2021, Vol. 56
2. 中国药科大学生物药物学院, 江苏 南京 211198;
3. 常州南京大学高新技术研究院和江苏靶标生物医药研究所, 江苏 常州 213164
2. College of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China;
3. High-tech Research Institute of Nanjing University at Changzhou and Jiangsu Target Pharma Laboratories Inc., Changzhou 213164, China
甲型H1N1流感是全世界季节性流感的主要类型[1], 严重影响人类健康, 破坏全球经济发展[2]。血凝素(hemagglutinin, HA) 蛋白是甲型流感病毒的表面糖蛋白[3], 是重要的表面抗原, 在病毒表面以三聚体形式存在[4]。HA蛋白在低pH条件下发生构象重排与膜融合[5], 通过病毒膜与细胞内膜的融合帮助病毒基因组进入宿主细胞[1, 6]。HA前体HA0通过蛋白水解酶裂解, 形成以二硫键连接的两个亚基: HA1 (327个氨基酸) 和HA2 (222个氨基酸)。HA可分为两个结构域(图 1): 膜-远端球形结构域(包括HA1的8个β-折叠和暴露的无规卷曲)[7]和膜-近端茎结构域(包括HA1的部分氨基酸以及全部的HA2), 头部为可变区, 茎部为保守区[4, 8, 9]。
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Figure 1 Sequence and schematic structure of H1N1 hemagglutinin (HA) protein (PDB ID: 1RU7) |
疫苗是预防流感病毒的有效对策, 但由于抗原漂移, 不能预防新的大流行毒株[10]。目前FDA (Food and Drug Administration) 批准的临床用药多为神经氨酸酶抑制剂[11]和基质蛋白抑制剂[12], 但已开始产生耐药问题; HA蛋白是开展流感病毒药物研发的重要靶点[12]。抗菌肽具有广泛的抗菌性能[13, 14], 动物来源的抗菌肽对人类的多种病毒具有新疗效[15]。Urumin是从印度蛙皮肤中提取的抗菌肽, 由27个氨基酸残基构成(氨基酸序列: 1-IPLRGAFINGRWDSQCHRFSNGAIACA-27)[16]。研究发现, urumin可与甲型H1N1 HA蛋白的茎部保守区作用, 有效中和H1N1流感病毒, 破坏流感病毒结构, 保护小鼠免受致命感染; 研究还发现urumin对H1N1流感株的作用明显大于H3N2流感株[16]。然而, urumin与HA蛋白确切的结合位点和作用机制尚不明确, 限制了其进一步的应用和开发。本文利用分子模拟方法预测多肽urumin与HA的作用模式, 并在293T细胞中表达HA蛋白, 验证了预测的urumin多肽与HA的相互作用和结合位点。本研究为特异性抗流感病毒的药物开发提供一定的理论和实验基础。
材料与方法计算方法
结构的获得和多肽结构预测 H1N1 HA和H3N2 HA的X-ray结构分别从PDB蛋白质数据库获得, PDB ID分别为1RU7 (H1N1 HA) 和4WE4 (H3N2 HA)。利用在线软件Psipred (http://biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSdock/)、SOPMA、Hierarchical Neural Network、DPM、DSC、GOR4、PHD、SIMPA96、SOPMA-GOR4-SIMPA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/) 和Jpred4 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4) 预测urumin二级结构, PEP-FOLD 3 (https://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/) 预测三级结构。
HA与urumin结合区域的筛选 综合分析已报道的与HA茎部作用的药物的结合方式。Ekiert等[17]研究发现, 广泛中和抗体CR6261可结合HA1和HA2膜近端茎中高度保守的螺旋区; Fleishman等[18]以位于HA2上Asp19和Trp21为结合位点设计的蛋白HB36和HB80能与H1和H5结合, 具有良好的亲和力; Kadam等[19]根据广泛中和抗体(FI6v3和CR9114) 的互补决定区(CDR) 环的针对HA近膜端茎区而设计得到的多肽P6和P7表现出对H1N1、H5N1等甲型流感病毒的良好中和力。上述研究中的蛋白或多肽都结合在HA茎部保守区, 与urumin相似, 而这些抗体或多肽的结合位点都包括了HA2亚基上的Asp19和Trp21残基, urumin是否也可能作用在此区域？由此, 以HA的Asp19 (HA2) 和Trp21 (HA2) 所在区域为出发点, 对接urumin。
