药学学报  2021, Vol. 56 Issue (9): 2573-2576     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0377   PDF    
引用本文
YAN Hong-ling, CHEN Yao, TANG Fei, FENG Jian, GUO Chen-wan, HU Chang-jiang, LU Jun, TAN Yu-zhu. A novel fatty acid monoglyceride from the stem and leaves of Ligusticum chuanxiong Hort.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2021, 56(9): 2573-2576.  
闫洪玲, 陈瑶, 唐飞, 冯健, 郭晨婉, 胡昌江, 鲁军, 谭玉柱. 川芎茎叶中一个新的脂肪酸单甘油酯[J]. 药学学报, 2021, 56(9): 2573-2576.  
川芎茎叶中一个新的脂肪酸单甘油酯
闫洪玲1, 陈瑶1, 唐飞1, 冯健2, 郭晨婉1, 胡昌江2, 鲁军1, 谭玉柱1     
1. 西南特色中药资源国家重点实验室, 成都中医药大学药学院, 四川 成都 611137;
2. 国家中医药管理局"中药配方颗粒质量与疗效评"重点研究室, 四川新绿色药业科技发展有限公司, 四川 彭州 611930
收稿日期: 2021-03-17; 修回日期: 2021-04-12
基金项目: 成都中医药大学杏林学者学科人才科研提升计划(QNXZ2018009)；四川省杰出青年科技人才计划(2021JDJQ0040)
*通讯作者: 鲁军, E-mail: ljaa111@163.com;
谭玉柱, Tel: 86-28-61800231, E-mail: tanyuzhu@cdutcm.edu.cn
摘要: 利用MCI、硅胶、Sephadex LH-20及半制备高效液相等多种色谱技术，从川芎茎叶石油醚部位分离得到2个脂肪酸单甘油酯。经1D NMR、2D NMR、HR-ESI-MS和旋光数据解析确定结构，其中1个为新化合物，命名为14，15-dehydrocrepenynic acid monoglyceride (1)，另1个为已知化合物(R)-α-(7'Z，10'Z，13'Z)-hexadecatrienoic acid monoglyceride (2)，二者均为首次从川芎中分离得到。体外抗肿瘤活性结果显示，化合物1和2对MCF-7增殖有一定抑制作用，IC50分别为30.75和36.82 μmol·L-1。
关键词: 川芎    茎叶    脂肪酸单甘油酯    结构鉴定    抗肿瘤活性    
A novel fatty acid monoglyceride from the stem and leaves of Ligusticum chuanxiong Hort.
YAN Hong-ling1, CHEN Yao1, TANG Fei1, FENG Jian2, GUO Chen-wan1, HU Chang-jiang2, LU Jun1, TAN Yu-zhu1     
1. Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China;
2. Key Laboratory of Quality Control and Efficacy Evaluation of Traditional Chinese Medicine Formula Granules, Sichuan New Green Medicine Science and Technology Development Co., Ltd., Pengzhou 611930, China
Abstract: Two fatty acid monoglycerides were isolated from the petroleum ether fraction of the stem and leaves of Ligusticum chuanxiong by using MCI column, silica gel column, Sephadex LH-20 column and semi-preparative HPLC. Their structures were elucidated by 1D-NMR, 2D-NMR, HR-ESI-MS and optical rotation data. One of them is a new compound, named 14, 15-dehydrocrepenynic acid monoglyceride (1), the other was a known compound (R)-α-(7'Z, 10'Z, 13'Z)-hexadecatrienoic acid monoglyceride (2), both of which were isolated from Ligusticum chuanxiong for the first time. The results of in vitro antitumor activity assay showed that compounds 1 and 2 could inhibit the proliferation of MCF-7 with IC50 values of 30.75 and 36.82 μmol·L-1, respectively.
Key words: Ligusticum chuanxiong    stem and leaves    fatty acid monoglyceride    structure identification    antitumor activity    

