这些研究表明甲基化识别蛋白是一类潜在的药物靶标。
随着人类基因组和蛋白组学研究的进展, 目前对于甲基化识别蛋白已有较为深入的了解。其中, 甲基化赖氨酸识别结构域包括MBT (malignant brain tumor domains) 结构域、染色质(chromodomains) 域、Tudor结构域、PWWP (proline-tryptophan-tryptophan-proline domains) 结构域、PHD (plant homeodomain fingers) 结构域、WD40 (WD40 repeat domains) 结构域、ANK (ankyrin repeats) 结构域、BAH (bromo adjacent homology domains) 结构域[13, 14]。这些结构域可识别不同甲基化程度的赖氨酸, 在某些蛋白中的Tudor结构域[13, 15]和WD40结构域[16, 17]也可识别甲基化的精氨酸残基。从结合模式上分析, 这些甲基化识别结构域一般是通过2~4个芳香残基形成的“芳香笼”来精确识别甲基化的赖氨酸残基, 甲基化赖氨酸结合位点附近的氨基酸残基也通过控制构象变化等方式进一步提高识别的特异性[4] (图 2)。
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Figure 2 The pattern of action of the recognition domain of methylation proteins |
本文将根据识别蛋白的抑制剂研究进展并按照识别结构域的类别选择代表性蛋白进行介绍。结合蛋白-抑制剂的复合物晶体结构, 简要分析抑制剂的结合模式, 并特别关注了相关抑制剂的发现历程, 希望为后续抑制剂设计提供参考。
1 染色质域及其抑制剂人源染色质域蛋白HP1于2001年首次被发现可与组蛋白上的甲基化赖氨酸结合[18, 19]。目前在人类基因组中已确认有29个含染色质域的蛋白。该结构域的抑制剂研发集中于两个蛋白家族: HP1和多梳蛋白家族(chromobox, CBX蛋白)。其中HP1结合H3K9me3[19], 而CBX蛋白特异性识别H3K27me3[20], 两者均主要参与基因的表达抑制调控过程。通过已解析的晶体结构可知染色质域的芳香笼口袋稍浅, 这使其成为一个极具挑战性的小分子药物靶标。与多肽的相互作用分析显示, 三甲基化的赖氨酸残基占据芳香笼并与周围残基的芳香环形成多个阳离子-π相互作用, 其主链可以和蛋白质结合槽之间形成多个特异性的氢键[21, 22], 从而实现底物选择性。
CBX7是研究比较充分的多梳蛋白, 它通过染色质域特异性识别H3K27me3。CBX7与多种癌症息息相关, 例如: CBX7的高表达可引发并加速淋巴瘤的发生, 并与原癌基因Myc协作产生侵袭性淋巴瘤[23]; CBX7的过表达与卵巢透明细胞腺癌(clear cell adenocarcinoma of the ovary, OCCA) 的不良预后有关, 且CBX7的敲除能够诱导OCCA细胞的凋亡[24]。
第一个CBX7抑制剂是通过改造与CBX7有较强结合的多肽获得的。2014年Simhadri等[25]根据CBX7的相互作用蛋白SETDB1结合界面的三甲基化肽段(RQVAVKme3STRGFALKme3STHGIAIKme3STN, Kd=1.2 μmol·L-1, PDB: 4X3S) 进行简化, 合成只有5个氨基酸的短肽(Ac-FALKme3S-NH2), 该短肽对CBX7有一定的活性(IC50=12 μmol·L-1)。如图 3所示, 其与蛋白的晶体结构(PDB: 4MN3) 显示肽段与蛋白的结合主要是通过三甲基化赖氨酸和组成芳香笼的芳香残基之间的阳离子-π相互作用来介导; 三甲基化赖氨酸残基邻近的丝氨酸残基与CBX7蛋白的Gln3之间形成了氢键作用, 通过水分子介导与Gln3和Glu2之间酰胺键的NH形成氢键相互作用, 增强了与蛋白的结合; 体积较小的丙氨酸残基插入CBX7蛋白一个小的疏水区域, 使这个短肽衍生物具有较强的亲和性及选择性。通过进一步的分子优化, 他们发现在短肽的N端添加疏水性芳香基团, 可将活性提升40倍左右。最后他们得到具有百纳摩尔活性的拟肽类化合物1 (图 4, Kd ≈ 200 nmol·L-1)。
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Figure 3 The binding interactions of Ac-FALKme3S-NH2 in CBX7 complex |
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Figure 4 The design strategy of CBX7 peptidomimetic inhibitors |
