药学学报  2021, Vol. 56 Issue (7): 2025-2032 DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0225 |
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甘草(Glycyrrhiza uralensis、Glycyrrhiza inflata、Glycyrrhiza glabra) 是我国最常用的大宗药材之一, 具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等功效, 素有“国老”之美誉。三萜类化合物甘草酸是《中华人民共和国药典》 (2020版) 规定的甘草指标性成分之一[1]。现代药理学研究表明甘草酸是甘草发挥抗病毒[2]、抗炎[3]、保肝[4]等作用的主要活性成分, 临床应用广泛。因此, 提高甘草酸含量对于保证甘草药材的药效具有重要意义。
二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP) 和异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP) 是萜类化合物的共同前体, 由2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate, MEP) 途径和甲羟戊酸(mevalonate pathway, MVA) 途径共同合成。因此, 这两条途径均对甘草酸的生物合成具有重要影响。本课题组前期转录组研究表明, MEP途径上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS) 基因的表达水平与甘草酸含量呈负相关[5]。DXS是MEP途径的第一个限速酶[6], 在植物萜类生物合成过程中发挥着重要调控作用, 已有研究表明其基因表达水平高低直接影响萜类次生代谢产物的积累[7], 但甘草中有关DXS基因的研究报道则较少。因此, 本文拟克隆甘草DXS基因, 并从基因过表达和沉默两个方面解析其对甘草酸生物合成的调控作用。
DXS首次在薄荷Mentha piperita中克隆得到后, 已在近百种植物中克隆得到该基因[8]。根据目前报道, 植物中的DXS基因家族编码3种类型DXS蛋白, 均催化MEP途径的第一步反应, 但在萜类生物合成过程中的作用略有不同。DXS1与类胡萝卜素及叶绿素的合成相关[9]; DXS2参与如青蒿素等特定萜类化合物的生物合成[10]; DXS3的相关报道较少, 部分研究表明其参与合成某些萜类植物激素[11]。
毛状根是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后于植物创伤表面诱导产生的一种病理组织, 其具有生长稳定、培养条件可控、方便施加处理等优点, 是研究植物基因功能的良好遗传体系[12, 13]。目前, 已有学者利用毛状根体系在不同植物中开展基因过表达或沉默的相关研究, 如: 在丹参Salvia miltiorrhiza毛状根中过表达转录因子SmWRKY2可显著增加毛状根中丹参酮的含量[14]; 在杜鹃Duboisia leichhardtii毛状根中沉默喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinic acid phosphoribosyl transferase, QPT) 基因可显著提高毛状根中东莨菪碱的含量[15]; 在马铃薯Solanum tuberosum毛状根中敲除转录因子St16DOX可显著降低毛状根中甾体糖类生物碱的积累[16]。本课题组前期研究也表明在甘草G. uralensis毛状根中过表达查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI) 和查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS) 基因能显著提高毛状根中黄酮类化合物的含量[17, 18], 过表达β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase, β-AS) 基因可显著增加甘草毛状根中甘草酸的含量[19]。因此, 本文也将采用甘草毛状根培养体系, 对DXS基因的功能开展研究, 为进一步构建甘草酸生物合成的分子调控网络奠定基础。
材料与方法PCR引物及程序 本文中采用了大量的PCR方法, 为方便起见, 将所有PCR引物列于表 1, 程序列于表 2。本文全部引物合成及测序均由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成。