川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.) 为伞形科多年生草本植物[1], 其药用部位是根茎, 具有活血行气、祛风止痛的功效[2], 主要化学成分为苯酞和生物碱[3, 4]。川芎为临床常用品种, 临床需求量大, 而采收加工时占全株鲜重75%以上的茎叶作为非药用部位丢弃, 造成了严重的资源浪费[5]。川芎茎叶古称蘼芜, 应用古已有之, 《神农本草经》记载“主咳逆, 定惊气, 辟邪恶, 除蛊毒、鬼痊, 去三虫, 久服通神”[6]。现代研究表明, 川芎茎叶中的苯酞类成分含量与根茎接近, 占挥发油总量的39.95%, 有一定的药用开发价值[7]。为实现川芎资源的综合开发利用, 本课题组近年来对川芎茎叶中的化学成分进行了系统研究, 从中分离得到多个结构新颖的苯酞类成分[8, 9]。本文报道从川芎茎叶中又分离得到的2个脂肪酸单甘油酯。其中化合物1为新化合物, 命名为14, 15-dehydrocrepenynic acid monoglyceride, 另1个为已知化合物(R)-α-(7'Z, 10'Z, 13'Z)-hexadecatrienoic acid monoglyceride (2) (图 1)。两个化合物均为首次从川芎中分离得到。对化合物1、2进行肿瘤细胞毒活性测试, 发现其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖有一定的抑制作用, 其IC50分别为30.75和36.82 μmol·L-1。

Figure 1 Structures of compounds 1 and 2
结果与讨论 1 结构鉴定

14, 15-dehydrocrepenynic acid monoglyceride (1)黄色油状液体, [α]D25-22.9 (c 0.12, MeOH)。HR-ESI-MS推断其分子式为C21H34O4 (m/z 351.252 4 [M+H]+), 不饱和度为5。1H NMR谱中显示1个端甲基[δH 0.92 (3H, t, J = 7.4 Hz, H-18)]、6个与sp3杂化碳原子相连的CH2 [δH 1.62 (2H, m, H-3), δH 1.42 (2H, m, H-17), δH 1.31 (8H, overlap, H-4, 5, 6, 7)]、3个与sp2杂化碳原子相连的CH2 [δH 2.34 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2), δH 2.25 (2H, qd, J = 7.4, 1.5 Hz, H-16), δH 2.05 (2H, m, H-8)]、1个与sp杂化碳原子相连的CH2 [δH 3.08 (2H, m, H-11)]、4个烯烃质子[δH 5.45 (2H, overlap, H-9, H-10), δH 5.43 (1H, m, H-14), δH 5.82 (1H, dt, J = 10.7, 7.4 Hz, H-15)] 和5个与氧相连的烷基质子[δH 4.20 (dd, J = 11.7, 4.6 Hz, H-1'a), δH 4.14 (dd, J = 11.7, 6.2 Hz, H-1'b), δH 3.93 (m, H-2'), δH 3.69 (dd, J = 11.5, 3.9 Hz, H-3'a), δH 3.59 (dd, J = 11.4, 5.8 Hz, H-3'b)] (表 1)。13C NMR显示21个碳信号, 其中有1个酯羰基信号(δC 174.6), 结合DEPT显示1个甲基(δC 14.0)、12个亚甲基(δC 65.4, 63.6, 34.4, 32.3, 29.5, 29.3, 29.3, 29.3, 27.3, 25.1, 22.4, 18.2)、5个次甲基(δC 143.0, 131.9, 124.6, 109.5, 70.5) 和2个季碳(δC 92.6, 77.4), 推测此化合物为不饱和脂肪酸脂。1H-1H COSY (图 2) 的相关信号提示C-2-C-3-C-4-C-5-C-6-C-7-C-8-C-9和C-14-C-15-C-16-C-17-C-18的碳链连接顺序。HMBC显示H-14 (δH 5.43) 与C-12 (δC 92.6)、C-16 (δC 32.3) 相关, H-15 (δH 5.82) 与C-13 (δC 77.4)、C-14 (δC 109.5)、C-16 (δC 32.3)、C-17 (δC 22.4) 相关, 提示C≡C-CH=CH-CH2-CH3的结构片段; H-11 (δH 3.08) 与C-9 (δC 131.9)、C-10 (δC 124.6)、C-12 (δC 92.6)、C-13 (δC 77.4) 相关, 提示C≡C-CH2-CH=CH-的结构片段; H-1' (δH 4.20、δH 4.14) 与C-1 (δC 174.6) 相关, H-3' (δH 3.69、δH 3.59) 与C-1' (δC 65.4)、C-2' (δC 70.5) 相关, 提示单甘油酯的结构片段。将该化合物的波谱数据与14, 15-dehydrocrepenynic acid[10, 11]比较, 发现其结构与后者相似, 区别在于多了一组典型的甘油酯信号, 包括1个与酰氧基相连的CH2 (δH 4.20, dd, J = 11.7, 4.6 Hz; δH 4.14, dd, J = 11.7, 6.2 Hz; δC 65.4)、1个与羟基相连的CH (δH 3.59, dd, J = 11.4, 5.8 Hz; δC 70.5) 和1个与羟基相连的CH2 (δH 3.93, m; δH 3.69, dd, J = 11.5, 3.9 Hz; δC 63.6)。综上, 推测此化合物为14, 15-dehydrocrepenynic acid的单甘油酯化合物。C-14-C-15的相对构型通过耦合常数确定, H-15 (1H, dt, J = 10.7, 7.4 Hz) 的氢信号提示其为Z构型。H-9和H-10的氢信号重叠, 无法使用耦合常数确定C-9-C-10的双键构型。有文献报道, 使用13C NMR的化学位移来确定共轭亚油酸的构型, 与C-9烯烃相连亚甲基的化学位移为δ 27.46或δ 32.86, 提示C-9烯烃为Z构型或E构型[12, 13]。化合物1中C-8化学位移为δ 27.3, 提示C-9-C-10为Z构型。由于化合物量的限制, 采用旋光值比较的方法代替Mosher反应确定化合物的绝对构型。其比旋光值与类似物化合物2接近([α]D25-22.6 (c 0.11, MeOH)), 手性应与其一致, 确定C-2'为R构型。