分子对接 采用MOE2019.01软件进行分子对接, MOE2019.01和Discovery studio 2019 Client软件分析结构。在分子对接前, 删除所有水分子和小分子配体, 修补侧链, 加氢原子, 加电荷, 力场采用Amber10: EHT。对蛋白结构进行能量优化(参数默认)。多肽与HA的对接采用Protein-Protein Dock, 最大迭代次数1 000, 其他参数默认。
试剂和材料 大肠杆菌E. coli DH5α、293T细胞和质粒载体pCAGGS-Myc tag (南京睿博文生物科技有限公司); pET30a-HA质粒(来源于扬州大学[20]); EcoRI酶、XhoI酶、T4连接酶和引物(上海生工生物工程股份有限公司); M5 HiPer Site-Directed Mutagenesis Kit超高效点突变试剂盒(南京命之源医疗器械有限公司); 琼脂糖[翌圣生物科技(上海) 有限公司]; 免疫荧光一抗Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb和二抗Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) (上海优宁维生物科技股份有限公司); SPECTRAPLATE-96 HB/50C孔板(PerkinElmer 6005600); Urumin多肽及乱序多肽(disordered peptide) (杭州丹港生物科技有限公司合成); ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 包被液(1.59 g·L-1 Na2CO3、2.94 g·L-1 NaHCO3, pH 9.6)、封闭液[3% BSA (bovine serum albumin), PBST (phosphate buffered saline tween)] 和ELISA抗体Myc-Tag (19C2) Antibody (HRP conjugated) (南京沃博生物科技有限公司); TMB (3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine, 南京慧杰诚生物科技有限公司)。
构建质粒 将pCAGGS-Myc tag和pET30a-HA质粒用EcoRI酶、XhoI酶进行双酶切, 回收pCAGGS-Myc载体片段和HA片段, 用T4连接酶连接, 得到质粒pCAGGS-HA。设计定点突变引物(表 1), 以pCAGGS-HA质粒为模板, 扩增得到表达HA突变体(D19A-W21A-H32A) 的质粒pCAGGS-HA-mutate。PCR程序: 95 ℃ 30 s, (95 ℃ 15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min) × 30循环, 72 ℃ 10 min。各取上述pCAGGS-HA、pCAGGS-HA-mutate质粒用EcoRI酶和XhoI酶进行双酶切后, 进行1%琼脂糖凝胶电泳, 验证片段大小, 将质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞, 提取质粒送生工生物工程(上海) 股份有限公司测序进行验证。
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Table 1 Primer sequences |
免疫荧光检测HA蛋白在293T细胞中的表达 转染质粒至293T细胞, 免疫荧光检测蛋白质表达情况: 12孔板每孔转染质粒0.5 μg, 48 h后弃培养液, PBS (phosphate buffered saline) 洗3次。4%多聚甲醛室温孵育1 h后, 洗3次。每孔加入0.5% TritonX-100 PBS, 室温45 min, PBS洗3次。加入3% BSA PBST, 室温2 h, 弃去孔内液体。3% BSA PBST配制一抗稀释液(1∶200), 4 ℃过夜。室温40 min复温, PBST洗3次。3% BSA PBST配制二抗稀释液(1∶1 000), 室温避光1 h, PBST洗3次。加入DAPI [2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride] 后, 加抗荧光淬灭封片剂制片, 用荧光显微镜(德国ZEISS公司) 检测蛋白质在细胞中的表达。
ELISA检测HA蛋白与多肽结合作用 反复冻融获得细胞裂解上清: 胰酶消化收集转染48 h后的细胞悬液, 4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min, PBS洗2次后, 用含蛋白酶抑制剂的PBS (10 μL·mL-1) 重悬细胞。反复冻融(-80 ℃ 10 min, 37 ℃ 5 min), 重复3次。4 ℃、10 000 ×g离心15 min, 收集上清液。
多肽包被效率的测定按照如下方法: urumin多肽以及乱序多肽均带有N端FITC (fluorescein isothiocyanate) 标记, 两种多肽用包被液稀释成10 μg·mL-1, 加入96孔板中(每孔100 μL), 每个样品6个复孔, 4 ℃过夜包被。次日, 每个样品的前3个孔用PBST洗3次, 每次5 min, 然后加入PBST, 后3个孔不做处理。在酶标仪上检测清洗后的多肽荧光值与原多肽溶液的荧光值(激发光485 nm, 发射光528 nm), 测定包被效率(包被效率=包被过夜清洗后多肽的荧光值/原多肽溶液过夜后荧光值× 100%)。
