妇女更年期是指卵巢功能的永久性停止, 导致卵巢生成的雌激素和孕激素减少。已有文献报道, 更年期与脂质代谢紊乱密切相关, 包括低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC) 和高密度脂蛋白(HDL) 等代谢紊乱[1]。临床采用雌激素补充疗法(HRT), 预防和缓解雌激素缺乏引起的代谢综合征, 但绝经后妇女服用雌激素将增加中风、乳腺癌和卵巢癌等疾病风险[2]。中药复方, 如中药复方二仙汤, 通过调节激素系统平衡, 临床上已应用于治疗更年期综合征[3-7]。但二仙汤的作用特点和机制尚不明确。
代谢组学用于研究外界刺激和内在病理生理改变后内源性脂质代谢物的变化规律[8-10]。目前, 已有研究采用代谢组学的方法和技术探索二仙汤对双侧去卵巢大鼠的调节作用[11]。但是只针对更年期或双侧去卵巢的某一阶段(多为12周), 忽略了整个病理或治疗过程。绝经过渡期分期系统(the stages of reproductive aging workshop, STRAW) 将妇女绝经分为多个阶段[12], 不同绝经阶段促卵泡激素的含量不同, 不同阶段表征病理和治疗的生物标志物可能不同, 但相关研究未考虑时间因素, 而以不同阶段表征病理和治疗生物标志物诠释病理机制和药效作用机制更加准确, 也更具实际意义。
本文利用实验室已建立的代谢组学技术, 对假手术组、模型组和二仙汤给药组血浆和肝组织样本中鞘脂、磷脂、甘油酯和甾体激素等代谢物轮廓进行分析, 研究不同绝经阶段双侧去卵巢大鼠的代谢组学和去卵巢后大鼠的脂质代谢特征, 从脂质合成与代谢通路角度, 研究二仙汤调节更年期脂代谢紊乱的特点和可能机制。
材料药物与试剂 淫羊藿(Epimedii Folium)、仙茅(Curculiginis Rhizoma)、知母(Anemarrhenae Rhizoma)、黄柏(Phellodendri chinensis Cortex)、巴戟天(Morinda officinalis Radix) 和当归(Angelicae sinensis Radix) 药材购自北京同仁堂有限责任公司。磷脂内标包括PC(17∶0/20∶4), 批号: LM1002; LPC(17∶1/0∶0), 批号: 855676; PS(17∶0/20∶4), 批号: LM1302; PE(17∶0/20∶4), 批号: LM1102, 均购自Avanti Polar Lipids公司, 纯度均 > 99%。甘油酯内标Ⅰ (d5-DG(16∶1/16∶1) 和d5-DG(18∶1/18∶1)), 批号: LM6004; 甘油酯内标Ⅱ (d5-TG(20∶5/22∶6/20∶5) 和d5-TG(20∶0/20∶1/20∶0)), 批号: LM6000, 均购自Avanti Polar Lipids公司, 纯度均 > 99%。尼尔雌醇对照品, 批号: 100239-202003, 购自中国食品药品检定研究院, 定量用对照品。
仪器 美国Agilent公司高效液相色谱仪(1290 UHPLC和1200 RRLC系统), 配备高压泵、自动进样器、脱气机、柱温箱等; 三重四极杆质谱仪(6490和6410B质谱), 配备AJS电喷雾离子源(AJS-ESI源), Masshunter 6.0和Masshunter 3.0数据处理系统; 美国Thermo Sicentific公司线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-FT质谱), 配备电喷雾离子源(ESI源) 和Xcalibur 7.0数据处理系统。