为了克服化合物1三甲基化赖氨酸侧链季铵盐膜渗透性差的问题, Stuckey等[26]选择叔胺和仲胺作为电子等排体, 开展优化, 期望获得具有较好细胞渗透性的CBX7抑制剂, 化合物2 (UNC3866) 的改造策略如图 4。他们发现采用二乙基赖氨酸残基的拟肽对CBX7的结合能力与化合物1相当。随后, 他们对N端的疏水基团进行优化, 得到化合物2 (Kd=97 nmol·L-1, PDB: 5EQ0)。2在后续的生物评价中也表现出较好的抗细胞增殖活性。该研究不仅得到具有较好细胞活性的化合物, 还证明了三甲基赖氨酸季铵盐并不是三甲基化赖氨酸识别结构域抑制剂的必要片段, 为后续相关抑制剂的开发提供了宝贵的经验。
2014年Ren等[27]通过高通量筛选得到非肽类选择性的CBX7抑制剂3 (MS452, Ki=33.1 μmol·L-1)。根据CBX7-MS452复合物的晶体结构(PDB: 4X3T, 图 5左) 可以看出: 双甲氧基苯环将Trp35外推以占据由Phe11、Trp32、和Trp35构成的芳香笼; 哌嗪环夹在Phe11和Trp32之间, 形成“夹心”堆积作用; 连接二甲氧基苯与哌嗪环的羰基氧可以通过水介导与His5形成氢键相互作用。将形成芳香笼的Phe11、Trp35或Tyr39突变为Ala后发现, 突变体CBX7不能与3结合, 证明芳香笼对于3的结合是必不可少的。他们通过序列比较, 分析了3具有较高选择性的原因: 在HP1蛋白中, Trp35变成了共轭体系更小的Phe, 而Phe的苯环与双甲氧基苯形成π-π共轭作用相对较弱; 在CBX7的其他同族蛋白中, Tyr39、Val13和His47由其他氨基酸代替, 导致3与相应蛋白的结合能力显著下降。
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Figure 5 The binding interactions of MS452 (3, left), MS351 (5, right) and CBX7 |
在后续工作中, 他们通过结构生物学研究发现甲苯与二甲氧基苯采取不同构象时化合物与蛋白结合模式有显著变化。如图 6所示, 当甲苯与二甲氧基苯采取反式构象的时候, 两个羰基的氧原子通过水分子介导分别与His5和Tyr39形成氢键相互作用(图 6左); 当采取顺式构象的时候, 甲苯向内“插入”蛋白中, 破坏了β-折叠, 不利于与蛋白的结合(图 6右)。由此他们猜测引入与CBX7额外的氢键或疏水作用来稳定反式构象, 可能会提高配体的亲和力。他们对甲苯进行衍生化, 其中化合物4 (图 7, MS508)[28]的活性与3相比有较大的提升(Ki=4.8 μmol·L-1)。但所合成的化合物的细胞活性均很差。因此, 他们进一步考虑替换化合物的母核。他们通过筛选得到包含亚氨基苯并咪唑结构的化合物5 (MS351)[28], 其与CBX7的晶体结构(PDB: 5EJW, 图 5右) 显示: 亚氨基苯并咪唑核心占据着芳香笼, 与Phe11形成π-π堆积作用; 亚氨基苯并咪唑垂直于Trp32的吲哚环, 增加了5与芳香笼的相互作用强度; 连接部分的羟基与Thr41、Glu43形成氢键相互作用。实验证明, 5可以有效诱导小鼠ES细胞和人前列腺癌PC3细胞中包括p16INK4a在内的CBX7靶基因的转录去抑制。
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Figure 6 The binding interactions of 3 and CBX7 complex with toluene and dimethoxylbenzene in different conformations (left, cis; right, trans) |
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Figure 7 The optimization process from 3 to 5 |
另外CBX6也有拟肽类抑制剂[29]报道, 由于篇幅有限, 本文不做赘述。
2 MBT域及其抑制剂MBT结构域存在于L3MBT蛋白和多疏蛋白中, 主要识别单甲基化和双甲基化的赖氨酸残基。该结构域有以下特点: ① MBT结构域由高度保守的芳香残基(Phe、Tyr、Trp) 和亲水基团(Asp) 形成芳香笼, 亲水残基还可以与甲基化赖氨酸残基的NH形成氢键相互作用; ②配体“插入”深而窄的亲水腔, 与蛋白结合, 所以Kme1/Kme2与蛋白的结合能力要强于Kme0/Kme3。
在恶性脑肿瘤的遗传学研究中, SCML2L3 (一种多梳蛋白)、L3MBTL2和L3MBTL3的MBT域在髓母细胞瘤中纯合缺失[30]。L3MBTL1、L3MBTL3和血液恶性肿瘤有关[31-33], L3MBTL4在乳腺癌患者中被证明是失调的[34]。尽管相关蛋白与癌症的联系、相关抑制剂及其结合的模式都有报道, 但人们对其在体内的复杂作用机制知之甚少。
