2021, Vol. 56
离子交换树脂是一种不溶性的高分子材料, 带有可电离的官能团, 可以在溶液中与带同种电荷的离子进行交换, 形成药物树脂复合物[1], 该复合物在口腔的唾液环境下不释放, 而在胃肠道环境中可以释放药物, 因此可以达到很好的掩味效果[2]。离子交换树脂在掩味技术方面具有广阔的应用前景, 尤其在以掩味为重点的小儿口服制剂中[3]。目前已经有一些研究将离子交换树脂用于开发儿童掩味制剂, 如硫酸亚铁液体制剂、盐酸克林霉素悬浮液和法莫替丁悬浮液等[4-6]。
盐酸小檗碱(berberine hydrochloride, BBH) 是中药黄连中的主要有效物质, 在临床上通常以口服的方式用于治疗轻度的肠道感染疾病, 能够有效抑制金葡菌及粪肠球菌, 对痢疾志贺菌、沙门菌等也有较强的抑制作用, 可用于细菌性痢疾的治疗[7, 8]。但BBH味道极苦, 限制了其在临床中的应用, 尤其是患儿的口服依从性很低。本研究旨在开发一种口感优良、适于儿童服用BBH剂型。因前期实验发现, Amberlite IRP69相较于其他型号的树脂具有更好的掩味效果, 口尝几乎无苦味, 因此选用该树脂作为载药树脂。Amberlite IRP69是一种强酸型阳离子树脂, 又名聚苯乙烯磺酸钠, 可用作口服制剂的药物载体, 在FDA非活性成分数据库中可检索到其在干混悬剂中的最大日摄入量728 mg, 此外, IRP69还可治疗高血钾症, 成人的平均每日口服剂量为15~60 g, 具有较高的体内安全性。本研究利用离子交换树脂Amberlite IRP69与BBH结合形成BBH-IRP69复合物掩盖BBH的苦味, 增加儿童患者服药依从性。
材料与方法仪器 Quanta 250 FEG型场发射扫描电子显微镜(FEI公司); Q200型差示扫描量热仪(TA公司); NicoletTM iS5型傅立叶红外变换光谱仪(赛默飞世尔科技公司); Smartlab9kW型X射线衍射仪(日本理学株式会社); DT800型智能溶出试验仪(德国ERWEKA公司); 1260型高效液相色谱(HPLC, 带ALS、TCC、VWD和Chemstation工作站)、7890A型气相色谱仪(GC) (安捷伦科技有限公司)。
样品与试剂 盐酸小檗碱对照品(批号11073-201814, 纯度86.7%, 中国食品药品检定研究院); 盐酸小檗碱原料药(批号JB20181001, 纯度99.6%)、盐酸小檗碱片(批号20190510) (云南明镜亨利制药有限公司); Amberlite IRP69离子交换树脂(批号E709I7L019, 美国罗门哈斯公司); 无水乙醇对照品(批号20130809, 含量≥ 99.5%)、甲醇对照品(批号20130911, 含量≥ 99.5%)、其他化学试剂(国药集团化学试剂有限公司)。
HPLC分析条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国安捷伦科技有限公司); 流动相: A相为乙腈; B相为0.1%磷酸[含0.15%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)]; A∶B = 56∶44。进样量: 10 μL; 柱温: 25 ℃; 流速: 1.0 mL·min-1; 检测波长: 345 nm。
GC分析条件 色谱柱为DW-WAX (260 ℃, 30 m×250 μm×250 μm, Dikma公司); 检测器: 氢火焰离子化检测器; 进样口温度: 200 ℃; 检测器温度: 250 ℃; 程序升温: 起始温度为60 ℃, 维持4 min, 以20 ℃·min-1的速率升温至140 ℃, 维持4 min; 载气: 氮气; 流速: 1.0 mL·min-1; 分流比: 20∶1; 进样方式: 溶液直接进样。
潜溶剂及潜溶条件的考察
潜溶剂比例的考察 采用饱和摇瓶法测定BBH的平衡溶解度, 取不同浓度乙醇(0%、20%、40%、60%、80%和100%) 溶液30 mL, 加入过量的BBH, 45 ℃下恒温搅拌24 h, 0.45 μm微孔滤膜快速过滤至热水浴的离心管中, 取滤液200 μL, 以纯水稀释500倍, HPLC法测定溶液中BBH含量, 计算BBH的平衡溶解度。
潜溶温度的考察 采用饱和摇瓶法测定不同温度下BBH的平衡溶解度, 取60%乙醇溶液30 mL, 加入过量的BBH, 分别在25、35、45、55和65 ℃下恒温搅拌24 h, 0.45 μm微孔滤膜快速过滤至热水浴的离心管中, 取滤液200 μL, 以纯水稀释500倍, HPLC法测定溶液中BBH含量, 计算BBH的平衡溶解度。
BBH-IRP69复合物的制备工艺的单因素考察
结合温度的考察 固定BBH加入量为500 mg, 反应溶剂为60%乙醇50 mL, 升温使BBH全部溶解, 加入IRP69树脂1 g, 在不同温度下恒温搅拌2 h, 计算出此浓度下BBH溶解所需的最低温度为41.59 ℃。因此, 选择45、55和65 ℃时测定树脂的载药量, 考察温度对树脂载药量的影响。反应结束后滤去制备液, 去离子水洗去复合物表面未结合的BBH, 50 ℃下真空干燥3 h。
取BBH树脂复合物10 mg, 置于烧瓶中, 加入0.3 mol·L-1盐酸甲醇溶液100 mL, 超声30 min。取提取液以12 000 r·min-1离心10 min, 取上清液, 以HPLC法测定BBH含量, 并按式(1) 计算载药量。
| $ L=\frac{m_{2}}{m_{1}} \times 100 \% $ | (1) |
其中, L为载药量, m1为称取的复合物的质量, m2为测得复合物中BBH的质量。