实验动物 雌性Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 250 ± 25 g, 12周左右, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于中国医学科学院药物研究所无特殊病原体级动物实验中心, 12 h光照/黑暗循环, 恒温恒湿(23 ± 2 ℃, 55% ± 5%), 于实验前饲养适应一周。实验动物可自由饮水进食, 研究遵守中国医学科学院药物研究所动物实验伦理委员会制定的规程并通过动物实验伦理审查(No. 00000918)。
复方二仙汤给药液配制 分别称取淫羊藿90 g、仙茅90 g、知母60 g、黄柏60 g、巴戟天90 g和当归90 g, 加入去离子水4.8 L, 煎煮2 h, 滤过。残渣加4.8 L去离子水重复煎煮1 h。合并煎煮液, 45 ℃水浴减压蒸至640 mL, 即得(每毫升药液相当于0.75 g所有干重药材)。
动物分组、造模和给药 将120只大鼠随机分为2、4和12周大组, 每大组40只。每大组又随机细分为假手术组(Sham)、模型组(OVR)、二仙汤组(EXD) 和尼尔雌醇组(NYL), 每组10只。术前12 h禁食, 4 h禁水。10%水合氯醛(400 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉, 经背部切口, 摘除双侧卵巢。假手术组不摘除双侧卵巢, 其他操作与模型组相同。手术后, 各组大鼠正常饮食1周, 使恢复创伤。手术后第2周开始给药, 假手术组、模型组、二仙汤组和尼尔雌醇组分别灌胃给予0.9%氯化钠注射液(10 mL·kg-1·d-1)、0.9%氯化钠注射液(10 mL·kg-1·d-1)、二仙汤(相当于二仙汤生药量7.5 mL·kg-1·d-1) 和尼尔雌醇(4 mL·kg-1·w-1)。
样本采集 选取2、4和12周组大鼠用于激素和脂质化合物测定: 分别于首次给药后2、4和12周腹主动脉取血, 全血肝素抗凝, 1 721 ×g离心10 min后取血浆, 于-80 ℃冰箱冷冻保存, 待测。大鼠处死后迅速取出肝脏, 冰0.9%氯化钠注射液清洗, 吸水纸拭干后取约1 cm3固定部位肝脏组织, 浸入10%福尔马林溶液固定, 用于制作油红染色所需要肝脏切片; 其余肝脏迅速置于液氮中冷冻, 于-80 ℃保存, 用于代谢组学测定。
染色切片检查 将肝脏组织包埋于OCT包埋剂中并置于液氮中速冻, 制成7 µm厚切片, 10%福尔马林溶液固定10 min, 自来水洗净, 60%异丙醇润洗数秒后用0.3%油红O的异丙醇溶液滴染15 min, 60%异丙醇稍洗后蒸馏水冲洗并用苏木素复染细胞核, 显微观察肝脏脂质堆积情况。
样本处理 磷脂、甘油酯和鞘脂: 采用甲基叔丁基醚(MTBE)-甲醇-水三相提取法进行提取; 甾体激素: 参考本课题组已发表文献[13], 丹磺酰氯和吉拉德P为衍生化试剂。
化合物测定 按实验室已建立的分析方法测定鞘酯、磷脂、甘油酯和甾体激素类代谢物的样本含量[13-15]。
数据处理 鞘脂和甾体激素类化合物通过MassHunter定量软件进行积分, 磷脂和甘油酯类化合物的含量采用脂质数据分析软件Lipid Data Analyzer (Graz University of Technology, Graz, Austria) 利用高分辨数据进行识别和积分。计算代谢物峰面积与定量内标峰面积的比值, 代入内标基质标准曲线进行定量分析。
