2021, Vol. 56
大多数小分子药物靶标的作用是通过占据靶标蛋白的活性中心, 抑制靶标功能而产生生物学效应, 这种作用特征被称作占据驱动的药物作用(occupy-driven drug action), 占据时间的长短决定药效的启动和持续时间, 占据型药物结合大都是可逆的, 可由结合热力学和结合动力学加以表征。共价结合药物也是化学计量地占据靶标活性位点, 因其结构中有亲电基团, 可与靶标的亲核性原子发生共价键结合, 构成不可逆性结合, 使靶标失去功能, 是杀敌一千、自损十百的占据驱动型作用。
另一类小分子药物是近来迅速发展的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs), 是利用细胞内蛋白酶体降解蛋白的功能, 将靶标蛋白彻底分解而摧毁其功能, 但在裂解之前靶标蛋白需经泛素化。PROTACs是双功能分子, 作为双配体由连接基相连分别募集靶蛋白和E3泛素连接酶, 从而引起靶蛋白的泛素化修饰, 导致目标蛋白被蛋白酶体识别而降解。人体有近600种E3连接酶, 目前知之和应用的不到10个。PROTACs通过招募目标蛋白和E3连接酶, 引起继发的降解过程, 而本身并不直接参与对靶标的降解, 是通过募集引发后继事件而呈现作用, 所以PROTAC称作事件驱动的药物作用(event-driven drug action), PROTACs犹如催化剂, 理论上没有消耗。
近期还发现一类被称为分子胶降解剂(molecular glue degrader) 的小分子, 也具有诱导靶蛋白降解的功能。分子胶降解剂是一类可诱导E3泛素连接酶底物受体与靶蛋白之间发生相互作用, 经泛素化被蛋白酶体降解的小分子。与PROTACs不同的是, 分子胶本身对E3泛素连接酶和靶蛋白具有双配体结构特征, 一身兼具同两个蛋白结合的功能, 促进两个蛋白发生泛素化, 这对那些非可药性靶标(undruggable targets) 以及蛋白-蛋白相互作用也可因之而降解。分子胶扩大了可药性蛋白靶标的范围, 分子胶降解剂是一类能够介导蛋白-蛋白相互作用并导致靶标蛋白裂解的小分子化合物。人们认为PROTACs是理性设计的产物, 分子胶裂解剂是幸运发现的, 其实后者是对那些偶然发现的药物经研究作用机制而揭示出的。确定化合物为分子胶包含了广泛的理性研究, 包括结构生物学、生物化学、生物物理学、谱学和基因变异组学(genetic variomics) 等。本文试对分子胶和分子胶降解剂作简要的讨论。
1 分子胶的发现和范例 1.1 天然药物的分子胶作用最早发现药物具有结合两个蛋白并引发生物效应的研究, 是哈佛大学的S. Schreiber等在1991年进行的。分析临床应用的免疫抑制剂, 环孢菌素A (1, cyclosporin A, CsA) 和他克莫司(2, tacrolimus, FK506) 分别属于环肽和大环内酯的结构类型, 结合的受体蛋白也不同, 分别是亲环素(cyclophilin) 和FK结合蛋白(FKBP), 但发现后继的分子机制却是相同的, 都结合钙调磷酸酶(calcineurin), 形成三元复合物, 钙调磷酸酶是依赖钙/钙调素的磷酸酶的催化亚基, 选择性地水解蛋白中丝/苏氨酸上的磷酸基。复合物CsA-cyclophilin与FK506-FKBP竞争性地与钙调磷酸酶结合, 各自形成的三元复合物抑制了钙调磷酸酶的功能, 从而抑制多种细胞因子如白细胞介素-2和γ干扰素的产生, 阻断T细胞活化, 而且抑制T细胞的增殖和白细胞介素-2受体的表达。在这里环孢菌素A和他克莫司犹如分子胶分别将各自的靶标蛋白与钙调磷酸酶“粘黏”在一起, 导致靶标的抑制, 这是最早被称作分子胶的药物。也就是说, 没有头孢菌素A或他克莫司的分子胶作用, 亲环素或FKBP等蛋白不能与靶蛋白钙调磷酸酶结合而受到抑制[1, 2]。
另一个具有免疫抑制作用的抗生素雷帕霉素(3, rapamycin) 也结合于FKBP, 用亲合色谱证明雷帕霉素-FKBP结合于称作哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白(mTOR), 后者是细胞生长和增殖的重要因子, mTOR的变异与肿瘤密切相关。一向认为非可药性靶标(undruggability) mTOR由于雷帕霉素介导生成的FKBP-rapa-mTOR三元复合物, 是雷帕霉素扮演了分子胶的角色, 抑制了mTOR的结果。
这3个天然抗生素虽然不是理性设计的, 却是以理性的思维和方法阐明了作为分子胶的功能。图 1是1~3的三元复合物晶体结构, 3个小分子如同多面胶, 介导了蛋白-蛋白相互作用[3, 4]。