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Table 1 Primers used in this study |
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Table 2 PCR programs used in this study |
甘草DXS基因克隆 采用RNA提取试剂盒(生工生物工程(上海) 股份有限公司) 提取甘草根样总RNA; 采用cDNA合成试剂盒(生工生物工程(上海) 股份有限公司) 逆转录获得甘草cDNA; 利用基因组文件(http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/download.pl) 获得甘草DXS基因CDS序列, 使用Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 设计特异性引物PP1, 并采用PCR程序1对DXS基因进行扩增。采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司) 对PCR产物进行胶回收纯化, T连接(pMD-19T载体, TaKaRa公司), 转化大肠杆菌Top 10感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司), 在含有氨苄青霉素(ampicillin, Amp) 50 mg·L-1的LB平板上筛选阳性克隆, 并对其进行PCR验证和测序验证。
DXS基因过表达载体的构建及验证 根据BM无缝克隆试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司) 设计带有酶切位点Spe Ⅰ和Bgl Ⅱ及载体同源序列的引物PP2, 以上述构建的T质粒为模板, 采用PCR反应程序2对DXS基因进行扩增, 并对PCR产物进行胶回收纯化。采用限制性内切酶Spe I和Bgl II (TaKaRa公司) 对pCAMBIA1305.1 (美国Abcam公司) 进行双酶切, 37 ℃、1 h, 胶回收纯化载体片段。将PCR纯化产物与线性化载体(摩尔比3∶1) 在50 ℃条件下连接30 min, 连接产物转化大肠杆菌Top 10感受态细胞, 在含有卡那霉素(kanamycin, Kan) 50 mg·L-1和潮霉素(hygromycin, Hyg) 20 mg·L-1的LB平板上筛选阳性克隆, PCR及测序验证后, 将正确的质粒命名为pCA-DXS。
DXS基因编辑CRISPR/Cas9载体构建及验证 根据DXS基因第一外显子, 使用在线工具Benchling (https://www.benchling.com/notebook/) 设计DXS基因sgRNA前导序列: F: 5'-ATTGAAAGCTCCAACTCC GAACCA-3'; R: 5'-AAACTGGTTCGGAGTTGGAGC TTT-3'。95 ℃下将单链sgRNA退火成双链(5 min), 自然冷却至室温。采用限制性内切酶Bsa Ⅰ对pHSE401 (Addgene公司) 进行酶切, 37 ℃、1 h, 胶回收纯化线性化载体。利用T4 DNA连接酶(NEB公司) 连接线性化载体与退火后的sgRNA, 25 ℃、10 min, 连接产物转化大肠杆菌Top 10感受态细胞, 在LB平板(+Kan 50 mg·L-1) 上筛选阳性克隆。在两个Bsa Ⅰ酶切位点的上下游200 bp处设计引物PP3, 对基因沉默载体进行PCR验证, 测序验证后, 将正确的质粒命名为pHSE-DXS。
发根农杆菌ATCC15834工程菌的构建 在C: 25 μF、PC: 200 Ω、U: 2 400 V条件下采用电转法将重组质粒pCA-DXS和pHSE-DXS转入发根农杆菌ATCC15834感受态细胞, 在TY (+Kan 50 mg·L-1) 平板上筛选阳性克隆。分别采用引物PP1、PCR程序1和引物PP3、PCR程序3对携带PCA-DXS和pHSE-DXS的发根农杆菌工程菌进行PCR验证, 将PCR产物送测序。将测序验证正确的发根农杆菌工程菌接种于TY液体培养基中, 在180 r·min-1、25 ℃条件下进行液体悬浮培养至对数生长期(OD600 = 0.5), 收集菌液并离心, 重悬于等体积的6, 7-V液体培养基中。