2011年, Herold等[35]报道了第一个靶向L3MBTL1蛋白的MBT结构域的小分子抑制剂, 该抑制剂也是针对赖氨酸甲基化识别结构域所报道的第一个小分子抑制剂。他们基于H4K20Me2与L3MBTL1复合物的共晶结构, 设计、合成了拟肽类衍生物。构效关系研究发现采用四氢吡咯环修饰的赖氨酸侧链来模拟二甲基化的赖氨酸残基能提高化合物的结合活性。他们得到活性较优的拟肽化合物6 (图 8, Kd=37 μmol·L-1); 进一步简化拟肽结构得到化合物7 (Kd=26 μmol·L-1) 和8 (Kd=25 μmol·L-1); 将连接部分改造成哌啶环, 得到化合物9 (UNC669), 活性提高了约5倍(Kd=5 μmol·L-1)[36]。9与L3MBTL1复合物的晶体结构(PDB: 3P8H, 图 9左) 显示吡咯烷的N质子化后与芳香笼形成阳离子-π共轭作用, 分子中的NH还可以与Asp355形成氢键。
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Figure 8 The optimization for modifying peptidomimetic structure 6 to compound 13 |
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Figure 9 The binding interactions of UNC669 (9, left), UNC1215 (10, right) with L3MBTL3 |
尽管到目前为止还没有研究表明MBT结构域可以与组蛋白多价结合, 但在9种人源蛋白中存在重复的MBT结构域[37], James等[38]猜测MBT结构域可能通过多价结合的方式与底物结合。为此, 他们设计了“双碱”类化合物, 得到化合物10 (UNC1215, Kd=0.12 μmol·L-1, 图 9右和图 10) 和11 (UNC2533, Kd=0.062 μmol·L-1)[39]。UNC1215-L3MBTL3复合物的晶体结构(PDB: 4FL6) 显示: 苯胺间位的吡咯烷深埋进L3MBTL3的MBT Ⅱ结构域; 苯胺邻位的吡咯烷与第二分子L3MBTL3的MBT Ⅰ结构域在其表面结合; 另外一分子的10采用上述结合方式, 交叉形成2-2的二聚物。他们通过选择性评价发现, 虽然L3MBTL1和L3MBTL3同源性很高, 参与结合芳香笼的结构以及氨基酸序列几乎一样, 但10对L3MBTL3的活性要比对L3MBTL1高100倍以上, 这是因为10和L3MBTL1采取单价的结合模式。在细胞水平, 10也有较好的增殖抑制能力, 后续的生物学评价表明10是一个较理想的L3MBTL3探针分子。他们的工作提出多价结合的模型, 并证明了靶向同一识别蛋白的多个结合口袋策略的有效性。后续他们在10的基础上, 又引入异二氢吲哚环得到化合物12 (UNC1679), 经过构效关系探索, 得到了选择性更高的化合物13 (Kd=0.35 μmol·L-1)[40]。
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Figure 10 The pattern of 2-2 dimer formed with 10 and L3MBTL3 |
Tudor结构域蛋白是人类基因组中一个相对较大的蛋白家族, 由41个成员组成。Tudor结构域具有50~60个氨基酸基序的共性序列, 可作为衔接蛋白和招募蛋白形成蛋白-蛋白相互作用, 促进多蛋白复合物的形成[41]。它们在RNA代谢、组蛋白修饰、DNA损伤修复过程中都发挥着重要作用[42]。Tudor结构域主要识别甲基化赖氨酸残基, 但在TDRD3、SMN、SPF30和Spindlin1蛋白中可识别甲基化精氨酸残基。
53BP1蛋白中含有串联的Tudor结构域, 它与H4K20me2结合, 从而影响DNA的损伤修复[43]; 同时其也可以与肿瘤抑制蛋白P53的K382me2[44]结合。敲除实验表明53BP1在发育、免疫应答和肿瘤发生中具有重要作用[45]。2014年, Perfetti等[46]通过对包含10种甲基化识别结构域的蛋白进行筛选得到具有较好选择性的53BP1 Tudor抑制剂14 (图 11, UNC2170, IC50=30 μmol·L-1)。该化合物对53BP1的活性比对其他甲基化赖氨酸识别蛋白要高至少17倍。其与53BP1 Tudor蛋白的晶体结构(PDB: 4RG2, 图 12) 显示; 酰胺的NH与Asp521可以形成氢键; 叔丁基胺锚定在赖氨酸结合口袋, 与内源性的赖氨酸甲基化的肽段竞争结合。与内源肽仅结合其中一个Tudor结构域不同, 该抑制剂同时与串联的两个Tudor结构域发生作用。通过结构优化研究, 他们发现连接部分的脂肪链替换为刚性基团会降低活性, 这可能是刚性连接子使叔丁胺偏离结合位点引起的。