多肽用包被液稀释成10 μg·mL-1, 加入96孔板中(每孔100 μL), 4 ℃过夜。加入PBST洗涤液静置5 min, 洗3次后, 每孔加入封闭液, 在37 ℃下孵育3 h, 洗3次。BSA法定量细胞裂解液中总蛋白浓度为2.5 mg·mL-1, 在96孔板第1列中加入样品稀释液(PBS稀释), 依次进行2倍梯度稀释(每孔总量100 μL), 37 ℃下孵育1.5 h, 洗3次后, 加入抗体(1∶5 000), 37 ℃孵育1 h, 洗3次。加入TMB溶液, 室温避光静置10 min。每孔加入2 mol·L-1 H2SO4终止液, 酶标仪(美国Bio Tek公司) 测定450 nm的吸光度值。
统计学分析 实验结果均以x±s表示, 两组数据比较采用学生t检验(student's t test); P < 0.05表明差异具有统计学意义, 相关分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行。
结果 1 Urumin的结构主要以无规卷曲为主Urumin预测的二级结构见表 2。利用10种方法预测的结果表明, urumin的二级结构主要以无规卷曲为主, 在溶液中可能有多变的构象。图 2显示了PEP-FOLD 3预测的urumin结构, 结合二级结构的预测, 选择5个能量低的结构(mode l~model 5) (其中model 3中Cys16-Cys26形成二硫键) 作为urumin结构进行分子对接。
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Table 2 Predicted secondary structure of urumin. C: Coil; E: Sheet; T: Turn; H: Helix |
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Figure 2 The 5 lowest energy 3D structures of urumin obtained by prediction |
分子对接结果表明: urumin能较好地结合在HA蛋白HA2链的Asp19和Trp21所在的区域(图 3A)。利用MOE软件的PLIF分析功能, 统计对接得到的能量较低的前100个复合物中的与urumin形成相互作用的HA氨基酸的频率。结果显示, HA1链中His32残基是HA上与urumin作用频率最高的氨基酸, 占17%, 可能是HA与urumin作用的关键氨基酸。HA蛋白质的残基His32 (HA1) 与Asp19 (HA2) 和Trp21 (HA2) 空间上相互接近, 推测这3个氨基酸所在的位置是HA与urumin作用的关键位点。
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Figure 3 Molecular docking results of urumin and H1N1 HA protein (more negative score value means better docking match). A: Urumin binds to the region of the HA protein HA2 chain where Asp19 and Trp21 are located; B: Docking results of urumin and H1 HA/H3 HA at the sites of HA2 (Asp19 and Trp21) |
结果还显示, urumin与H1N1 HA的结合亲和力高于H3N2 HA, 即urumin与H1N1 HA对接结合能的负绝对值显著高于H3N2 HA (图 3B), 这与已报道的实验结果相一致[16]。
图 4展示了urumin与HA的能量最优的结合模式。Urumin结合于HA茎部的一段疏水区域(图 4A, 绿色区域)。抗菌肽urumin的Arg4和Arg11可分别与HA蛋白氨基酸Asp19 (HA2) 和Asp18 (HA1) 形成盐键; urumin残基上的多个残基能够与H1N1 HA氨基酸残基形成氢键相互作用, 包括Asn9-Trp21 (HA2)、Gly10-Thr31 (HA1)、Arg11-Ser33 (HA1)、ASP13-Val34 (HA1)、Cys16-His32 (HA1)、Cys16-Asn53 (HA2)、His17-Asn53 (HA2)、Ser20-Thr49 (HA2) 和Ser20-Asn53 (HA2) 之间。这些作用维持了urumin与HA蛋白的结合。此外, 观察到urumin的Trp12与His32 (HA1) 侧链环之间形成芳香π堆积作用, 可能是urumin与HA结合的关键作用(图 4B)。
