酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD) 是指长期大量饮酒导致的肝脏疾病, 初期常表现为酒精性脂肪肝, 进而发展为酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化, 甚至肝功能衰竭[1]。近年来, 随着人们生活水平的提高, 酒精性肝病患者比例不断上升, 严重危害人民健康[2]。研究发现, ALD主要是乙醇及其代谢产物直接或间接诱导的炎症反应、氧化应激和肠源性内毒素等多种因素相互作用的结果, 尤其是肠道屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症及内毒素激活Kupffer细胞在ALD的发生和发展中有重要作用[3]。
中药肉苁蓉为列当科植物荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola (C. deserticola) Y. C. Ma或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wight干燥带鳞叶的肉质茎。研究表明, 肉苁蓉具有增强机体的免疫功能、抗衰老、抗辐射、抗氧化以及抗脂质过氧化和对酒精肝损伤的保护作用[4-7]。以往的研究主要集中于管花肉苁蓉, 关于荒漠肉苁蓉的肝保护作用及其活性成分并不清楚。本文将基于急性酒精性肝损伤模型, 探讨荒漠肉苁蓉不同部位提取物的肝保护作用及其作用机制, 为后期肉苁蓉在肝保护方面的研究和开发提供理论依据。
材料与方法实验动物 健康昆明小鼠, 雄性, 体重(22 ± 5) g, 购于北京维通利华实验动物技术有限公司, 许可证编号为SCXK (京) 2016-0011, 饲养于北京大学医学部动物实验中心, 室温20~25 ℃, 湿度56%~60%。实验动物所有操作均严格按照北京大学医学部动物伦理委员会标准执行(LA2019123)。
肉苁蓉提取物的制备及含量测定 参照课题组之前报道的肉苁蓉提取物制备方法及含量测定方法[8-10]。10 kg荒漠肉苁蓉经水提醇沉得到3.7%多糖, 在经树脂纯化水洗脱液浓缩得到38%总寡糖稠膏, 40%乙醇洗脱干燥得到3.7%总苷。分别将这3种提取物用于实验研究。
实验试剂 HE染色液(G1120)、油红O染色液(G1260)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT) 活性检测试剂盒(批号BC1555) 及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST) 活性检测试剂盒(批号BC1560) 均购于北京索莱宝生物科技有限公司; 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 试剂盒(批号A001-3)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px) 试剂盒(批号A005)、丙二醛(malondialdehyde, MDA) 试剂盒(批号A003-1)、过氧化氢酶(catalase, CAT) 检测试剂盒(A007-1)、内毒素(endotoxin, ET) 试剂盒(E039-1-1)、二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO) 试剂盒(A088-2-1) 和D-乳酸(D-lactic acid, D-LA) 试剂盒(H263) 均为南京建成生物工程研究所; 联苯双酯(bifendate, BIF, 批号: S4890) 由上海蓝木化工有限公司提供; 56度(酒精含量56%) 红星二锅头由北京红星股份有限公司提供; 质膜囊泡相关蛋白1 (plasmalemma vesicle-associated protein-1, PV1) 抗体(ab32570)、核因子E2相关因子(nuclear factor E2 related factors, Nrf-2) 抗体和胞质蛋白伴侣分子(kelch-like ECH-associated protein-1, Keap-1) (ab66620) 均购于Abcam公司。
