2. 安徽医科大学, 安徽 合肥 230032;
3. 广东药科大学, 广东 广州 510006
2. Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
麦冬中含有多种甾体皂苷类成分, 麦冬总皂苷具有保护消化系统、心血管系统、抗炎和抗肿瘤作用。其中麦冬皂苷D (ophiopogonin D, OPD) 具有较强的生物活性, 能增强心血管功能、抗心肌损伤和抗炎。中药麦冬中的另一种皂苷类成分麦冬皂苷D' (ophiopogonin D', OPD'), 是麦冬皂苷D的同分异构体, 但药理作用存在显著差异。本课题前期研究首次发现OPD'具有明显的心脏毒性[1], 而OPD显示出良好的心肌保护作用, 对心脏表达的CYP2J3 (鼠源) 和CYP2J2 (人源) 均具有较强的诱导作用[2, 3]。并且OPD能够干预内质网应激从而减轻OPD'所致的心肌细胞损伤[4]。铁死亡是一种新型的细胞程序死亡方式, 是由于细胞内铁依赖脂质活性氧积聚过多而发生的一种可调节性细胞死亡形式[5]。研究表明, 铁死亡参与了心血管疾病的发生发展, 是心肌细胞死亡的重要形式[6]。前期作者通过转录组分析发现OPD'可能会引起铁死亡相关通路变化, 本部分实验拟观察OPD'心肌细胞毒性是否与铁死亡密切相关, 以及OPD能否对OPD'所致的铁死亡具有逆转作用, 为中药麦冬的临床使用提供相关实验依据。
材料与方法药品与试剂 OPD及OPD' (上海一飞生物科技有限公司, 纯度≥98%); 铁离子比色法检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司); FerroOrange荧光探针(上海东仁化学科技有限公司); ROS检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司); GSH-Px检测试剂盒、GSH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所); FTH1和SLC7A11一抗(成都正能生物技术有限责任公司); ACSL4、TFR1、COX2、NOX1和GPX4一抗(Proteintech公司); GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 一抗(美国CST公司); 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG二抗(美国Santa Cruz公司)。
仪器 恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司); 二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司); 低速离心机(北京京立离心机有限公司); 超净工作台(北京长城空气净化设备公司); 精密分析天平(德国Sartorious公司); 脱色摇床(Kylin Bell Lab Instruments公司); 涡旋混合器(Kylin Bell Lab Instruments公司); Microfuge 22RB型离心机(美国Beckman公司); 电泳仪、电泳槽(美国BIO-RAD公司); ImageQuantLas 500型显影仪(美国Cytiva公司); VICTOR X型多标记酶标仪(美国Perkin Elmer公司); 细胞计数器(深圳市瑞沃德生命科技有限公司); 超微量分光光度计(NANODROP 8000); 激光扫描共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)。
细胞培养及药物处理 大鼠心肌细胞H9c2细胞(北京协和细胞库中心), 用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基培养。取对数生长期细胞进行后续实验。OPD和OPD'用DMSO溶解配成20×103 μmol·L-1储备液, 于-20 ℃冰箱保存备用。
CCK-8检测大鼠心肌细胞活力 将对数生长期的H9c2细胞以每孔1×104个的密度接种于96孔培养板, 分为对照组、给药组、空白组(不种细胞)。待细胞密度至80%时, 给予不同浓度的OPD'及OPD和OPD', 并培养24 h。弃去培养基后, 用PBS (phosphate buffer saline) 清洗1次, 向每孔中加入100 μL含有CCK-8的DMEM空白培养基。将96孔板放入培养箱中孵育至吸光度为0.8~1, 用VICTOR型多标记酶标仪测定490 nm处吸光度(A490) 值。