统计分析和通路分析 采用SPSS 18.0软件(SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 比较体重、甾体激素和脂质化合物(鞘脂、磷脂和甘油酯) 组间差异, 具体过程如下: ①采用夏皮罗-威尔克W检验(Shapiro-Wilk W test) 检验变量是否符合正态分布分类; ②采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 对符合正态分布的变量进行组间比较, 寻找组间有差异的变量, 界定显著性差异的临界值为P < 0.05; ③采用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test) 对不符合正态分布的变量进行组间比较, 寻找组间有差异的变量, 界定显著性差异的临界值为P < 0.05。
采用Simca.P+12.0.1软件(Umetrics, Umeå, Sweden) 对所有甾体激素和脂质化合物(鞘脂、磷脂和甘油酯) 数据进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA), 寻找潜在的生物标志物。采用R2Y (cum) 值评估OPLS-DA模型的稳定性, Q2 (cum) 值评估模型的预测性能, 要求R2Y和Q2值均大于0.5。提取潜在生物标志物的标准包括: ① t检验组间P < 0.05; ② VIP (variable importance in the projection) 为变量对模型的重要性, 描述了每一个变量对模型的总体贡献, 设定OPLS-DA投影中的VIP阈值大于1、折刀法(Jack-knife) 不确定区间不跨越0点、S-plot中的Pcorr绝对值大于0.58; ③组间倍数变化(fold change) > 2。
脂质(鞘脂、磷脂和甘油酯) 和甾体激素的代谢通路分析通过公共网络数据平台KEGG (http://www.kegg.jp/) 和LIPID MAPS (http://www.lipidmaps.org/) 完成。
结果 1 肝脏油红O染色切片和大鼠体重本研究将肝脏油红O染色切片作为评价双侧去卵巢大鼠模型和二仙汤效应的重要评价指标。结果如图 1所示, 假手术组肝细胞内始终少见橘红色脂滴, 造模4周和12周后肝细胞内可见许多大小不一的橘红色脂滴, 且部分细胞内脂滴连接成片, 与假手术组比较具有明显差异, 显示造模成功。阳性对照药尼尔雌醇与模型组大鼠比较, 肝细胞油红O染色始终少见橘红色脂滴。给予二仙汤后肝细胞少见橘红色脂滴, 与模型组大鼠比较具有明显差异, 说明二仙汤与阳性药尼尔雌醇均可以显著改善双侧去卵巢引起的大鼠脂肪肝。体重结果表明, 与假手术组相比, 模型组大鼠在造模4~12周后体重显著增加(P < 0.05); 与模型组相比, 尼尔雌醇组在给药2~12周后体重显著降低(P < 0.01); 与模型组大鼠相比, 二仙汤组在给药1周后体重显著增加(P < 0.01), 给药3周和12周后体重显著下降(P < 0.05)。
对假手术组, 双侧去卵巢造模2、4和12周后大鼠组, 二仙汤给药组的血浆和肝脏组织分别进行了代谢组学分析, 为了更直观的描述脂质和甾体激素对不同组别的区分情况, 采用主成分分析(principal component analysis, PCA) 区分假手术组、模型组和二仙汤组, 并绘制了得分散点图(图 2), 质控(quality control, QC) 样本为各组混合样本, 各代谢物峰面积相对标准偏差(relative standard deviation, RSD) 小于15%。由图 3可知, 无论在血浆还是肝组织中, 造模2、4和12周后假手术组, 模型组和二仙汤组均能得到很好的区分。