实验仪器 石蜡切片机(德国Leica公司); Sunrise-Basic酶标仪(瑞士TECAN公司); 高速冷冻离心机(美国贝克曼公司); 倒置荧光显微镜(IX73) (日本Olympus公司)。
急性酒精性肝损伤小鼠模型的制备及分组 60只雄性健康昆明小鼠, 称重, 正常组(normal group, NOR) 10只, 其余小鼠灌胃红星二锅头[9], 按0.01 mL·g-1剂量灌胃, 每日1次, 连续灌胃7天。7天后, 按体重随机分为模型组(model group, MOD)、联苯双酯组(bifendate group, BIF, 0.9 mg·kg-1)、荒漠肉苁蓉总苷组(TGs, 400 mg·kg-1)、荒漠肉苁蓉多糖组(PSs, 400 mg·kg-1) 和荒漠肉苁蓉寡糖组(OSs, 400 mg·kg-1) 5组, 给药剂量根据课题组前期研究设定[11]。各组分别灌胃生理盐水、联苯双酯、荒漠肉苁蓉总苷、荒漠肉苁蓉多糖和荒漠肉苁蓉寡糖, 连续给药14天, 药物均采用生理盐水配制。由于连续灌胃酒精, 有部分小鼠死亡, 最后给药每组8只。
小鼠各脏器系数检测 末次给药30 min后, 获取各脏器, 并按此公式: 脏器系数= [脏器湿重(g)/大鼠体重(g)]×100%计算各脏器系数, 并用SPSS 19.0软件进行统计学分析。
HE染色 上述肝组织经组织固定液固定后, 常规石蜡包埋切片, 进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE) 染色后, 在光学显微镜下观察组织病理变化。
指标检测 取各组小鼠血清, 按照试剂盒说明书检测ALT、AST、ET、DAO和D-LA含量, 处死小鼠取出肝脏, 制备肝组织匀浆, 按照试剂盒说明书检测CAT、SOD、GSH-Px活性及MDA含量。
油红O染色 取固定好的小鼠肝脏组织, 置于30%蔗糖溶液中, 待肝脏组织沉底后, 转移至20%蔗糖溶液中, 待沉底后, 改刀包埋, 冰冻切片机切片, 片厚100 μm。滴加1×PBS洗涤10 min, 放入60%异丙醇浸洗20~30 s; 然后加入改良油红O染色液中, 密闭染色10~15 min; 放入60%异丙醇溶液中稍洗以便去除染液, 自来水漂洗10 min, 甘油明胶封片, 显微镜下观察拍照。
免疫荧光化学染色 石蜡切片脱蜡复水, 柠檬酸钠抗原修复, 滴加一抗PV1 (1∶200)、Nrf-2 (1∶100) 及Keap-1 (1∶200), 4 ℃过夜, PBS冲洗, 滴加TRITC荧光二抗(1∶100), 避光室温孵育1 h。Hoechst 33258染核, 抗荧光衰减封片剂避光封片, 荧光显微镜拍照。
TUNEL染色 石蜡切片脱蜡复水, 滴加20 μg·mL-1不含DNase的蛋白酶K稀释液, 于37 ℃下反应30 min, 再滴加3% H2O2溶液于室温下孵育20 min, 随后用0.01 mol·L-1 PBS缓冲溶液洗涤3次; 滴加50 μL生物素标记液, 于37 ℃下孵育60 min, 终止反应; 再滴加50 μL streptavidin-TRITC工作液, 避光室温孵育30 min, DAPI染核, 封片, 显微镜下观察, 荧光显微镜拍照。
统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差(x ± s) 表示, 正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析(ANOVA), 组间两两比较若方差齐采用SNK法, 若方差不齐采用Dunnett's T3法, 计数资料采用卡方检验(chi-square test), 采用GraphPad Prism 5进行数据作图, 最小显著差异水平设定为P < 0.05。
结果 1 TGs能够显著降低酒精性肝损伤小鼠肝脏系数如图 1所示, 与NOR组相比, MOD组肝脏系数明显增加; 与MOD组比较, TGs干预后, 肝脏系数明显降低, 而PSs和OSs对肝脏系数无影响, TGs与BIF相比无显著差异。