铁离子比色法检测大鼠心肌细胞铁离子含量 将对数生长期的细胞接种于6孔培养板中, 待细胞充分贴壁后, 分为对照组、OPD' (1 μmol·L-1) 组、OPD' + OPD组(1 μmol·L-1 + 0.5 μmol·L-1、1 μmol·L-1 + 1 μmol·L-1、1 μmol·L-1 + 2 μmol·L-1), 处理细胞24 h, 收集细胞, 用PBS清洗2次(下同)。加入200 μL裂解液, 于摇床裂解2 h。12 000 ×g, 10 min, 4 ℃离心, 留取上清液。按照试剂盒说明书加入相应试剂, 于550 nm处测得吸光度, 绘制标准曲线并计算铁离子浓度。
激光共聚焦检测大鼠心肌细胞内Fe2+的含量 将H9c2细胞接种于激光共聚焦小皿中, 在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。将不同浓度的OPD及OPD'加入培养基中, 培养细胞24 h。除去培养液, 并用HBSS (hanks balanced salt solutions) 或无血清培养基洗涤细胞3次。加入FerroOrange工作液(1 μmol·L-1), 在37 ℃、5% CO2培养箱中培养30 min。在荧光显微镜下观察, 波长为561 nm/570~620 nm。
流式细胞术检测细胞内活性氧的含量 收集给药处理后的细胞, 加入500 μL DCEH-DA稀释液(10 μmol·L-1), 于37 ℃细胞培养箱中孵育20 min。每隔5 min颠倒混匀1次, 共4次。用空白培养基洗涤细胞3次, 去除细胞外探针。活性氧阳性对照(Rosup) 需孵育20 min以上。用流式细胞仪进行检测, 激发波长488 nm, 发射波长525 nm。
细胞内GSH-Px及GSH含量的检测 收集给药处理后的细胞, 加入PBS清洗2~3次。GSH-Px的检测按照试剂盒说明书进行, 于412 nm检测(1 cm光径比色杯, 蒸馏水调零), 测各管吸光度A值。GSH含量的检测按照试剂盒说明书进行, 于405 nm处, 酶标仪测定各孔A值。
Western blot法检测铁死亡相关蛋白的表达变化 收集给药处理后的细胞, 加入PBS清洗2~3次。加入含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液, 冰上裂解30 min, 于超声破碎仪中破碎细胞, 4 ℃、12 000 ×g, 离心15 min, 取上清进行BCA (bicinchoninic acid) 定量, 加入上样缓冲液于100 ℃金属浴中加热10 min进行变性。取30 μg总蛋白进行聚丙酰胺凝胶电泳, 将目的蛋白条带转印至PVDF (polyvinylidene fluoride) 膜上, TBST (TBS + Tween) 配制的5%脱脂奶粉室温封闭3 h, 孵一抗过夜后, 加入二抗, 室温孵育1 h后显影。使用Image J软件进行光密度分析, 将目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度值之比作为1。
统计学分析 实验结果均以x ± s表示, 采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。多组数据比较采用方差分析(one-way ANOVA), 两组数据比较采用学生t检验(student's t test); P < 0.05表明差异具有统计学意义。相关分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行。
结果 1 OPD'对H9c2细胞存活率的影响不同浓度的OPD' (0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5和10 μmol·L-1) 处理H9c2细胞24 h后, CCK-8测定OPD'对心肌细胞存活率的影响, 实验结果如图 1。OPD'对H9c2细胞存活率有显著的毒性作用, 并呈一定浓度依赖性(P < 0.05)。从实验结果可以看出, 当OPD'为5 μmol·L-1时, H9c2细胞存活率显著下降至50%左右, 显示出明确的心肌细胞毒性。与本研究之前发表的OPD'通过内质网应激途径造成心肌细胞毒性具有一致性[4], 但本文所采用的OPD'浓度范围为(0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5和10 μmol·L-1), 与本实验室之前发表文章的OPD'浓度范围(1~100 μmol·L-1) 具有互补性, 主要是考察OPD'在更低浓度范围内是否对H9c2的细胞存活率有影响。