甘草毛状根的诱导及培养 在无菌条件下对饱满健康的甘草种子进行表面灭菌(75%乙醇浸泡1 min, 1%升汞浸泡8 min), 无菌水冲洗5次, 无菌滤纸吸干多余水分, 接种于MS固体培养基, 在自然光照条件下培养7~10天即可获得甘草无菌苗。在超净工作台上切取甘草无菌苗的胚轴部位作为外植体材料, 完全浸没于上述6, 7-V重悬菌液中30 min, 无菌滤纸吸干多余菌液后转接于6, 7-V固体培养基上, 在黑暗条件下共培养2天。采用500 mg·L-1头孢噻肟(cefotaxime, Cef) 水溶液对甘草胚轴进行浸泡除菌5 min, 转接于6, 7-V固体培养基(+500 mg·L-1 Cef) 上。在相同条件下诱导野生型甘草毛状根(诱导菌种为发根农杆菌ATCC15834) 和阴性对照组甘草毛状根(诱导菌种分别为携带空质粒pCAMBIA1305.1和pHSE401的发根农杆菌)。每隔7天转接继代, 并逐步降低Cef的浓度, 直至ATCC15834工程菌发根农杆菌完全除净。
甘草毛状根验证 采用DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海) 股份有限公司) 提取各甘草毛状根系DNA, 采用引物PP4和PCR程序4对各甘草毛状根样品的rolC基因进行PCR扩增, 并进一步进行测序验证。采用引物PP1和PCR程序1对DXS基因过表达甘草毛状根样品中的DXS基因进行PCR扩增并进一步测序验证。采用引物对PP5和PCR程序5对DXS基因沉默甘草毛状根样品中的DXS基因第一外显子进行扩增, 将扩增产物连接至pMD-19T载体, 并转化入大肠杆菌Top 10感受态细胞, 在LB平板(+Amp 50 mg·L-1) 上筛选阳性克隆, 随机挑取多个单克隆, 测序至饱和, 采用软件DNAMAN 6.0.3.99分析DXS基因的编辑情况。
UPLC法测定甘草毛状根中甘草酸含量 甘草毛状根液体培养: 无菌条件下称取验证正确且生长状态良好的各甘草毛状根样品2.0 g, 每个样品3个生物学重复, 接种于6, 7-V液体培养基中, 于25 ℃、110 r·min-1条件下培养3周。UPLC供试品制备: 将液体培养的各毛状根样品洗净, 于60 ℃条件下烘干至恒重, 研磨成粉, 过60目筛, 收集粉末。精密称取上述各甘草毛状根样品粉末0.1 g于50 mL量瓶中, 以50%甲醇水溶液定容, 于频率40 kHz、功率500 W条件下超声提取30 min, 采用0.45 μm滤膜对提取液过滤处理, 作为UPLC分析的供试品。线性分析: 精密称取甘草酸单铵盐标准品(成都曼斯特生物科技有限公司, 纯度98.86%) 4.34 mg, 溶解于50%甲醇水溶液中, 配制成浓度梯度溶液, 梯度如下: 0.085 8、0.068 6、0.051 5、0.042 9、0.017 2、0.008 58、0.004 3 mg‧mL-1。甘草酸含量测定: 采用UPLC法对各甘草毛状根样品中的甘草酸进行含量测定[20], 色谱系统: 配备UPLC ACQUITY PDA eλ检测器的Waters UPLC ACQUITY; 色谱柱: ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm); 流动相: 乙腈(A)/0.05%磷酸溶液(B), 洗脱程序: 0~1.36 min 14%~23% A相, 1.36~3.26 min 23%~30% A相, 3.26~4.08 min 30%~34% A相, 4.08~4.76 min 34%~36% A相, 4.76~5.71 min 36%~42% A相, 5.71~6.53 min 42%~51% A相, 6.53~9.00 min 51% A相, 9.00~9.50 min 51%~14% A相, 9.50~12.00 min 14% A相; 柱温: 40 ℃; 流速: 0.3 mL·min-1; 进样量: 1 μL; 检测波长: 250 nm。
结果与分析 1 DXS基因克隆及载体构建由图 1a可知, PCR扩增得到了长度约为2 300 bp的特异性条带, BLAST比对结果显示该片段与豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus的DXS cDNA序列相似度高达89%, DXS氨基酸序列的相似度高达88%, 表明所克隆序列为甘草DXS基因cDNA序列, 在GenBank上对所获序列进行注册, 注册号为: MN158121。重组质粒pCA-DXS的PCR验证结果如图 1b所示, 扩增获得了长度约为2 300 bp的片段, 与目标序列DXS长度一致, 测序结果显示此片段与上述注册序列DXS (MN158121) 具有100%的一致性。重组质粒pHSE-DXS的PCR验证结果如图 1c所示, 扩增获得了长度约为500 bp的片段, 长度符合引物PP3的扩增预期, 测序结果表明此片段在两个Bsa Ⅰ酶切位点之间包含与sgRNA序列一致性为100%的序列。以上结果表明重组质粒pCA-DXS和pHSE-DXS均构建正确。