HE染色结果显示, NOR组肝脏组织细胞形态正常, 细胞排列整齐, 染色均匀, 细胞结构完整, 细胞间隙致密; MOD组结构紊乱, 细胞排列不规则, 细胞间隙疏松, 细胞界限不清; BIF和TGs干预后细胞形态改变明显好于模型组, 细胞数量较模型组多, TGs与BIF相比无显著差异, PSs和OSs组对肝脏的病理形态都没有显著的改善作用, 说明TGs具有肝保护作用, 而PSs和OSs无明显改善作用, 如图 2所示。
油红O染色结果显示, NOR组有少量的脂质沉积, 而MOD组脂质沉积明显增加; 与MOD组相比, TGs干预后脂质沉积明显减少; TGs与BIF相比无显著差异; PSs和OSs对脂质在肝脏的沉积并没有显著改变。实验结果说明TGs能够减轻酒精性肝损伤小鼠肝脏脂质沉积, 而PSs和OSs对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂质沉积并没有改善, 无降脂作用(图 3)。
如图 4结果显示, 与NOR组相比, MOD组ALT和AST水平明显增加; 与MOD组相比, TGs组ALT和AST水平明显降低; TGs与BIF相比无显著差异; 而PSs和OSs组ALT和AST水平并没有显著变化, 说明TGs抑制肝脏损伤, 具有肝保护作用。
酒精对肝细胞造成损伤后, 细胞核内的DNA发生断裂, TUNEL染色呈现阳性表达。如图 5所示, MOD组肝脏中有大量细胞发生凋亡, 与MOD组相比, TGs组细胞凋亡明显减少, TGs与BIF相比无显著差异; 而PSs和OSs组细胞凋亡情况并没有显著变化, 说明TGs能够抑制细胞凋亡。
HE染色结果显示, NOR组小肠组织细胞形态正常, 绒毛排列整齐, 肠壁均匀, 细胞结构完整, 细胞间隙致密; MOD组结构紊乱, 绒毛排列不规则, 断裂状, 肠壁变薄; BIF和TGs干预后细胞形态得到明显改变, 肠壁增厚, PSs和OSs组对小肠病理形态都没有显著的改善作用, 说明TGs对肠壁和绒毛完整性具有保护作用, 如图 6所示。
PV1蛋白是一种Ⅱ型整合膜糖蛋白, 是肠血管屏障通透性指标, 免疫荧光染色检测其表达, 以观察荒漠肉苁蓉提取物对肠壁通透性的影响。如图 7所示, 与NOR组相比, MOD组小肠壁中PV1蛋白表达水平显著增加; 与MOD组相比, TGs组PV1蛋白表达量明显降低; TGs与BIF相比具有显著差异; 而PSs和OSs组PV1蛋白表达并没有显著变化, 说明TGs能够促进小肠壁修复。
如图 8结果显示, 与NOR组相比, MOD组血清中ET、DAO和D-LA含量显著增加; 与MOD组相比, TGs组ET、DAO和D-LA含量明显降低; 而PSs和OSs组这些指标的含量并没有显著变化。
免疫荧光染色结果可见, 与NOR组相比, MOD组肝脏中Nrf-2入核率显著降低; Keap-1蛋白表达水平显著上升; 与MOD组相比, TGs组Nrf-2入核率显著增加; Keap-1蛋白表达水平明显降低; TGs与BIF相比无显著差异; PSs和OSs组对Nrf-2入核和Keap-1表达并没有显著影响, 如图 9所示。
本实验研究显示, 与NOR组相比, MOD组SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低, MDA含量显著升高; 与MOD组相比, BIF和TGs干预后SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高, MDA含量显著降低, 如图 10所示。
本研究采用急性酒精性肝损伤小鼠模型, 考察荒漠肉苁蓉不同部位提取物给药14天时对急性酒精性肝损伤的影响, 结果发现荒漠肉苁蓉总苷能够降低急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏系数、血清中ALT和AST含量及肝脏组织中的MDA含量, 显著升高抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性, 改善肝脏组织形态结构及肠壁通透性, 降低血清中ET、DAO和D-LA含量, 抑制细菌次级代谢产物向肝脏转移。同时, 荒漠肉苁蓉总苷能够显著促进Nrf-2入核; 抑制Keap-1蛋白及肠壁上的PV1蛋白表达, 表明荒漠肉苁蓉总苷可以通过激活Nrf-2/Keap-1信号通路及修复肠壁损伤以达到肝保护的作用。