药物树脂比例的考察 取不同量的BBH (250、500、750、1 000和1 250 mg), 计算能使其全部溶解的温度并确定反应温度为60 ℃, 将以上不同量的BBH在60 ℃下溶于50 mL的60%乙醇溶液, 加入IRP69树脂1 g, 继续在60 ℃下搅拌2 h, 达吸附平衡后滤去制备液, 去离子水洗去复合物表面未结合的BBH, 收集合并滤液和洗液, 稀释后HPLC测定含量, 并按式(1) 和式(2) 计算载药量和药物利用率。
| $ U=\frac{m_{3}-m_{4}}{m_{3}} \times 100 \% $ | (2) |
其中, U为药物利用率, m3为初始时称取的BBH质量, m4为滤液和洗液中剩余的BBH质量。
将载药量和药物利用率分别赋予0.7和0.3的权重并将计算结果作为综合得分。
搅拌时间的考察 称取BBH 750 mg, 在50 ℃下溶于50 mL的60%乙醇溶液, 加入IRP69树脂1 g, 继续在50 ℃下恒温搅拌, 分别在10、30、60、90、120和180 min时取样, 以0.45 μm微孔滤膜过滤, 稀释, HPLC测定含量。根据式(2) 计算不同时间点时的药物利用率。
水洗次数的考察 固定BBH加入量为750 mg, 在50 ℃下溶于50 mL的60%乙醇溶液, 加入IRP69树脂1 g, 继续在50 ℃下搅拌1 h, 达到吸附平衡后滤去制备液, 将滤液稀释100倍后测定滤液中BBH含量, 复合物沉淀用50 mL去离子水洗涤4次, 取每次洗液, 采用HPLC测定BBH含量。
溶剂残留检测 取制得的3批BBH-IRP69复合物100 mg, 加入甲醇作为内标溶液, 加N, N-二甲基甲酰胺定容至5 mL, 超声提取30 min后, 以0.45 μm微孔滤膜过滤, 采用GC测定乙醇含量。
复合物的稳定性考察 将BBH-IRP69复合物在温度(25 ± 2) ℃、相对湿度(60 ± 5) %的条件下放置, 分别于3个月、6个月和9个月取样检测。取待检样品10 mg, 加纯水至5 mL, 超声提取30 min后, 以0.45 μm微孔滤膜过滤, 采用HPLC测定含量。
BBH-IRP69复合物的物性表征 分别用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)、差示扫描量热(differential scanning calorimetry, DSC)、X-射线粉末衍射(X-ray powder diffraction, XRD) 和傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR) 对BBH、IRP69、两者物理混合物和BBH-IRP69复合物进行表征。SEM测试条件: 加速电压为10 kV, 束斑为3.0, 工作距离为13 mm。DSC测试条件: 扫描温度为60~280 ℃, 升温速度为10 ℃·min-1, 氮气气氛。XRD测试条件: 扫描角度为5~60 °, 步长为0.05 °, 速率为2 °·min-1。FTIR测试条件: 溴化钾压片, 扫描波长为400~4 000 cm-1。
BBH-IRP69复合物的释放行为考察
BBH-IRP69复合物在不同pH中的释放曲线 在pH 1.0、4.5和6.8的条件下测定BBH-IRP69复合物的溶出曲线[9], 分别在以上不同pH值的溶出介质中加入0%、1%和2%的SDS作为表面活性剂。采用2020版中国药典四部通用技术要求0931溶出度与释放度测定法中第二法桨法测定[10], 溶出介质用量1 000 mL, 转速100 r·min-1, 温度(37 ± 0.5) ℃, 取BBH-IRP69 (含BBH约100 mg) 约300 mg, pH 1.0的条件下分别在5、10、15、20、30、60、120和180 min取样4 mL (取样后补加等体积同温溶出介质), pH 4.5和pH 6.8的条件下分别在5、10、15、20、30、60、120、180、240、300和360 min取样4 mL (取样后补加等体积同温溶出介质), 样品用0.45 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 稀释后HPLC测定。
BBH-IRP69复合物在人工唾液中释放 为验证BBH-IRP69复合物较盐酸小檗碱片在唾液环境中是否有较好的掩味效果, 采用2020版中国药典四部通用技术要求0931溶出度与释放度测定法中第二法桨法测定[10], 溶出介质用量1 000 mL, 转速100 r·min-1, 温度(37 ± 0.5) ℃, 取BBH-IRP69约300 mg或盐酸小檗碱片1片(均含BBH约100 mg), 分别在5、10、15、20、30和60 min取样4 mL (取样后补加等体积同温人工唾液), 样品用0.45 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 稀释后用HPLC测定。
结果与讨论 1 潜溶剂及潜溶条件的考察由图 1可知, BBH在浓度为60%的乙醇中溶解度达到最高, 因此, 选择60%乙醇作为制备溶剂。研究中发现, BBH在该潜溶剂中的溶解度受温度影响很大, 因此进一步测定不同温度下BBH在60%乙醇中的溶解度。
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Figure 1 The solubility of berberine hydrochloride (BBH) in different concentrations of ethanol at 45 ℃. n = 3, x±s |