根据上面CCK-8细胞活力实验结果, 本部分实验选定1 μmol·L-1的OPD'与不同浓度的OPD共处理H9c2细胞24 h, 通过CCK-8法观察OPD对OPD'所致的H9c2细胞毒性是否有干预作用, 实验结果如图 2。与对照组相比, 1 μmol·L-1的OPD'可致H9c2细胞死亡, 细胞存活率下降至65%左右(P < 0.001); 与OPD'组相比, OPD与OPD'共处理时, 当OPD > 1 μmol·L-1时, 能够逆转OPD'所致的H9c2细胞损伤, 并呈一定的浓度依赖性(P < 0.05)。
由于铁死亡主要表现为铁超载和氧化还原失衡, 所以这部分实验将检测细胞内Fe2+的含量。根据上述CCK-8实验结果, 选取0.5、1和2 μmol·L-1的OPD预处理H9c2细胞1 h, 再加入OPD'共处理24 h, 检测细胞内Fe2+含量的变化, 实验结果如图 3所示。与空白对照组相比, OPD'处理组细胞内Fe2+含量有明显升高(P < 0.05); 而提前加入OPD预处理的细胞, 其细胞内Fe2+含量有所下降, 与OPD'处理组相比有显著差异(P < 0.05)。
FerroOrange是一种新型荧光探针, 可对活细胞内的Fe2+进行荧光成像, 以此判断细胞内Fe2+的含量变化, 实验结果如图 4。与对照组相比, OPD'处理组的荧光强度明显增强; 而OPD和OPD'共处理组的细胞内荧光强度又有所减弱。实验结果证明, OPD'能引起H9c2细胞内铁超载, 而OPD则能部分逆转其引起的铁超载。
ROS是一种含氧的化学反应性化学物质, 其在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用, 能一定程度表明细胞的生长状态。利用DCFH-DA探针检测细胞内ROS的含量, 实验结果如图 5。与对照组相比, OPD'处理H9c2细胞后可刺激细胞内ROS的产生(P < 0.01); 而经OPD干预后可部分抑制ROS的产生(P < 0.05)。
细胞内的总GSH中通常90%~95%为还原型谷胱甘肽, 而还原型的谷胱甘肽是细胞抗氧化防御的关键保护物质。GSH-Px作为一种重要的过氧化物分解酶, 能够催化GSH转化为GSSG [L-glutathione (oxidized)], 这有助于将有毒的过氧化物转化为无毒的羟基化合物, 从而保护细胞膜的结构和功能免受过氧化物的影响。实验结果如图 6所示, 与对照组细胞相比, H9c2细胞经OPD'处理后, 细胞内的GSH-Px含量上升, GSH耗竭(P < 0.01); 而经OPD干预后, 细胞内的GSH含量有所上升, GSH-Px大致恢复平衡状态, 并呈一定的浓度依赖性(P < 0.05)。
为了进一步确定OPD'是否通过引起心肌细胞的铁紊乱和氧化应激失衡而引起铁死亡, 以及OPD是否能干预OPD'所引起的铁死亡, 通过Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达, 实验结果如图 7所示。与对照组相比, OPD'可明显诱导TFR1、COX2、NOX1、ACSL4以及SLC7A11的表达, 而使GPX4和FTH1表达有所下降(P < 0.05); 加入不同浓度OPD处理后可显著逆转OPD'所致的损伤, 使铁死亡相关蛋白TFR1、COX2、NOX1、ACSL4以及SLC7A11的表达有不同程度的下降, GPX4和FTH1的蛋白表达有所上升(P < 0.05)。
中药麦冬作为传统大宗的中药材品种, 以往研究多集中于其心血管保护和相关药理机制, 而对相关皂苷成分的毒性作用研究较少。OPD'作为OPD的同分异构体, 关于其药理毒理作用研究也很少。本实验室前期研究首次发现, OPD'可能通过诱导H9c2细胞发生内质网应激反应而对H9c2细胞具有毒性作用, 诱导细胞的凋亡, 并且当OPD和OPD'共处理H9c2细胞时, OPD能够通过内质网应激途径减轻OPD'所致的H9c2细胞损伤[4]。内质网应激实验中OPD'作用浓度为6 μmol·L-1, OPD的浓度范围为(1~24 μmol·L-1)。本文选定OPD'浓度为1 μmol·L-1时探究其是否通过铁死亡通路对心肌细胞产生毒性, 当OPD浓度为(0.5~5 μmol·L-1) 时对心肌细胞有一定的保护作用, 提示不同作用途径其浓度存在明显差异。OPD'在较低浓度(1 μmol·L-1) 即可影响Fe2+浓度, 从而可能通过铁死亡途径产生心肌细胞毒性, 且OPD在较低浓度范围(0.5~5 μmol·L-1) 即可产生逆转, 显示出OPD'心肌细胞毒性的多途径和多浓度响应。OPD与OPD'为同分异构体, 二者结构非常相似, 侧链分别为吡喃木糖和鼠李糖, 在糖链类型和游离羟基取代位置上有所差异, 此差异是其药理作用存在如此大差异的关键信息, 具体构效或构毒关系仍需在今后工作中进一步研究加以确证。