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Figure 11 The chemical structures of 14 and 15, as well as the optimization strategy from 10 to 17 |
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Figure 12 The binding interactions of 14 and 53BP1 Tudor domain |
Spindlin1 (SPIN1) 含有3个Tudor结构域, 既可以识别甲基化赖氨酸残基, 又可以识别甲基化精氨酸残基。H3K4me3与SPIN1 Tudor Ⅱ结合, H3K4me3R8me2a则结合在SPIN1 Tudor Ⅰ口袋[47]。其中, 后者的结合还可以加强前者的结合能力。
2017年, Sweis等[48, 49]发现化合物15 (A366, G9a抑制剂) 对SPIN1有一定程度的抑制(IC50=190 nmol·L-1)。他们通过构效关系研究发现A366细微的结构变动都会导致对SPIN1活性的显著减少。他们随后通过蛋白微阵列筛选了50多个10 (L3MBTL3 MBT结构域选择性抑制剂) 类似物, 得到对酶谱扩大的化合物16 (EML405), 该化合物对SPIN1也有抑制作用。16与SPIN1蛋白复合物的晶体结构(PDB: 5JSG, 图 13左) 显示: 16的对称结构两端的哌啶环分别与两个Tudor结构域结合; 酰胺的羰基氧通过水分子介导与蛋白形成氢键; 在蛋白中, 苯胺所处位置还有较大的空腔未被占据。随后, 他们合成化合物17 (EML631)[50], 引入吡咯烷去占据带负电的口袋。等温滴定量热实验表明, 17的结合常数比16有所提高。从17与SPIN1的晶体结构(PDB: 5JSJ, 图 13右) 可以看出: 对称的四氢吡咯环分别占据了两个Tudor结构域的芳香笼; 苯胺的NH与蛋白通过水分子介导形成氢键; 酚醚的氧原子可以与Tyr177形成氢键; 苯胺侧链的四氢吡咯环占据了两个Tudor结构域中间的结合空腔, 且该环上的N原子与Asp173之间有静电相互作用。他们通过此改造大大提高了化合物对Tudor结构域相关蛋白53BP1、PHF20以及MBT相关蛋白L3MBTL1、L3MBTL3的选择性。
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Figure 13 The binding interactions of EML405 (16, left), EML631 (17, right) and Spindlin1 Tudor domain |
Xiong等[51]通过筛选表观遗传学化合物库, 得到对G9a、GLP有高活性, 对SPIN1也有微弱活性的化合物18 [图 14, UNC0638, IC50=3.2 μmol·L-1 (AlphaLISA), IC50=7.4 μmol·L-1 (FP)]。他们通过分子对接分析了化合物18与G9a蛋白以及与SPIN1的结合构象。对接结果显示: 吡咯烷侧链模拟H3K4me3与SPIN1 Tudor Ⅱ结构域结合; 4-氨基哌啶环结构伸出Tudor结构域; 喹唑啉环上的环己基似乎与蛋白没有任何直接相互作用。他们对化合物18进行了结构简化, 用二取代的苯环代替喹唑啉环, 保留其他结构, 得到化合物19。化合物活性提升了大约10倍[IC50=0.338 μmol·L-1 (AlphaLISA), IC50=0.741 μmol·L-1 (FP)]。他们用等温滴定量热法测试活性, 表明化合物19与SPIN1有较强的结合力(Kd=0.39 μmol·L-1), 但与G9a、GLP没有结合。他们用异二氢吲哚替换四氢吡咯环, 希望引入芳基增加化合物与芳香笼之间的π-π堆积作用, 得到化合物20 (MS31), 其活性相对于化合物21又提升了4倍左右[IC50=0.077 μmol·L-1 (AlphaLISA), IC50=0.243 μmol·L-1 (FP)]。等温滴定量热法实验结果说明化合物20不仅与G9a、GLP没有结合, 对SPIN家族的其他成员结合活性也较弱。化合物20与SPIN1的共晶结构(PDB: 6QPL, 图 15左) 确证了其和蛋白的结合模式与对接结果是一致的: 质子化异二氢吲哚的NH不仅与Tyr179形成氢键, 还与构成芳香笼的芳香残基有着阳离子-π作用; 异二氢吲哚的苯环与Trp151可以形成π-π堆积作用; 苯环上的两个苄胺的NH分别与SPIN1 TudorⅠ结构域的D95、SPIN1 Tudor Ⅱ结构域α-螺旋的D184形成氢键。
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Figure 14 The optimization strategies of 20 and 22 |