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Figure 1 The binding mode of the ternary complexes of cyclosporine A, tacrolimus, and rapamycin with the respective receptor and target protein[2] |
上述天然药物介导两个蛋白的相互作用, 形成的三元复合物阻断了靶蛋白的功能, 蛋白并没有被降解, 所以它们被称之为分子胶。下面讨论的是在泛素连接酶的背景下, 药物诱导的相互作用而导致蛋白质降解, 这是一种新兴的灭活治疗靶点的策略, 分子胶降解剂与E3泛素连接酶的底物受体结合, 招募目标蛋白进行泛素化, 然后被蛋白酶体降解, 所以称作分子胶降解剂(molecular glue degraders)。
1.2 来那度胺从阐明作用机制到提出分子胶降解剂的概念是B. Ebert等在2014年报道了第一个发挥蛋白质降解作用的分子胶降解剂来那度胺(4, lenalidomide)。来那度胺是治疗多发性骨髓瘤和其他B细胞肿瘤的有效药物, 但作用机制不清楚, Ebert的这一研究很大程度得到了阐明。
为了揭示来那度胺的作用机制, 研究者将固定化的来那度胺与有稳定同位素标记氨基酸的细胞培养液(SILAC) 温孵, 之后应用定量质谱技术, 用普筛的方式, 查验细胞内众多蛋白哪些发生了变化, 发现4结合于泛素E3连接酶CUL4-CRBN蛋白上, 此时4呈现多效性反应, 是由于靶蛋白的泛素化而引发的, 作为E3连接酶的CUL4具有特异性, 是由被称作CRBN的蛋白所调控, CRBN是多变性蛋白, 本身没有靶标, 所以认为是底物受体。
为了确定4是如何诱导CUL4-CRBN的泛素作用的, 作者用基于SILAC的定量质谱方法研究了来那度胺对多发性骨髓瘤细胞的泛素酶组学和蛋白质组学的结构变化, 可谓是大海捞针式的普筛, 发现由于来那度胺的存在, 有两个蛋白IKZF1和IKZF3在蛋白水平和泛素位点的水平变化最大, 来那度胺降低了游离的IKZF1和IKZF3蛋白的质谱丰度, 丰度的降低是IKZF1和IKZF3发生了泛素化作用。还发现来那度胺的存在也提高了IKZF1和IKZF3蛋白与底物受体CRBN的结合。
IKZF1和IKZF3蛋白是B细胞和T细胞生物学的重要转录因子, 所以来那度胺引发IKZF1和IKZF3的降解而缺失, 揭示那度胺抑制这些淋巴细胞的分子机制。尤其IKZF3是浆细胞发育的关键因子, 而多发性骨髓瘤就是浆细胞的恶性变。来那度胺还对套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等B细胞恶性变有治疗效果, 也是由于引发了IKZF3的降解所致[5]。
该泛素E3连接酶CUL4-CRBN实际由CUL4-RBX1-DDB1-CRBN等蛋白组成, 来那度胺以及类似物沙利度胺(5, thalidomide) 和泊马度胺(6, pomalidomide) 等还可以同该连接酶的其他蛋白结合, 例如介导对酪蛋白激酶1α (CK1α) 的降解反应, 从而揭示了来那度胺治疗与染色体5q缺失相关骨髓增生异常综合征[del (5q) MDS] 的作用机制[6]。
用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET) 方法测定了在来那度胺饱和浓度下CUL4-CRBN与CK1α复合物的离解常数KDapp = 242 nmol·L-1, 而没有来那度胺时CUL4-CRBN与CK1α不发生结合, 表明来那度胺介导了该E3连接酶与靶标CK1α的结合作用。来那度胺的类似物沙利度胺和泊马度胺诱导也存在CUL4-CRBN与CK1α的三结合, 但活性减弱了2~5倍。提示来那度胺的介导是结构特异性的。
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结构生物学研究了来那度胺-CUL4-CRBN-CK1α复合物的晶体结构, 表明CUL4-CRBN成U形构象, 衔接蛋白DDB1调节CRBN与连接酶CUL4-RBX1之间的相互作用。CRBN和来那度胺共同位于激酶N叶(N lobe) 中的CK1αβ-发卡环提供的结合界面, 并证明CK1α与CRL4-CRBN的结合严格依赖于来那度胺的存在。图 2a是DDB1∆BPB-CRBN-来那度胺-CK1α复合物的表面图, 可以看出4处于“黏合”了CRBN与CK1α结合的分子胶状态。图 2b和2c是来那度胺(橙色) 在CRBN (青色) 和CK1α (紫色) 的位置。来那度胺的戊二酰亚胺环结合于CRBN的疏水腔内, 苯并内酰胺环暴露于表面, CK1α的β-发卡环套在4的结合腔顶部与CRBN结合, CK1α也与4发生范德华作用[7]。