铁死亡是首次由Dixon等[7]于2012年新发现的一种细胞死亡方式, 其与正常细胞凋亡和坏死不同, 铁死亡的特征是细胞内伴随着脂质过氧化的铁超载, 其涉及的机制主要与铁超载、脂质过氧化失衡以及半胱氨酸转运体受阻有关。
铁是人体重要的必需微量元素, 正常人体内两分子Fe3+结合一分子转铁蛋白(Tf) 形成复合物, 细胞膜表面的转铁蛋白受体1 (TRF1) 作为细胞摄取铁所必需的细胞表面受体, 可将机体内的Fe3+转运到细胞内, 在二价金属转运蛋白(DMT1) 的作用下可将Fe3+还原为Fe2+, 此过程受到铁蛋白(FTH1和FTL) 以及铁调素等多种蛋白的调节[8, 9]。实验表明上调TFR1的表达可增加铁的摄取; FTH1和FTL的表达下调可减少铁的储存, 释放大量的游离铁[10], 从而使细胞内的铁超载。当细胞内铁代谢失衡时会导致氧化以及抗氧化失衡。因为Fe2+通过氧化还原到Fe3+需要电子的转移, 所以铁经常参与底物之间的电子迁移[11]; Fe2+可以与H2O2通过芬顿样反应产生羟基自由基, 具有更强的氧化能力, 从而使细胞内的ROS水平升高[12], 这是铁诱导氧化应激反应发生的机制。当ROS产量过多时, 会破坏细胞的蛋白质、脂质以及DNA, 对细胞和组织造成伤害[13], 引发铁死亡。因此, 铁超载会加剧铁死亡的发生。
GSH具有抗氧化应激作用, 能及时有效清除细胞内过多的ROS, 并以此维持细胞的完整和稳态。此外, GSH也是GPX4发挥抗氧化功能所必需的辅助因子[14]。GSH的合成需要半胱氨酸参与, 而半胱氨酸转运体(由SLC3A2和SLC7A11组成) 是细胞摄取半胱氨酸的一条重要途径[15]。研究表明, 当半胱氨酸转运体受阻时, 细胞内的半胱氨酸含量减少, 导致GSH合成减少, GPX4活性缺失, 清除细胞内过多ROS的能力下降, 使ROS堆积, 从而加剧了细胞的铁死亡。
ROS在机体的新陈代谢中起重要作用。过量ROS与细胞膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链以及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应, 形成MDA和LPO等脂质过氧化产物, 改变细胞膜的流动性和通透性, 从而改变细胞结构和功能[16]。Doll等[17]研究发现, 敲除ACSL4时, 细胞铁死亡受到明显抑制, 表明ACSL4通过氧化细胞膜磷脂驱动铁死亡。
一般来说, NOX1是细胞内超氧化物或过氧化氢的产生来源之一[18, 19], ROS的释放也可部分归因于NOX1的调节; COX2是前列腺素生物合成中的关键酶, 参与炎症级联反应, 也是参与铁死亡的一种过氧化物酶。二者表达增多会加剧细胞的铁死亡。
本实验结果表明, OPD'能诱导H9c2细胞发生铁死亡, 具体表现包括: 当1 μmol·L-1的OPD'作用于细胞24 h后, Fe2+含量增多, 使细胞发生铁超载; ROS含量明显增多; GSH含量明显减少, GSH-Px含量增多; 铁死亡相关蛋白TFRC、COX2、NOX1、ACSL4以及SLC7A11的表达增多, GPX4和FTH1的蛋白表达下降。加入不同浓度的OPD共处理后, 细胞内的铁超载现象得到部分逆转; GSH含量明显增多, 而过多的ROS含量有所下降; OPD浓度为0.5~2 μmol·L-1时, TFR1、COX2、NOX1、ACSL4以及SLC7A11的表达减少, GPX4和FTH1的蛋白表达有所上升, 并呈一定的浓度依赖性, 从而减轻OPD'所致的铁死亡。
综上所述, OPD'的确诱导了大鼠心肌细胞的铁死亡, 而OPD可能通过减轻细胞内的铁超载、脂质过氧化失衡以及半胱氨酸转运体受阻从而减轻OPD'诱导大鼠心肌细胞的铁死亡。麦冬作为我国传统的大宗中药材, 是药典常用中药材大品种之一, 其药材的安全性应受到足够重视, 中药材内相关成分的毒性效应不应简单作为判断中药材毒性的依据。从本研究看, OPD在麦冬中含量约为OPD'的1~3倍, 其能够明显通过干预内质网应激[4]和铁死亡途径降低OPD'的心脏毒性。因此对于中药整体毒性的研究远不应看某一种单体成分毒性效应, 应将中药毒性置于中药整体或方剂环境下进行考虑, 中药材内部成分间相互作用及不同中药材成分间的相互作用可能会对中药材整体质量产生综合作用, 这也体现了中医整体和配伍减毒增效的科学内涵。
作者贡献: 王宇光、高月负责提出研究选题及设计研究方案; 林毅、连闻雨、杨春启负责实施研究过程; 谭洪玲、肖成荣负责材料支持; 高月、王宇光负责技术指导和论文修改。
利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。
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