Table 1 NMR data of compound 1 (600 MHz for 1H NMR, 151 MHz for 13C NMR, CDCl3, J in Hz)

Figure 2 Key 1H-1H COSY (—) and HMBC (H→C) correlations for compound 1
2 抑制肿瘤细胞增殖活性

采用MTT法测定两个化合物对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、鼠乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人乳腺癌细胞(MCF-7) 和人结肠癌细胞(HCT116) 的体外抗肿瘤活性, 结果见表 2。结果显示14, 15-dehydrocrepenynic acid monoglyceride (1) 和(R)-α-(7'Z, 10'Z, 13'Z)-hexadecatrienoic acid monoglyceride (2) 对人乳腺癌细胞MCF-7增殖具有一定的抑制作用, 其IC50分别为30.75和36.82 μmol·L-1。

Table 2 The IC50 of compounds 1-2 for cytotoxicity on MDA-MB-231, SH-SY5Y, HCT116 and MCF-7
实验部分

Bruker Avance III 600-NMR spectrometer (德国Bruker公司); LTQ Orbitray Velos Pro质谱仪(高分辨静电场轨道阱质谱)和Ultimate 3000超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司); LC50型中高压制备液相(赛谱锐思北京科技有限公司); COSMOS色谱柱(10 mm×250 mm, 5 μm); RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); 优普UPT系列超纯水(成都优普电子产品有限公司); 可调式移液器(美国Thermo Fisher公司); 细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司); 多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)。C18色谱硅胶(日本富士硅化学株式会社); Sephadex LH-20色谱填料(瑞士Pharmacia公司); MCI树脂(日本三菱化学公司); 硅胶GF254薄层板、200~300目正相柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂); 色谱纯甲醇(美国TEDIA公司); 氘代氯仿(美国CIL公司); 其他试剂为分析纯(成都市科隆化学品有限公司); DMEM高糖培养基、培养皿、96孔板(美国康宁公司); 胎牛血清(北京全式金生物技术有限公司); 胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(德国Biofroxx公司)。

人结肠癌细胞(HCT116)、人神经母瘤细胞(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、鼠乳腺癌细胞(MDA-MB-231) 均购自中国科学院上海细胞研究所。

川芎茎叶采自四川眉山, 经胡昌江教授鉴定为川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的茎叶, 样品标本(CX-1804) 现存于成都中医药大学中药化学1001研究室。

1 提取分离

自然阴干的川芎茎叶(20 kg), 粗粉碎, 加10倍量95%乙醇渗漉提取, 提取液减压浓缩得到浸膏3 kg。浸膏加温水分散, 石油醚萃取5或6次, 合并萃取液, 减压回收溶剂后得石油醚部位0.5 kg。取石油醚部位0.5 kg, 经MCI柱色谱, 90%甲醇等度洗脱, 除去色素, 其浓缩液经硅胶柱色谱, 石油醚-乙酸乙酯(99∶1~1∶99) 梯度洗脱, 得到7个组分A~G。G组分再经硅胶柱色谱, 石油醚-丙酮(98∶2~1∶99) 梯度洗脱, 得到G1~G4共4个组分。G2经Sephadex LH-20凝胶柱, 二氯甲烷-甲醇(2∶3) 等度洗脱, 得到G2.1~G2.3共3个组分。G2.2经反相C18柱色谱以甲醇-水(66∶34) 等度洗脱, 得到化合物1 (5.9 mg) 和化合物2 (10.4 mg)。