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Figure 2 a: CRBN surface contacted by CK1α and IKZF1. b: CRBN binds the glutarimide moiety in a hydrophobic pocket. The phthalimide ring of lenalidomide is surface exposed. A β-hairpin loop of CK1α binds CRBN on top of its lenalidomide-binding pocket. c: Side-chain interactions between CK1α, CRBN and lenalidomide. Lenalidomide provides van der Waals interactions with CK1α. CRBN residues that form the hydrophobic pocket are shown in grey. Dashed lines indicate hydrogen bonds[7] |
吲地苏兰(7, indisulam, E7070) 是碳酸酐酶抑制剂, 具有抗肿瘤活性, 是作用于细胞周期G1期的靶向化合物, 对移植人肿瘤细胞的小鼠有显著抑制作用, 且具有安全性。7进行临床试用治疗进展期的实体瘤患者, 但效果差(低于10%), 因而未能成药。Han等[8]研究7的作用机制以揭示临床治疗效果差的原因。细胞内有一类核蛋白称作RNA结合基源蛋白39 (RBM39), 其功能是参与前体mRNA (pre-mRNA) 的剪切。RBM39与许多剪切因子和pre-RNA结合蛋白相结合执行对pre-mRNA的剪切功能。当吲地苏兰诱导降解了RBM39蛋白, 则会发生pre-mRNA的剪切异常, 例如发生了数百个內显子的保留和外显子的跳跃等。研究者采取正向基因策略, 发现了7对癌细胞中的野生型RBM39的作用, 在7的存在下与E3泛素连接酶CUL4-DCAF15 (其组成蛋白为CUL4-DDB1-DDA1-DCAF15) 发生结合, 导致RBM39的多聚泛素化, 继之被蛋白酶体降解。然而RBM39若发生数个氨基酸变异, 蛋白构象的改变不能与7和CUL4-DCAF15结合, 因而阻止了泛素化和降解反应, 这是发生耐药的分子基础, 也是临床效果差的原因。图 3是这一过程的示意图。
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Figure 3 Indisulam targets the splicing factor RBM39 for proteasomal degradation[8] |
用重组的纯化蛋白RBF39、E3连接酶的DCAF15等蛋白与7温孵, 只能得到三元复合物RBF39-indisulan-DCAF15, 没有生成任何的二元复合物, 说明7是连接靶标与E3连接酶的“两面胶”型的关键分子。而变异的RBF39不能被7识别与结合, 分子胶失去了“黏合”能力, 因而表现为临床的耐药性。另外两个苯磺酰胺化合物塔西苏兰(8, tasisulam) 和CQS (9) 与吲地苏兰的作用机制是相同的。
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吲地苏兰的存在促进了RBM39与DCAF15之间的结合。BM39-吲地苏兰-RDCAF15三元复合物的晶体结构表明, 吲地苏兰定位于RBM39的中央螺旋和DCAF15的β9、β16和α6之间; 吲哚环与DCAF15的Gln232发生阳离子-π结合。3-氯代吲哚环结合于由DCAF15的Thr230、Phe235和Val559及RBM39的Met265和Gly268组成的疏水腔中。苯磺酰胺定位于DCAF15的Ala234和Thr262以及RBM39的Met265疏水性侧链之中。吲地苏兰分子中间的磺酰胺与DCAF15的Ala234和Phe235主链形成氢键结合。分子结构中央的磺酰胺的N-H有可离解性, 带负电荷的氮原子与水分子氢键结合, 后者又与RBM39的Thr262和Asp264形成氢键, 增强了结合力。化合物7是用酰胺替换磺酰胺, 此处的N-H没有离解性, 无法形成上述的氢键网络, 活性很低。总之, DCAF15与RBM39直接的相互作用不能维持足够的结合力(Ki > 50 μmol·L-1), 二者广泛的非极性面, 需要吲地苏兰分别作结合招募实现三元性结合。图 4是BM39-indisulan-RDCAF15晶体结构的部分截图, 橙色结构是吲地苏兰, 绿色为DCAF15结构域, 紫色为RBM39结构域[9]。