由图 2可知, 在25~65 ℃内, BBH溶解度随温度的升高呈指数变化, 因此溶解度的对数与温度的关系可通过线性方程式(3) 表示:
| $ y=0.0300 x-0.2477\left(R^{2}=0.9982\right) $ | (3) |
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Figure 2 The solubility of BBH in 60% ethanol at different temperatures. n = 3, x±s |
即温度和溶解度的表达式为式(4):
| $ S=10^{y}=10^{(0.0300 x-0.2477)} $ | (4) |
其中, S为溶解度(mg·mL-1); y为lg (S); x为溶解温度(℃)。
由于BBH在水中溶解度较低, 一次反应平衡载药量低, 需多次反应平衡才能达到较高的载药量, 因此载药效率较低, 本研究利用潜溶增加BBH的溶解度, 使一次反应平衡就能达到较高的载药量。研究中发现, BBH在潜溶剂中的溶解度受温度影响很大, 因此进一步研究了温度与BBH溶解度的关系, 并发现在25~65 ℃内, BBH溶解度的指数与温度成线性关系, 此关系式可用来指导后续实验过程中BBH的溶解温度和结合的反应温度。
2 BBH-IRP69复合物制备工艺单因素的考察温度对IRP69树脂的载药量影响不明显(表 1), 因此可根据图 2曲线计算BBH完全溶解时的最低温度作为反应温度; 当m(BBH)∶m(IRP69) = 3∶4时, 根据载药量和药物利用率计算的综合得分最高(图 3), 因此选择该比例作为最佳结合比例。在搅拌时间为60 min时, 该反应达到吸附平衡, 药物利用率不再升高(图 4); 所得复合物水洗2次时, 可将未结合的BBH完全洗去(表 2); 通过该工艺制得3批复合物中均无乙醇检出(图 5), 即无乙醇溶剂残留; 室温放置3个月、6个月和9个月的样品中均无BBH检出(图 6), 即复合物可在9个月内保持稳定。
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Table 1 The result of effect of temperature on drug loading (L). n = 3, x±s |
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Figure 3 Drug loading (L), drug availability (U) and comprehensive score of resin under different BBH concentrations. n = 3, x±s |
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Figure 4 BBH drug availability change curve with mixing time. n = 3, x±s |
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Table 2 Inspection results of washing times. n = 3, x±s |
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Figure 5 GC chromatograms of reference substance and 3 samples of different batches. a: Reference substance; b: Batch 1; c: Batch 2; d: Batch 3 |
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Figure 6 HPLC chromatograms of reference substance of BBH and washing liquor of samples stored 3, 6 and 9 months. a: Reference substance of BBH; b: 3th month; c: 6th month; d: 9th month |
常用的复合物制备方法有批式法和柱式法[11]。一般认为批式法制备复合物操作简单, 设备要求低, 实验参数相对柱式法更易放大[12], 因此本实验采用批式法制备BBH-IRP69复合物, 用单因素法对制备过程中的结合温度、药物树脂比例、搅拌时间和水洗次数等参数进行考察, 优化出了最佳结合参数, 以便后期进行放大研究。
3 BBH-IRP69复合物的表征SEM结果(图 7) 可见, BBH为结晶性粉末, IRP69为不规则颗粒, BBH-IRP69复合物较IRP69的外观无明显变化, 可认为BBH被结合到IRP69内部。
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Figure 7 SEM images of BBH, Amberlite IRP69 (IRP69) and BBH-IRP69 complex. a: BBH; b: IRP69; c: BBH-IRP69 complex |
由DSC曲线(图 8) 可见, BBH在110 ℃和162 ℃出现脱水峰, 在205 ℃出现熔融峰[13], IRP69在143 ℃处出现吸热峰, 两者物理混合物呈BBH和IRP69的吸热峰的简单叠加。BBH-IRP69复合物在131 ℃处出现吸热峰, 在205 ℃处熔融峰消失, 表明BBH和IRP69结合形成了一种与简单物理混合物不同的新结合物。