中药肉苁蓉为荒漠肉苁蓉或管花肉苁蓉干燥带鳞叶的肉质茎, 而这两种肉苁蓉药材在肝保护方面目前研究比较多的为管花肉苁蓉。研究显示, 管花肉苁蓉总苷可以改善纤维化大鼠肝组织形态, 降低纤维化程度[12]。罗慧英课题组[13]对荒漠肉苁蓉进行了一些研究, 结果显示, 荒漠肉苁蓉总苷可以增强酒精性肝损伤小鼠肝组织中SOD、GSH-Px和CAT活性, 这跟本研究结果相同。而二者化学成分仅苯乙醇苷的含量不同, 管花肉苁蓉的肝保护成分主要就是苯乙醇苷, 但荒漠肉苁蓉由于苯乙醇苷含量低于管花肉苁蓉, 研究的人不多, 因此本文就考察了荒漠肉苁蓉在苯乙醇苷含量低于管花肉苁蓉的情况下, 是否仍具有肝保护作用。并对其他组分做了比较性研究, 以更加明确肝保护成分, 同时也为荒漠肉苁蓉在肝保护方面的作用提供实验依据, 为后期的产品开发提供理论基础。
肝脏疾病的发展过程与Nrf-2/Keap-1信号通路密切相关, 尤其是酒精性肝损伤。研究发现, 乙醇可以诱导Nrf-2-/-小鼠胆固醇调节元件结合蛋白1 (sterol regulatory element binding protein 1, SREBP-1) 的表达, 也可以显著增加血清中甘油三酯含量[14]。长期饮酒可导致小鼠肝脏中Nrf-2被激活, 从而减轻乙醇诱导的氧化应激。氧化应激也与肝脏疾病的发生发展密切相关, 当机体处于氧化应激状态时, Nrf-2与核抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE) 结合继而启动了下游抗氧化基因的表达。相比于野生型小鼠, Nrf-2-/-小鼠由于抗氧化能力降低, 易受外界刺激而使得肝损伤更加敏感, 比如, 给予呋喃苯胺酸24 h后, Nrf-2-/-小鼠出现明显肝损伤; 而过度表达Nrf-2蛋白, 肝损伤却不明显[15], 由此可见, Nrf-2的激活可能是肝损伤新的潜在治疗靶点和途径。本研究通过比较肉苁蓉3种提取物对急性酒精性肝损伤的影响发现, 肉苁蓉总苷可以通过激活Nrf-2/Keap-1信号通路, 增加抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性, 起到肝保护的作用。
酗酒是造成酒精性肝损伤的一个主要的因素, 而酒精可促进慢性肝损伤患者肠道中革兰阴性菌过度生长, 同时, 酒精可破坏肠道完整性, 使肠道内细菌代谢产物进入体循环, 通过门静脉到达肝脏, 进而加重肝脏损伤[16]。研究发现, 在ALD患者和动物模型中, 酒精及代谢产物乙醛均会增加肠道通透性, 使有害物质如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 和D-LA等进入血液[17]。本研究发现, 肉苁蓉总苷可以通过降低酒精在肠道的通透性, 进而降低血液中LPS、DAO和D-LA含量, 防止有害物质通过门静脉进入肝脏, 进而起到肝保护的作用。
联苯双酯是我国首创的一种治疗肝炎的药物, 具有降酶、抗氧化和免疫调节等药理作用, 本研究也发现联苯双酯在脂质沉积方面有显著作用, 其作用可能与其抗氧化作用有关, 使受损的肝组织得以改善, 进而改善肝脏中的脂质代谢, 但其是否直接调控脂质代谢, 目前并没有研究报道。同时, 本结果可以看出, 荒漠肉苁蓉总苷的肝保护作用与联苯双酯无显著差异, 也都具有抗氧化和降低血清中ET、DAO和D-LA含量的作用, 意味着荒漠肉苁蓉总苷与联苯双酯具有类似的肝保护作用机制, 但也观察到联苯双酯对PV1的表达跟总苷存在差异, 这点说明联苯双酯与降低肠壁通透性并无显著作用, 其降低血清中ET、DAO和D-LA的机制还有待进一步研究。
综上所述, 肉苁蓉总苷是中药肉苁蓉发挥肝保护作用的活性部位, 其可以降低肝脏氧化应激及抑制肠道有害物质进入肝脏, 对急性酒精性肝损伤起到保护作用, 其机制可能与激活Nrf-2/Keap-1信号通路有关; 而肉苁蓉多糖和寡糖对急性酒精性肝损伤没有保护作用。相关研究结果为肉苁蓉的进一步研究和开发提供了有益参考。
作者贡献: 王富江负责完成文中实验部分及撰写文章; 屠鹏飞和姜勇设计文章思路; 曾克武和姜勇指导实验和数据处理, 并修改文章。
利益冲突: 所有作者对文章数据已知晓, 无利益冲突。
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