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Figure 4 Indisulam-mediated interactions between DCAF15 and RBM39. Indisulam (orange) bridges the structure of DCAF15 (green) and RBM39 (magenta) by forming several direct or water-mediated interactions with both DCAF15 and RBM39 and serves to increase the complementarity between the two surfaces. Hydrogen bonds are shown as dotted lines and the surfaces of both DCAF15 and RBM39 are shown. Key residues are labeled[9] |
前面的范例是在已知抗肿瘤活性的基础上研究机制而揭示出分子胶的特征, 可谓由偶然发现的药理效应研究得来的。化合物CR8 (11) 则是有目的筛选而发现的。Słabicki等[10]将4 518个药物或临床前小分子与578株肿瘤细胞温孵, 测定了499株细胞中E3泛素连接酶的mRNA水平, 发现由于CR8的作用肿瘤细胞中DCAF15蛋白的表达水平降低, 这与CUL4衔接蛋白DDB1的mRNA水平相关联。
用定量蛋白质组质谱分析评价细胞中蛋白质的丰度, 发现在加入CR8后, 只有cyclin K蛋白的丰度持续下降。但不改变cyclin K mRNA的水平, 这是通过诱导含有DDB1的cullin-RING泛素连接酶的活性, 将cyclin K泛素化, 被蛋白酶体快速降解的结果。
依赖于周期蛋白激酶12 (CDK12) 在某些肿瘤高表达, 周期蛋白K (cyclin K) 是CDK12的分子伴侣, CR8作为分子胶, 结合于CDK12-cyclin K, 并与E3连接酶CUL4的衔接蛋白DDB1之间形成复合物, 从而使cyclin K发生泛素化, 继之将其降解而杀伤肿瘤。在此, CR8参与的蛋白-蛋白相互作用绕过了对底物受体的互补性要求。
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结构生物学提示, CR8占据了CDK12激酶的ATP结合腔, 并通过疏水性片段苯基吡啶与DDB1的β螺旋域C (BPC) 的Ile909、Arg928和Arg947残基发生离散性结合, 面积大约150 A2, 当这些残基发生变异, 则降低了募集激酶的能力。CR8形成三元复合物是特异性结合, 化合物DRF053 (12) 是11少一个CH2的同系物, 由于改变了分子的走向, 结合力降低了3倍; Roscovitine (13) 没有2-吡啶基的化合物, 缺少了与Ile909和Arg947发生疏水-疏水相互作用, 结合力降低了两倍。由于12和13诱导泛素化能力降低, 不能使细胞中cyclin K发生降解, 所以抗肿瘤活性差。图 5a是DDB1 (∆BPB)-CR8-CDK12-cyclin K复合物晶体结构的卡通图, 11同时结合了DDB1和CDK12-cyclin K两个蛋白, 起到“粘黏”的分子胶作用; 图 5b是DDB1-CR8-CDK12结合的局部CR8的苯基吡啶片段与DDB1的氨基酸残基结合的表面图[10]。
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Figure 5 a: Cartoon representation of the crystal structure of DDB1 (∆BPB)-(R)-CR8-CDK12-cyclin K; b: Close-up view of the DDB1-CR8-CDK12 interface. The phenylpyridine moiety of CR8 contacts DDB1 residues[10] |