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Figure 8 DSC curves of BBH, IRP69, physical mixture and BBH-IRP69 complex. a: BBH; b: IRP69; c: Physical mixture; d: BBH-IRP69 complex |
由XRD曲线(图 9) 可见, BBH具有一系列明显的晶体衍射峰, IRP69为非晶态聚合物, 因此不存在晶体峰[14], 二者物理混合物呈BBH晶体峰与IRP69非晶体扩散峰的简单叠加, 药物树脂复合物呈非晶态聚合物扩散峰, 无BBH的晶体衍射峰, 表明BBH-IRP69复合物中药物以非晶状态存在。
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Figure 9 XRD patterns of BBH, IRP69, physical mixture and BBH-IRP69 complex. a: BBH; b: IRP69; c: Physical mixture; d: BBH-IRP69 complex |
由FTIR曲线(图 10) 可见, BBH在3 551 cm-1处出现υ (N-H) 的特征吸收峰, 而与IRP69结合后该特征峰消失, 原因是N-H的N原子与IRP69结合后限制了基团振动。上述现象说明, BBH与IRP69之间是通过离子键结合, 而非简单的物理结合[15]。
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Figure 10 FTIR spectra of BBH, IRP69, physical mixture and BBH-IRP69 complex. a: BBH; b: IRP69; c: Physical mixture; d: BBH-IRP69 complex |
BBH-IRP69复合物的累积释放度曲线如图 11所示, BBH-IRP69复合物在含0%和1% SDS的3种溶出介质中均不能完全释放, 而在含2% SDS的3种溶出介质中释放度均可达到90%以上。由图 11可知, 复合物的药物释放受pH值的影响, 在pH 1.0的介质中释药速率最快, 而在pH 4.5和pH 6.8的介质中释药相对缓慢。
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Figure 11 In vitro release profiles of BBH-IRP69 complex in dissolution medium of pH 1.0, pH 4.5 and pH 6.8, which containing 0% (a), 1% (b) and 2% (c) SDS, respectively. n = 3, x±s |
在本实验中, BBH-IRP69复合物在不含pH 1.0、4.5和6.8的介质中均不能很好地溶出, 根据文献[16]报道, 在某溶出介质中, 转速至100 r·min-1而结束时间点溶出量仍达不到90%时, 则可在溶出介质中添加表面活性剂, 如使用磷酸二氢钾配制pH 6.8 PBS, 则缓冲液中K+会与SDS生成溶解度更低的十二烷基硫酸钾, 使溶出液在室温下产生十二烷基硫酸钾沉淀, 由于共沉淀效应使得待测成分一同析出。因此, 本实验中使用pKa值相近的等摩尔磷酸二氢钠替换磷酸二氢钾。
盐酸小檗碱片和BBH-IRP69复合物在人工唾液中的累积释放曲线如图 12所示, 由图可见, 盐酸小檗碱片在唾液环境中可完全释放, 而BBH-IRP69复合物仅释放约10%, 尤其是在前5 min内几乎不释放。因此, 可认为复合物具有很好的掩味效果。
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Figure 12 Release profiles in artificial saliva of BBH-IRP69 complex and berberine hydrochloride tablet. n = 3, x±s |
本研究首次阐明了在一定温度范围内, 一定浓度的乙醇中BBH的溶解度与温度呈指数关系, 并在实验中将该曲线用于指导复合物的制备工艺。BBH-IRP69复合物的制备流程如图 13。
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Figure 13 A schematic diagram of preparing BBH-IRP69 complex |
通过该工艺流程制得的复合物载药量35%, 药物利用率64%。BBH和IRP69之间是以离子键的形式结合。该复合物在pH 1.0的介质中释药速率最快, 完全释放需1 h; 在pH 4.5和6.8的介质中释药相对缓慢, 完全释放需4 h; 在人工唾液中几乎不释放, 即该复合物可以达到很好的掩味效果, 为BBH的掩味提供了新思路, 也为后续制备适宜儿童服用的BBH新剂型奠定了基础。
作者贡献: 张天翼完成了实验和论文撰写; 杜若飞、王优杰和胡佳亮协助完成; 吴飞为本文修改和指导; 冯怡提出实验思路与理念。
利益冲突: 所有作者声明本文无任何利益冲突。
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