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Figure 4 Optimized model for the interaction of urumin with HA. A: Binding site between urumin and H1N1 HA. The green area indicates the hydrophobic region on the surface of HA protein, the red area is the negatively charged region on the surface of HA protein, the purple band is the urumin; B: Interaction of urumin with H1N1 HA. The red, purple, or orange translucent cylinder indicates the hydrogen bonding interaction, the coexistence of hydrogen bonding and charge interaction, or the directional π-stacking interaction, respectively |
为了确定HA蛋白的氨基酸His32 (HA1)、Asp19 (HA2) 和Trp21 (HA2) 是否是urumin结合位点的关键氨基酸。首先分别构建了野生型HA (pCAGGS-HA) 和上述3个氨基酸的丙氨酸突变体的HA表达质粒(pCAGGS-HA-mutant)。质粒经EcoRI酶和XhoI酶双酶切后的电泳图显示了pCAGGS载体片段条带, 以及HA和HA-mutate片段条带, 条带大小正确(图 5A), 且测序得到的序列比对结果显示3个氨基酸都已成功突变为丙氨酸, 表明突变体质粒构建成功(图 5B)。将质粒转染至293T细胞中, 免疫荧光结果表明, 相比较空载质粒(pCAGGS), 野生型HA蛋白以及丙氨酸突变体HA-mutate蛋白都有明显表达, 且表达水平相当(图 6)。
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Figure 5 Construction and confirmation of pCAGGS-HA and pCAGGS-HA-mutate recombinant plasmids. A: Agarose gel electrophoresis of pCAGGS-HA and pCAGGS-HA-mutate recombinant plasmids after double digestion by EcoRI and XhoI restriction endonucleases; B: Comparison of sequencing results of pCAGGS-HA and pCAGGS-HA-mutate recombinant plasmids, the results showed that the mutant plasmid was successfully constructed |
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Figure 6 Immunofluorescent detection of HA protein expression in 293T cells, the expression levels of wild-type HA proteins as well as HA-mutate proteins were comparable. Scale bar: 20 or 50 μm. DAPI: 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride |
为了验证HA蛋白与urumin的结合作用以及结合位点的关键氨基酸是否正确, 采用ELISA方法检测urumin与HA蛋白(细胞裂解上清) 的结合。
乱序多肽(利用www.novopro.cn/tools/shuffle_ protein获取urumin的随机打乱序列: PSRAQCAIFDSIAGNAHGCIRRNLGWF) 作为阴性对照, 探究HA和urumin的结合作用。多肽的包被效率的测定结果显示: urumin多肽以及乱序多肽两种多肽的包被效率基本一致, 两组的包被效率没有统计学差异(P < 0.05) (图 7A)。ELISA实验结果表明, urumin与HA组的作用明显高于乱序多肽组(P < 0.05), 结果证明细胞裂解上清中的HA与urumin之间具有特异性结合作用(图 7B)。