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Figure 15 The binding interactions of MS31 (20, left), VinSpinIn (22, right) with SPIN1 |
由于SPIN1 Tudor Ⅱ结构域可以通过与不对称H3R8me2的结合来加强Tudor Ⅰ结构域与H3K4me3的结合, Fagan等[52]猜想可以通过改造15与Tudor Ⅱ结构域结合的基团来增加活性。经过一轮结构优化研究, 他们发现将15的甲氧基变成位阻更大的烷氧基能够增加化合物对SPIN1和G9a的活性, 且对G9a活性的增加更为明显; 将螺环部分扩大不能增加对SPIN1的选择性; 将吡咯环部分改造成六元环胺或者非环状胺, 化合物活性都有下降; 将吡咯烷进行衍生化也不能提高活性; 但将吡咯烷改造成异二氢吲哚啉时, 显著增加了对SPIN1活性的同时, 降低对G9a的活性; 将螺环改成偕二甲基后, 化合物21 (IC50=0.38 μmol·L-1) 对SPIN1的活性基本保持, 而对G9a没有显示出抑制作用。他们受到之前SPIN1双齿配体报道的启发[50], 初步尝试引入疏水性的脂肪链作为连接子。但因连接子不够长, 化合物不能同时作用于串联的两个Tudor结构域。于是, 他们通过azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) 反应来引入三氮唑结构来控制连接子的长度, 经过新一轮优化后, 得到化合物22 (VinSpinIn)[52]。化合物VinSpinIn与SPIN1复合物的晶体结构(PDB: 6I8B, 图 15右) 显示在与Tudor Ⅱ结构域的结合模式保持不变的情况下, 新引入的四氢吡咯环占据Tudor Ⅰ结构域的芳香笼。虽然化合物VinSpinIn的分子质量很大, 但由于其有着较好的水溶性、稳定性以及膜透性, 该化合物仍是SPIN1蛋白的重要探针分子。
另外, Upadhyay等[53]基于2D-NMR技术的片段筛选方法获得了与KDM4A串联Tudor结构域特异性结合的化合物23 (图 16)。Mader等[54]筛选了包含252个分子的化合物库得到对SETDB1串联Tudor结构域只有较弱活性的片段, 经过一系列的结构优化工作, 最后得到具有中等抑制活性的化合物24。Senisterra等[55]也通过筛选得到UHRF1串联Tudor结构域抑制剂25 (NV03)。Liu等[56]通过片段筛选得到了靶向TDRD3 Tudor结构域精氨酸结合口袋的抑制剂26。
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Figure 16 The chemical structures of 23-26 |
PWWP结构域最早在WHSC1蛋白中被发现, 并因具有Pro-Trp-Trp-Pro基序而被命名PWWP结构域[57]。包含PWWP结构域的蛋白通常参与染色质相关的生物学过程, 如转录调控和DNA修复。PWWP结构域是一个包含100~150个氨基酸的基序, 其突变与多种人类疾病有关。结构研究表明, PWWP结构域具有保守的芳香笼用来识别组蛋白甲基化赖氨酸, 结合组蛋白或DNA, 这有助于其与核小体的结合和染色质定位。此外, PWWP结构域经常与其他组蛋白和DNA识别或修饰结构域协作, 影响表观遗传相关的调控过程[58]。
2019年, Böttcher课题组[59]利用饱和转移差-核磁共振波谱、差示扫描荧光测定法以及二维1H/15N横向弛豫优化核磁共振谱作为粗筛手段, 筛选了包含1 899个分子的片段库。他们确定了几个与NSD3 PWWP蛋白有结合的片段并获得了化合物27 (NMR, Kd=330 μmol·L-1, PDB: 6G25, 图 17左)、28 (NMR, Kd=650 μmol·L-1, PDB: 6G27, 图 17右) 与NSD3 PWWP复合物的晶体结构。之后, 他们通过虚拟筛选得到108个小分子片段, 其中与蛋白结合Kd值最高的化合物29 (SPR, Kd=160 μmol·L-1) 与蛋白的结合模式与化合物27、28相应的结合模式接近。以化合物29作为起始片段, 他们开展了结构优化工作, 最终得到具有较好选择性、细胞增殖抑制活性的第一个NSD3 PWWP结构域的探针分子30 (BI-9321; SPR, Kd=0.166 μmol·L-1)。30与蛋白的晶体结构(PDB: 6G2O, 图 18左) 表明: 苄胺与Glu318之间可以形成氢键相互作用; 甲基咪唑环占据芳香笼; 喹啉的N与Ser314形成氢键; 咪唑环上的甲基与芳香残基Trp284之间形成C-H-π共轭作用。
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Figure 17 The binding interactions of compound 27 (left), compound 28 (right) and NSD3 PWWP domain |