造模后2、4和12周, 大鼠血浆中共发现46个(6个甾体激素、3个鞘酯、11个甘油磷脂和26个甘油酯) 能同时表征脂代谢紊乱和二仙汤调节作用的潜在生物标志物(图 3), 其中34个代谢物的浓度在给予二仙汤后发生回调。在34个回调代谢物中, 有16个代谢物在二仙汤的调节作用与模型脂代谢的紊乱中完全同步, 包括造模后2周发现的Cer 26∶0和Cer 20∶0, 造模4周后发现的4-MeOE2、LPC 22∶5、PA 52O∶0、PA 52P∶0、PA 54O∶0、PC 38∶2、PC 43O∶0、TG 50∶1、TG 51∶1、TG 51∶3、TG 52∶5、TG 51∶5、TG 57∶2和TG 58∶1; 对于回调的代谢物17-OHPROG而言, 二仙汤的调节作用早于脂代谢发生紊乱; 其余回调的代谢物, 二仙汤的调节作用与部分脂代谢紊乱重叠。通路分析研究发现这46个代谢物广泛参与磷酸甘油酯的代谢、糖基磷脂酰肌醇和甾体激素的生物合成通路(图 3)。
大鼠肝脏中共发现32个(1个甾体激素、20个甘油磷脂和11个甘油酯) 能同时表征脂代谢紊乱和二仙汤调节作用的潜在生物标志物(图 4)。这32个化合物的浓度均在给予二仙汤后发生回调, 其中的16个代谢物, 二仙汤的调节作用与更年期脂代谢紊乱完全同步, 包括造模后2周发现的SM 24∶2、TG 46∶11和TG 60∶4, 造模后4周发现的PA 62∶15、TG 53∶4、TG 58∶1和TG 58∶8, 造模后4周和12周发现的PC 40∶9、PE 36∶4、PE 37∶4、PI 36∶5和PI 37∶4, 造模后12周发现的PE 34∶2、PI 40∶4、PS 20∶4和SM 24∶1; 其余16个代谢物, 二仙汤的调节作用与部分脂代谢紊乱重叠。通路分析研究发现这32个代谢物广泛参与磷酸甘油酯和甘油酯的代谢、糖基磷脂酰肌醇的合成通路(图 4)。构建了大鼠双侧去卵巢模型和二仙汤显著调节的脂质代谢网络见图 5。
更年期综合征是女性在绝经期前后(45~55岁), 由于卵巢功能逐渐衰退, 雌激素分泌过低, 引起下丘脑-垂体-卵巢内分泌轴功能失调, 导致一系列以植物神经功能紊乱、代谢障碍为主的症候群。更年期妇女雌激素水平下降、卵巢功能衰退, 导致脂质代谢异常并伴随肥胖、体重的增加和脂肪肝[16-18]。双侧去卵巢大鼠模型可以较好地模拟女性绝经后体内低雌激素水平, 并且也会出现与人类似的体重增加和脂肪肝的症状, 因此本研究采用双侧去卵巢模型大鼠模拟更年期妇女的生理状态, 研究二仙汤对模型大鼠代谢紊乱的调节作用。肝脏油红O染色切片结果表明二仙汤具有良好的药效, 基于代谢组学分析平台对假手术组、模型组和二仙汤给药组血浆和肝脏样本进行分析, 统计分析组间显著性差异代谢物并找寻潜在生物标志物, 研究不同绝经阶段可能的病理变化和二仙汤调节更年期脂代谢紊乱的作用机制。无论是在血浆还是在肝脏中, 二仙汤对大部分潜在生物标志物的调节作用与随时间变化的脂代谢紊乱基本一致, 揭示二仙汤对双侧去卵巢模型引起的代谢紊乱具有实时调节的作用。除此之外, 二仙汤对代谢紊乱还有一定的预防作用, 这主要是体现在17-OHPROG的调节上。17-OHPROG是胆固醇合成雄激素和雌激素的关键甾体激素, 其浓度的增加可以增加下游雄激素和雌激素的生物合成, 从而减慢双侧去卵巢引起的雌激素减少的进程。
本研究将已建立的代谢组学分析技术应用于双侧去卵巢大鼠脂代谢紊乱和二仙汤对双侧去卵巢大鼠脂代谢紊乱调节作用的研究, 并从代谢组学的角度揭示了双侧去卵巢模型能引发机体的代谢紊乱, 同时还发现二仙汤能有效调节甾体激素和脂质代谢。造模后12周内进行动态的代谢组学分析有助于进一步了解脂质/甾体激素代谢紊乱和二仙汤调节作用的动态变化以及两者之间的关系, 从而有助于揭示二仙汤调节代谢紊乱的作用机制。
作者贡献: 生宁和王彩虹负责实验和数据分析, 完成文章撰写; 贾志鑫和王喆参与数据分析; 吴彩胜和张金兰负责指导实验思路; 所有作者均对本文有所贡献。
利益冲突: 无利益冲突。
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