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Figure 1 PCR verification results of DXS and recombinant vectors. a: DXS cloned from Glycyrrhiza glabra L. b: DXS amplified from pCA-DXS. c: 500 bp-fragments containing sgRNA sequences amplified from pHSE-DXS |
图 2为培养1周和4周的甘草毛状根的生长情况, 包括: 野生型甘草毛状根(wild type, WT)、携带空载体pCAMBIA1305.1的阴性对照甘草毛状根(NC-PCA)、携带空载体pHSE401的阴性对照甘草毛状根(NC-PHSE)、DXS基因过表达的甘草毛状根(DXS+) 及DXS基因沉默的甘草毛状根(DXS-), 由图可见, 培养1周时, 外植体胚轴上尚未出现毛状根, 随着继代和除菌的进行, 在培养4周后, 各毛状根系均长势良好, 颜色为黄白色。
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Figure 2 Licorice hairy roots after induction and culturing for 1 week and 4 weeks. WT: Wild type hairy root; NC-PCA: Negative control hairy root containing empty pCAMBIA1305.1; NC-PHSE: Negative control hairy root containing empty pHSE401; DXS+: Hairy root overexpressing DXS, DXS-: Hairy root knocking out DXS |
甘草毛状根中rolC基因的PCR扩增结果如图 3a所示, 600 bp的特异性条带清晰明亮, 测序结果显示其与rolC基因(GenBank登录号: DQ160187.1) 一致性为100%。DXS基因过表达甘草毛状根系中DXS基因的PCR验证结果图 3b所示, 扩增得到与目标基因DXS长度一致的条带, 测序结果显示其与DXS原序列一致性为100%, 表明DXS基因过表达甘草毛状根系构建正确。DXS基因沉默甘草毛状根系中DXS基因第一外显子的PCR扩增结果如图 3c所示, 获得了480 bp左右的条带, 长度正确; 克隆测序结果显示, 检测的6个甘草毛状根系中有4个发生了DXS基因编辑, 基因编辑率为66.7%, 克隆测序峰图如图 3d所示, DXS基因编辑情况列于表 3中。4个DXS基因沉默甘草毛状根系中DXS--1和DXS--8为杂合子, 均有不同数量的碱基剪除发生; DXS--9和DXS--10为纯合子, 且基因编辑情况相同, 均剪除9个碱基。综上, 经过PCR验证及测序验证, 共获得了5组甘草毛状根样品, 即: WT (1样品)、NC-PCA (1样品)、NC-PHSE (1样品)、DXS+ (6样品)、DXS- (4样品), 用于后续液体培养及UPLC分析。
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Figure 3 PCR and sequencing results. a: Shows the rolC amplified from each hairy root line; b: Shows the DXS amplified from DXS+ lines; c: Shows the first exon of DXS amplified from DXS- lines; d: Shows the editing sites of DXS gene in DXS- lines. ▲: Editing sites |
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Table 3 DXS gene editing sites |
液体培养3周后的各甘草毛状根系如图 4a所示, 根系生长迅速且状态良好。UPLC色谱图如图 4b所示, Ⅰ为甘草酸对照品的色谱图, 显示甘草酸保留时间为6.797 min, Ⅱ~Ⅵ依次为WT、NC-PCA、NC-PHSE、DXS+、DXS-毛状根样品的色谱图。甘草酸标准曲线回归方程为Y = 2 792 995.69 X - 931.23 (R2 = 1), 线性范围为0.00 43~0.085 8 μg‧mL-1。图 5a为各甘草毛状根样品中甘草酸含量的比较分析, 运用SAS 8.0软件对甘草酸含量进行样品间非参数检验, 结果显示: 全部6个DXS过表达甘草毛状根样品中甘草酸含量均显著低于NC-PCA, 4个样品(DXS+-2、3、5、6) 中甘草酸含量显著低于WT; 4个DXS基因沉默毛状根样品中有3个样品(DXS--8、9、10) 的甘草酸含量显著高于WT及NC-PHSE。图 5b为5组毛状根样品中甘草酸含量的比较分析, 运用SAS 8.0软件对甘草酸含量进行组间非参数检验, 结果表明DXS-组甘草毛状根中甘草酸含量显著高于WT组和NC-PHSE组, 而DXS+组中甘草酸含量则显著低于WT组和NC-PCA组, DXS+组的甘草酸含量仅为DXS-组的1/2。