阿斯卡霉素(14, asukamycin) 是链霉菌属代谢产物, 属于聚酮类(polyketides) 抗生素, 具有抑制肿瘤细胞增殖活性。分子结构中含有α, β-不饱和酮、α, β-不饱和酰胺和环氧乙烷片段等亲电性基团。Roberts等[11]研究14的作用机制, 应用被称作基于活性的蛋白质评析(activity-based protein profiling, ABPP) 的技术平台, 经由有反应性能的化学探针可确定细胞中蛋白质的活性、功能和可结合配体的热域(hotspot) 等。
三阴乳腺癌(TNBC) 目前还没有治疗药物, 研究发现, 14可抑制来自TNBC癌细胞231MFP的增殖, EC50 = 4.5 μmol·L-1。用14和空白处理蛋白质组样本, 并用N-5-己炔基碘乙酰胺(可与半胱氨酸的巯基发生迈克尔加成反应) 作标记, 然后用同位素串联蛋白降解-ABPP方法加以确证, 发现在231MFP细胞中UBR7的C374蛋白是阿斯卡霉素的主要靶标, 这个蛋白的对照组试验与给药14组的比值最高。进而为了证明14的抗肿瘤作用是与UBR7的C374蛋白相互作用有因果关系, 将231MFP细胞的UBR7敲低, 发现并没有影响细胞的增殖, 但14对介导的抗增殖作用产生了完全的耐受性。
为了揭示14究竟结合了什么蛋白而抑制了细胞增殖, 研究者对表达FLAG-GFP或FLAG-UBR7的231MFP细胞的抗FLAG下拉洗脱液进行了蛋白质组学分析, 用空白和14分别处理, 以确定依赖于UBR7和阿苏卡霉素结合后发生了怎样的蛋白-蛋白相互作用。从中确定了8个蛋白依赖于UBR7的存在, 其中两个与肿瘤生长密切相关: 即DNA蛋白激酶(PRKDC) 和抑癌蛋白TP53, 尤其是用基于凝胶的ABPP方法鉴定出UBR7-asukamycin-TP53三元复合物有高丰度的存在。
TP53是个抑癌因子, 实验表明UBR7-asukamycin-TP53复合物可提高TP53的热稳定性和折叠, 从而提高了抑制TNBC癌细胞231MFP的增殖作用, 也可能提高其与DNA结合而激活TP53转录活性的能力。所以, UBR7-asukamcin犹如分子伴侣提高TP53热稳定性和折叠。
UBR7-asukamcin-TP53复合物的三维结构尚未解析, LC-MS/MS也未能确定14与哪个(些) 半胱氨酸残基发生加合反应(或许是在质谱条件下可逆性加合又恢复成单体状态)。但无论如何, 化合物14可通过结合UBR7和TP53的分子间胶合, 介导了TP53的抑癌作用而起的作用, 所以是另一类分子胶。
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另一个天然聚酮甘露霉素(15, manumycin A) 是阿斯卡霉素的类似物, 结构中也具有多个亲电性位点, 对UBR7和TP53两个蛋白也起着分子胶的作用, 强度也与14相近。
为了证明14和15中的环氧片段对UBR7的结合和活化TP53的作用, 合成了没有该片段的甘露霉素D (16), 基于凝胶-ABPP分析表明, 16也结合了UBR7, 但比较弱, 也不能诱导UBR7和TP53之间的相互作用, 16对三阴乳腺癌231MFP细胞没有抑制作用, 显然环氧乙烷片段是这类分子胶的重要药效团[12]。
2 结语分子胶的作用本质是介导蛋白-蛋白相互作用, 像分子质量只有259 Da的来那度胺的小分子, 同时与两个蛋白实现结合, 要求对两个蛋白在结构上有互补性, 实属可遇而不可求, 也只能以生物物理、生化和谱学等多种方法在解析已知活性分子的作用机制中发现, 目前还达不到基于蛋白结构设计分子胶。用质谱技术与各种分离技术普筛化合物干预细胞内蛋白质组的相互作用, 如同本文讨论的化合物CR8的发现, 是化学生物学同时发现探针分子和双靶标蛋白的范例。分子胶干预蛋白-蛋白相互作用可产生不同的效应, 既可以诱导E3泛素连接酶启动蛋白酶体降解掉靶标蛋白, 也能像环孢菌素A和他克莫司那样的两面胶, 介导并促进了蛋白-蛋白的结合, 还可像可共价结合的聚酮介导蛋白之间的结合, 激活蛋白的功能。
直至目前, 发现的分子胶都是从解析药物或化合物的分子机制而确定的, 或随机筛选的方法发现, 归根结底都是幸运的发现, 还达不到理性设计。不过确证为化合物分子胶则需要有关蛋白质组学的各种技术, 最终以结构生物学的可视性加以确证。此外, 既往许多药物的作用机制尚不清楚, 用现代的蛋白质组学的各种平台技术作结构解析, 可能发现是分子胶的作用, 以老药作为探针, 发掘那些非可药性靶标蛋白的新功能。
利益冲突: 作者声明不存在利益冲突。
| [1] |