2 结构鉴定

化合物1   黄色油状液体。[α]D25-22.9 (c 0.12, MeOH)。IR/cm-1: 3 707, 3 662, 2 970, 2 870, 1 701, 1 054, 1 004; (-)HR-ESI-MS m/z 349.236 9 [M-H]- (Calcd. for C24H33O4-, 349.238 4); (+)HR-ESI-MS m/z 351.252 4 [M+H]+ (Calcd. for C24H35O4+, 351.253 0)。1H NMR和13C NMR数据见表 1。

化合物2   黄色油状液体。[α]D25-22.6 (c 0.11, MeOH)。HR-ESI-MS m/z 325.2 [M+H]+。1H NMR (600 MHz CDCl3) δ 5.37 (6H, overlap, H-7, 8, 10, 11, 13, 14), 4.21 (1H, dd, J = 11.7, 4.5 Hz, H-1'a), 4.15 (1H, dd, J = 11.6, 6.2 Hz, H-1'b), 3.93 (1H, tt, J = 6.0, 4.2 Hz, H-2'), 3.69 (1H, dd, J = 11.5, 5.8 Hz, H-3'a), 3.60 (1H, dd, J = 11.5, 5.8 Hz, H-3'b), 2.81 (4H, dt, J = 6.7, 4.4 Hz, H-9, H-12), 2.36 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-2), 2.08 (4H, overlap, H-6, H-15), 1.36 (4H, overlap, H-4, H-5), 0.98 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-16); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 174.5 (C-1), 132.3 (C-14), 130.1 (C-7), 128.6 (C-10), 128.4 (C-11), 128.3 (C-13), 127.3 (C-8), 70.5 (C-2'), 65.4 (C-1'), 63.6 (C-3'), 34.3 (C-2), 29.5 (C-5), 29.0 (C-4), 27.3 (C-6), 25.9 (C-9), 25.8 (C-12), 25.1 (C-3), 20.8 (C-15), 14.5 (C-16)。以上波谱数据与文献报道一致[14], 故鉴定化合物2为(R)-α-(7'Z, 10'Z, 13'Z)-hexadecatrienoic acid monoglyceride。

3 体外抑制肿瘤细胞增殖活性

采用MTT法进行肿瘤细胞增殖抑制活性测定, 分别将人神经母瘤细胞(SH-SY5Y)、鼠乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人乳腺癌细胞(MCF-7) 和人结肠癌细胞(HCT116) 培养于含10%胎牛血清的细胞培养液中, 取对数生长期细胞以每毫升2.5×104个细胞将细胞悬浮液接种到96孔板中, 每孔100 μL, 置37 ℃、5% CO2培养箱中培养1或2天, 使细胞稳定。分别加入不同浓度受试化合物(3.125、6.25、12.5、25、50和100 μmol·L-1) 于96孔板中, 并设阴性对照组, 继续培养48 h。每孔加入MTT (5 mg·mL-1) 20 μL, 继续置于37 ℃、5% CO2培养箱中避光孵育, 2 h后加入DMSO溶液80 μL, 置摇床上振荡直至MTT反应的产物甲瓒结晶全部溶解。使用多功能酶标仪于570 nm波长下测定吸光度OD值。将OD值带入公式计算细胞抑制率和IC50。实验重复3次。抑制率的计算公式为:

细胞抑制率= [(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值] × 100%

作者贡献:  闫洪玲是本文的第一作者, 负责成分分离、结构鉴定和论文撰写; 陈瑶测定了两个化合物的体外抗肿瘤活性; 唐飞、郭晨婉协助提取分离工作; 冯健与胡昌江负责药材的采收、粉碎及鉴定, 并提供试验所需试剂耗材; 谭玉柱与鲁军是本文的通讯作者, 设计和组织了整个研究。

利益冲突:   所有作者声明不存在任何利益冲突。

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