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Figure 18 The binding interactions of BI-9321 (30) and NSD3 PWWP domain (left), MR837 (34) and NSD2 PWWP domain (right) |
Ferreira等[60]采用ZMYND11 PWWP结构域(具有结构明确的甲基化赖氨酸结合袋, 被认为可用于代替PWWP结构域进行虚拟筛选) 虚拟筛选了大约2百万个可购买的小分子片段, 最后购买了其中39个分子来进行活性测试。他们通过表面等离子共振技术测试片段与NSD2 PWWP结构域的结合强度, 发现化合物31 (Kd=41 μmol·L-1, SPR, 图 19) 可以稳定N-端NSD2 PWWP蛋白。他们采用骨架跃迁的策略来优化化合物31的活性、选择性以及溶解度, 其中只有衍生化合物32 (Kd=175 μmol·L-1, SPR) 对蛋白表现出中等程度的结合。他们接着购买了一些化合物32的类似物, 探索构效关系, 最后发现苯甲腈的结构对于化合物与蛋白的活性至关重要。他们固定苯甲腈的结构, 又购买一些类似化合物, 并测得化合物33 (Kd=7 μmol·L-1, SPR) 的活性相比化合物32有了很大提升。化合物33不仅消除了手性中心, 也更容易衍生化。经过深入优化, 他们获得了NSD2 PWWP结构域第一个抑制剂34 (MR837, Kd=3.4 μmol·L-1, SPR)。化合物34与蛋白的共晶结构(PDB: 6UE6, 图 18右) 显示: 苯甲腈CN上的N原子与主链上Ala270 (Ala和Asp) 构成酰胺键的NH形成氢键相互作用; N-环丙基酰胺则是占据着芳香口袋; 噻吩环伸向蛋白内部, 与蛋白形成疏水相互作用。
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Figure 19 The optimization strategies of BI-9321 and MR837 |
PHD结构域蛋白家族由超过40种组蛋白识别蛋白组成, 主要识别组蛋白上甲基化的赖氨酸侧链, 以及未修饰的组蛋白[61]。生物学研究已经确定了依赖PHD结构域的组蛋白识别蛋白在染色质重塑复合物和转录编码中的功能。此外, PHD结构域家族成员Pygo、JARID1A和BAZ2A的表达水平升高与各种人类癌症的致癌基因有关, 包括结直肠癌[62]、急性髓细胞性白血病[63]和前列腺癌[64]。PHD结构域在不同类型癌症中的作用表明, 靶向PHD结构域的小分子具有作为新型治疗手段的潜力。
2012年, Wagner等[65]利用HaloTag技术测试了446个临床研究化合物对JARID1A PHD3结构域的活性, 发现双硫仑、胺碘酮(胺碘酮, 属Ⅲ类抗心律失常药, 是具有轻度非竞争性的α、β肾上腺素受体阻滞剂)、替加色罗这3个化合物与蛋白有较好的结合。他们对胺碘酮进行结构优化, 得到活性、选择性较好的化合物35 (WAG-003, 图 20)。在结构优化过程中, 他们发现胺碘酮的季铵盐结构对于和蛋白的结合至关重要。
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Figure 20 The optimization strategy of WAG-003 and the chemical structures of compounds Fr21 and CF4 |
同年, Amato等[66]通过片段筛选得到了靶向BAZ2A PHD结构域的化合物36 (Fr21)。2014年, Miller等[67]通过片段筛选得到苯并噻唑类衍生物, 可以特异性地结合到Pygo PHD结构域H3K4的结合位点。经过结构优化后, 他们得到化合物37 (CF4)。该化合物与蛋白的晶体结构(PDB: 4UP5, 图 21) 验证了他们的猜想: 氨基和Thr240、噻唑环的N和Asp380可以形成氢键相互作用; 苯并噻唑的苯环与Phe354、Ala332, 噻唑环的S与Thr359通过形成疏水相互作用, 提高对蛋白的结合能力。
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Figure 21 The binding interactions of compound CF4 (37) and Pygo PHD domain |
WD40结构域一般由4~16个包含色氨酸-天冬氨酸(WD) 基序组成的单元, 整体结构呈现典型β-折叠桶[68]。WD40结构域作为骨架蛋白, 参与许多生物过程, 包括染色质组装、细胞信号转导、细胞周期控制、RNA转录和免疫应答[69]。