Liu J, Farmer JD, Lane WS, et al. Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes[J]. Cell, 1991, 66: 807-815. DOI:10.1016/0092-8674(91)90124-H |
| [2] |
Schreiber S. The rise of molecular glue[J]. Cell, 2021, 184: 3-8. DOI:10.1016/j.cell.2020.12.020 |
| [3] |
Fretz H, Albers MW, Galat A, et al. Rapamycin and FK506 binding proteins (immunophilins)[J]. J Am Chem Soc, 1991, 113: 1409-1411. DOI:10.1021/ja00004a051 |
| [4] |
Heitman J, Movva NR, Hall MN. Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast[J]. Science, 1991, 253: 905-909. DOI:10.1126/science.1715094 |
| [5] |
Krönke J, Udeshi ND, Narla A, et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells[J]. Science, 2014, 343: 301-305. DOI:10.1126/science.1244851 |
| [6] |
Krönke J, Fink EC, Hollenbach PW, et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1α in del(5q) MDS[J]. Nature, 2015, 523: 183-188. DOI:10.1038/nature14610 |
| [7] |
Petzold G, Fischer ES, Thomä NH, et al. Structural basis of lenalidomide-induced CK1α degradation by the CRL4CRBN ubiquitin ligase[J]. Nature, 2016, 532: 127-130. DOI:10.1038/nature16979 |
| [8] |
Han T, Goralski M, Gaskil N. Anticancer sulfonamides target splicing by inducing RBM39 degradation via recruitment to DCAF15[J]. Science, 2017, 356: eaal3755. DOI:10.1126/science.aal3755 |
| [9] |
Bussiere DE, Xie LL, Srinivas H, et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex[J]. Nat Chem Biol, 2020, 16: 15-23. DOI:10.1038/s41589-019-0411-6 |
| [10] |
Słabicki M, Kozicka Z, Petzold G, et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K[J]. Nature, 2020, 585: 293-297. DOI:10.1038/s41586-020-2374-x |
| [11] |
Roberts AM, Ward CC, Nomura DK. Activity-based protein profiling for mapping and pharmacologically interrogating proteome-wide ligandable hotspots[J]. Curr Opin Biotechnol, 2017, 43: 25-33. DOI:10.1016/j.copbio.2016.08.003 |
| [12] |
Isobe Y, Okumura M, McGregor LN, et al. Manumycin polyketides act as molecular glues between UBR7 and P53[J]. Nat Chem Biol, 2020, 16: 1189-1198. DOI:10.1038/s41589-020-0557-2 |