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Figure 4 UPLC sample preparation and GA content assay. a: Hairy root samples culturing in liquid 6, 7-V medium for 3 weeks. b: UPLC chromatograms. Line Ⅰ is the UPLC chromatogram of GA reference substance, line Ⅱ-Ⅵ are UPLC chromatograms of sample WT, NC-PCA, NC-PHSE, DXS+, and DXS- |
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Figure 5 GA content analysis in licorice hairy roots. a: GA content in each hairy root sample; b: GA content in different groups. *P < 0.05 vs WT, #P < 0.05 vs NC-PHSE, ψP < 0.05 vs NC-PCA |
本文克隆了甘草DXS基因, 分别构建了DXS过表达载体pCA-DXS和沉默载体pHSE-DXS, 利用发根农杆菌ATCC15834介导法, 诱导产生了DXS基因过表达及沉默的甘草毛状根系DXS+和DXS-。采用UPLC法分析各甘草毛状根样品中甘草酸的含量, 结果表明: DXS-组甘草酸含量显著高于WT组和NC-PHSE组, 而DXS+组甘草酸含量则显著低于WT组和NC-PCA组, 从而证实了DXS基因对甘草中甘草酸生物合成发挥负调控作用, DXS基因沉默能显著提高甘草毛状根中甘草酸的含量, 此结果也与课题组前期转录组研究结果相吻合。
萜类合成的MVA途径和MEP途径在植物细胞的不同区域独立进行, 前者存在于细胞质中, 主要合成倍半萜、三萜及一些多萜, 后者则存在于质体中, 主要合成单萜、二萜及类胡萝卜素等萜类化合物[21]。MVA途径以乙酰辅酶A为起始物[22, 23], MEP途径则以3-磷酸甘油醛和丙酮酸为起始物[24], 但两途径之间也存在关联, 包括一些中间代谢产物的交换, 且有时会出现输送的单向性倾向[25, 26]。乙酰辅酶A的生物合成途径除了泛酸这一通路以外, 也可从葡萄糖开始, 中间经过了3-磷酸甘油醛和丙酮酸。DXS作为MEP途径上的第一个关键酶, 其基因沉默, 增加了3-磷酸甘油醛和丙酮酸的积累, 这可能有利于细胞质中乙酰辅酶A的合成, 使得MVA途径的起始底物增多, 进而促进了作为三萜类物质的甘草酸的合成。当DXS表达量升高时, 则不利于乙酰辅酶A的合成, 从而导致甘草毛状根中甘草酸含量的下降。在DXS沉默甘草毛状根品系中, DXS--1为杂合突变, 在74~80 bp之间发生碱基剪除, 与野生型及阴性对照甘草毛状根相比, DXS--1样品中甘草酸含量不存在显著差异, 分析发现剪除片段在DXS蛋白催化结构域之外, 因此该片段丢失对DXS编码蛋白活性影响较小。DXS--8为杂合突变, DXS--9和DXS--10为纯合突变, 三个样品均丢失82~90 bp之间的9个碱基, 且甘草酸含量均显著高于WT组和NC-PHSE组, 分析发现88~90 bp碱基所编码的半胱氨酸是底物三磷酸甘油醛的结合位点[27], 因此该基因片段丢失会显著影响DXS编码蛋白活性, 从而影响MVA途径的生物合成, 导致甘草酸含量升高。
今后将继续以甘草毛状根作为实验材料, 陆续开展其他相关功能基因研究, 全面阐释甘草酸生物合成途径分子调控网络, 以期为提高栽培甘草的品质, 以及为甘草毛状根的大规模培养和甘草酸的离体积累奠定基础。
作者贡献: 杨林撰写了论文; 刘颖构思并设计了实验方案; 杨林、田少凯和汪逗逗完成了实验; 张智新和侯嘉铭分析了相关实验数据; 所有作者均阅读并参与修改了这篇文章。
利益冲突: 本文作者均没有利益冲突。
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表1(Table 1)