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Figure 7 The binding of the peptide to the lysate supernatant of 293T cells transfected with plasmids (pCAGGS, pCAGGS-HA, and pCAGGS-HA-mutate) was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). A: Determination of the encapsulation efficiency of urumin and disordered peptide; B: Determination of the binding of urumin and disordered peptide to lysate supernatants of 293T cells transfected with pCAGGS-HA plasmid; C: Determination of the binding of cell lysate supernatants of 293T cells transfected with plasmid (pCAGGS, pCAGGS-HA, and pCAGGS-HA-mutant) to urumin, respectively. n = 3, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NS: No significance |
空载质粒(pCAGGS) 不表达HA蛋白, ELISA检测结果发现, pCAGGS-HA组与urumin的作用显著高于空载组(P < 0.05), 表明urumin与HA蛋白具有较好的亲和力。pCAGGS-HA-mutate组表达的HA-mutate蛋白的3个关键氨基酸突变成了丙氨酸。ELISA检测结果发现, Urumin与pCAGGS-HA组的作用明显高于pCAGGS-HA-mutate组(P < 0.05), 即表明HA蛋白突变后与urumin的结合作用明显减弱(图 7C)。以上结果表明, His32 (HA1)、Asp19 (HA2) 和Trp21 (HA2) 是HA与urumin结合位点中的关键氨基酸。
讨论抗菌肽是天然存在的、高度保守的天然免疫肽, 对革兰阴性和革兰阳性细菌、病毒和真菌具有广泛的抗菌活性[14]。抗菌肽的分子结构、生物活性和作用机制以及它们之间的相互关系是目前抗菌肽研究的热点[21]。
抗流感病毒肽的作用机制通常分为3类: ①通过干扰病毒聚合酶抑制病毒复制的肽, 如一种设计用于结合和阻止蛋白质相互作用的抑制性肽[22]; ②利用静电相互作用破坏膜的肽, 如人类cathelicidin LL-37[23]; ③与HA相互作用以阻断病毒融合和进入的多肽, 如来源于成纤维细胞生长因子4的信号序列[24]。Urumin对H1N1甲型流感病毒具有杀灭作用, 能够特异性地作用于H1 HA保守茎部[16]。但是具体结合位点以及作用机制不明。与urumin作用类似, Fleishman等[18]设计的HB80也能作用在HA蛋白茎部保守区域, HB80能够抑制低pH条件诱导的HA融合构象变化; Kadam等[19]设计得到的肽P6和P7同样作用在HA茎部区域, 表现出甲型流感病毒的良好中和力, 这两种流感病毒肽抑制剂能够抑制HA蛋白质在酸性条件下的构象重排, 从而中和病毒。HA2的N端1~23个氨基酸构成了融合肽, 由几个较大的疏水性残基和几个甘氨酸残基组成。在pH值为中性时, 埋藏在分子内部, 酸性条件下构象重排, 促进病毒融合[25]。HA1的His32靠近HA的切割位点, 切割位点附近的His具有pH敏感特性, 被认为会破坏HA界面的稳定性, 促进融合肽的暴露[26]。
本研究结果表明, urumin结合在HA的茎部区域, 能够同时与HA1链的His32所在的肽段(Thr31~Val34)、HA2链上Asp19和Trp21所在的区域以及Thr49和Asn53所在的七肽螺旋(heptad repeat) 相互作用, 且Asp19和Trp21位于HA2的N端的融合肽上。推测urumin通过特异性作用于上述氨基酸, 稳定了HA1和HA2界面的相对构象, 抑制HA构象重排, 从而产生抗病毒效应。
Holthausen等[16]实验发现urumin能够破坏病毒粒子的物理结构。本研究结果显示, urumin中含有4个带有正电荷的碱性氨基酸: Arg4、Arg11、His17和Arg18, urumin的碱性氨基酸能与HA蛋白茎部酸性氨基酸[如Asp18 (HA1)和Asp19 (HA2)] 形成离子键, 在稳定HA1和HA2相对构象时起重要作用, 并且带正电荷的urumin与病毒膜负电荷的磷脂相互作用可能可破坏病毒粒子, 因此urumin上的碱性氨基酸可能是其发挥效应的关键氨基酸。
本研究结果还显示, urumin的结构以无规卷曲为主, 多个残基与HA作用才能稳定其在HA上的结合。Urumin的结构多变可能不利于进一步的应用开发, 提示在对urumin改造时, 应充分考虑改善多肽稳定性以及进一步提升多肽和HA结合力。
目前世界迫切需要具有新的靶点和作用机制的流感治疗药物, 以对抗潜在的大流行病、新出现和流通中不断变异的病毒株。多肽分子大多为天然的内源性配体, 与受体的亲和力强, 较容易成为先导化合物及药物[27], 本研究报告了抗H1N1 HA多肽抑制剂urumin的结合位点以及可能的作用机制, 对抗流感病毒具有重要意义。
作者贡献: 华子春负责项目的总体思路和实验设计; 李家璜指导实验研究、尤其是分子对接部分; 郑伟娟指导ELISA实验部分; 李红梅完成了分子对接部分、实验验证部分和论文初稿; 李家璜、华子春完成了论文修改。该论文的最后版本通过了所有作者认可。
利益冲突: 本文所有作者均声明不存在利益冲突关系。
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