PRC2 (polycomb repressive complex 2) 复合物包括3个核心的亚基: 组蛋白甲基转移酶EZH2 (enhancer of zeste homologue 2)、EED (embryonic ectoderm development) 蛋白和SUZ12 (suppressor of zeste 12) 蛋白, 其可以催化H3K27的甲基化[70]。其中, 具有WD40结构域的EED蛋白可以识别H3K27me3和招募其他蛋白形成PRC2复合物。针对EED蛋白已开展了较多的抑制剂研发工作, 其中进展最快的是诺华公司靶向EED蛋白的抑制剂MAK-683 (图 22), 现已进入临床Ⅱ期试验阶段。然而至今未见文献报道该化合物的研发历程, 本文对该公司已经披露的前期研究进行简要介绍。
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Figure 22 The optimization strategies of 40 and 45, and the chemical structure of MAK-683 |
2017年, 诺华公司从EED-H3K27me3出发通过高通量筛选得到具有较高活性的化合物38[71]。化合物38与蛋白复合物的晶体结构(PDB: 5H19, 图 23左) 显示: 5-位的氨基NH与Asn194、2-位的N与Lys211和Tyr365、3-位的N与Tyr148可以形成氢键相互作用, 且CN的N可以由水分子介导与Arg367形成氢键; 双环共轭体系与Tyr365、Tyr148之间通过形成π共轭作用增加化合物与蛋白的亲和力; 呋喃环与Tyr365可以形成edge-to-face共轭作用。通过对比化合物38、H3K27Me3与蛋白复合物的晶体结构, 他们发现化合物与Arg367、Trp364、Tyr365的结合会引起这几个残基构象的变化, 产生更大的结合口袋。他们发现化合物38的片段化合物39 (IC50=1.00 μmol·L-1) 活性与化合物38 (IC50=4.03 μmol·L-1) 相当, 且拥有更高的配体效率和亲脂效率。随后, 他们从化合物39出发开始SAR优化, 最后得到化合物40 (EED226, IC50=0.022 μmol·L-1)[72], 该化合物的活性得到明显提升。晶体结构(PDB: 5GSA, 图 23右) 表明: 化合物40、38与蛋白结合的模式类似; 对甲磺酰基苯可以提高π-π相互作用。
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Figure 23 The binding interactions of compound 38 (left), 40 (right) and EED WD40 domain |
在细胞水平, 化合物40可以特异性地抑制H3K27的甲基化。其还可以抑制PRC2复合物的催化活性并调控基因转录, 这一点与SAM竞争性的EZH2抑制剂的效果类似。小鼠口服给药(40 mg·kg-1, 32天) 可以有效诱导肿瘤的完全消退。在动物体内耐受性良好, 其对体重的影响有限, 没有明显的不良反应。在EZH2耐药的细胞模型中, 其仍可以有效抑制细胞增殖以及H3K27的三甲基化。耐药的EZH2突变一般通过广泛使用不同的SAM竞争性的EZH2抑制剂治疗, 40联合SAM竞争性EZH2的抑制剂可能提供一种更有效的癌症治疗策略[73]。
中等活性的化合物41 (IC50=2.5 μmol·L-1, PDB: 5H17, 图 24左), 考虑到合成的难易程度以及可优化的空间, 他们将化合物41解构, 来确定最小的药效团, 得到化合物42 (IC50=95 μmol·L-1, PDB: 5U5K)。他们随后在哌嗪环处引入胍基, 希望增强化合物与芳香笼形成的阳离子-π共轭作用, 得到化合物43 (IC50=2.1 μmol·L-1) 和化合物44 (IC50=3.9 μmol·L-1, PDB: 5U5T)。他们引入2-胺基咪唑环, 希望在降低化合物pKa值的同时, 保持其正电性。最后, 经过SAR优化后, 他们得到化合物45 (IC50=1.3 μmol·L-1, PDB: 5U5H, 图 24右)[74]。
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Figure 24 The binding interactions of compound 41 (left), compound 45 (right) and EED WD40 domain |
另外艾伯维的Curtin等[75, 76]针对EED蛋白通过高通量筛选得到化合物46 (Ki=600 nmol·L-1, PDB: 5U69, 图 25), 经过合理的SAR优化得到化合物47 (A-395, Ki=0.31 nmol·L-1, PDB: 5K0M)。其通过占据EED的H3K27me3口袋, 抑制PRC2复合物的活性。Western blot结果显示, GSK126 (SAM竞争性EZH2抑制剂) 和47对H3K27me3的调节活性相似[77]。
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Figure 25 The optimization strategies of compounds 47, 48, 49 and 51 and the chemical structure of EEDi-5285 |
研究表明, K116三甲基化的Jarid2 (jumonji, AT-rich interactive domain 2) 蛋白是EED的结合底物, 同时也是PRC2复合物的变构调节剂[78]。2017年Barnash等[79]利用组合化学和基于结构的优化策略从Jarid2-K116me3 (PDB: 4X3E) 出发得到拟肽48 (UNC5114, Kd=0.68 ± 0.05 μmol·L-1) 和49 (UNC5115, Kd=1.14 ± 0.14 μmol·L-1)。
2019年Read等[80]从专利报道的EED抑制剂(50) 出发, 获得其晶体结构, 了解其与蛋白的结合模式, 并合成衍生物。利用荧光偏振探针技术消除之前高通量筛选的假阳性化合物, 最终得到化合物51 (IC50=0.2 μmol·L-1)。
2020年Rej等[81]报道了他们的研究工作。他们基于化合物40 (IC50=17.6 nmol·L-1) 进行基于结构的设计与分子优化, 得到化合物52 (EEDi-5285, IC50=0.2 nmol·L-1, PDB: 6W7F)。在用KARPAS422细胞株进行的细胞增殖实验中, 化合物52 (IC50=0.5 nmol·L-1) 活性比化合物40 (IC50=180 nmol·L-1) 高出300多倍。
WDR5 (WD repeat domain 5) 作为WD40结构域的另一个重要成员, 也开展了较多的抑制剂研发工作。WDR5通过调控MLL1甲基转移酶复合物的形成, 调节H3K4的甲基化状态, 从而对染色质重塑和MLL1基因的表达产生影响[82], 因而被认为是重要的抗肿瘤药物靶点。针对WDR5蛋白, 目前已报道WDR5-MLL1的拟肽类[83-85]、非肽类小分子[86-89]抑制剂, 另外还有靶向WDR5 WBM位点的小分子抑制剂[90, 91]被报道。
7 总结本文对甲基化识别结构域及其抑制剂进行了简要介绍, 并对相关抑制剂的优化策略以及抑制剂与蛋白的结合模式进行了分析。综合上述多个识别结构域的研究结果, 总结如下:
甲基化赖氨酸识别结构域具有鲜明的结构特点: ①都具有由芳香环残基组成的芳香笼, 来结合并识别相应的甲基化赖氨酸残基; ②识别Kme0、Kme1和Kme2结构域的结合口袋一般很深, 此时, 疏水残基与内源肽形成的疏水相互作用将会有利于蛋白与组蛋白的结合; ③识别Kme3结构域的结合口袋一般较浅, 这时蛋白表面的亲水残基与内源肽形成的氢键相互作用将会对识别相应修饰不可或缺。
甲基化赖氨酸识别结构域抑制剂的优化策略主要包括: ①从与相应蛋白有较强活性的内源肽出发, 确定与蛋白结合的关键结构, 进行结构改造, 得到活性以及选择性有很大提高的拟肽类结构; ②通过筛选获得与蛋白有结合的小分子片段, 然后进行结构优化, 特别是根据小分子与蛋白复合物的晶体结构来进行结构改造, 快速获得活性较好的小分子化合物; ③通过叠合或者对接的方式来分析其他蛋白的抑制剂可能与蛋白的结合方式, 再通过分析蛋白间的序列不同之处, 来合理改造化合物并实现化合物活性的“靶点跨越”。
纵览抑制剂的结构特征, 可以发现一般需要包括4个结构模块与蛋白进行结合, 如图 26所示: 模拟甲基化赖氨酸残基的片段占据芳香笼; 极性基团与蛋白的亲水性残基形成氢键; 疏水性基团与蛋白的疏水残基形成疏水相互作用; 连接基团调整各个结合模块在蛋白中的位置。对于拟肽类抑制剂而言, 其主链就扮演着连接基团的角色; 有些抑制剂其他的结合模块则可能同时发挥着连接基团的作用。
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Figure 26 The schematic diagram of binding patterns of methylated lysine recognition domain inhibitors to proteins |
总之, 甲基化赖氨酸识别结构域作为一种新兴的表观遗传相关的潜在靶点, 有望在多种癌症的治疗中发挥作用。然而, 目前该领域的研究与蛋白甲基化转移酶等相比还远不成熟。希望本文的综述可以为后续靶向这类蛋白的药物开发提供基础, 促进该领域的研究。
作者贡献: 周理炜负责综述的文献资料收集和主要内容撰写, 绘制图表。樊甜甜、刘同超对综述的选题和内容框架提出了重要建议并撰写、修改了部分内容。吴小余教授、熊兵研究员对本文提出了重要的指导和修改意见。
利益冲突: 本文不涉及个人与组织利益冲突。
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