药学学报  2021, Vol. 56 Issue (7): 1945-1952     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0160   PDF    
结肠癌中ID1上调OCT4信号通路的机制研究
尚爽, 宋佳玮, 花芳     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室 (BZ0150), 北京 100050
摘要: DNA结合抑制蛋白-1(inhibitor of DNA binding 1,ID1)在结肠癌、肺癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中异常高表达,并与肿瘤恶性进展及患者不良预后密切相关。已有研究发现,ID1在结肠癌中可以维持肿瘤细胞干细胞样特性,介导肿瘤干细胞耐药,但其分子生物学机制并未被完全阐明。通过免疫印迹、基因集富集分析、双荧光素酶报告基因检测及实时定量PCR,本研究发现ID1可从转录水平上调维持肿瘤细胞干性的关键转录因子八聚体结合蛋白(octamer binding transcription factor,OCT4)的蛋白表达及信号通路活性。利用体外成球实验,本研究证明过表达OCT4可逆转敲低ID1对干细胞成球能力的抑制作用。在进一步的机制研究中,利用JASPAR及GEPIA数据库,本研究预测并得到能够负向调控OCT4转录的转录抑制因子叉头蛋白D3(forkhead box D3,FOXD3)。通过免疫共沉淀、免疫荧光共聚焦及实时定量PCR等方法,本研究最终证明ID1通过与转录抑制因子FOXD3相互作用,抑制其活性从而上调OCT4的转录及信号通路活性。综上,本研究为结肠癌干细胞的分子调控机制提供了新的理论基础,研究中发现的ID1-FOXD3蛋白-蛋白相互作用为结肠癌治疗提供了新的潜在干预靶点。
关键词: DNA结合抑制蛋白-1    叉头蛋白D3    八聚体结合转录因子    结肠癌干细胞    转录活性    
The upregulation mechanism of OCT4 signaling by ID1 in colorectal cancer
SHANG Shuang, SONG Jia-wei, HUA Fang     
State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study(BZ0150), Institute of Meteria Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Inhibitor of DNA binding 1 (ID1) has an aberrantly high expression in multiple cancer tissues, including colon cancer, lung cancer, breast cancer, and so on, which is closely related to cancer aggressiveness and poor clinical outcomes in cancer patients. It has been reported that ID1 maintains colorectal cancer cells (CRCs) stemness traits and contributes to the CRC drug resistance. While, the biological molecular mechanisms have not been fully elucidated. In this research, we found that ID1 upregulates octamer binding transcription factor (OCT4) protein level as well as OCT4 signaling pathway via Western blot, gene set enrichment analysis (GSEA), dual-luciferase reporter assay, and real-time PCR. Through the in vitro sphere formation assay, we found that overexpression of OCT4 reverses the inhibitory effect of knocking down ID1 on CRC sphere formation ability. With the help of JASPAR and GEPIA database, we predicted a novel transcriptional repressor-forkhead box D3 (FOXD3) of OCT4. Finally, by using co-immunoprecipitation (Co-IP), confocal and real-time PCR, we demonstrated that ID1 interacts with FOXD3 to inhibit its transcriptional repression activity and therefore to upregulate OCT4 transcription and OCT4 signaling pathway. In conclusion, this study provides a new theoretical basis for the regulation mechanism of colon cancer stem cells, and the newly found protein-protein interaction of ID1-FOXD3 provides a potential drug target for the therapy of CRC.
Key words: inhibitor of DNA binding 1    forkhead box D3    octamer binding transcription factor    colorectal cancer stem cell    transcriptional activity    

结肠癌是全球第三大恶性肿瘤, 发生率占所有癌种的10.2%, 死亡率占所有癌种的9.2%, 且有逐年上升的趋势, 严重威胁人类健康[1-3]。目前, 结肠癌治疗尚无有效的靶向性治疗药物, 主要以手术切除为主, 化疗及放疗为辅。化、放疗不良反应大, 严重降低患者生存质量; 且一旦患者出现耐药、复发或转移, 将使治疗陷入绝境。

结肠癌干细胞(colon cancer stem cells, CCSCs) 的发现为解决结肠癌耐药、复发及转移等问题带来曙光[4]。肿瘤干细胞是一群自我更新能力强、具有高度分化潜能并且可以休眠的细胞类群[5]。其较高的DNA修复能力、解毒酶活性及药物转运蛋白的表达是造成结肠癌治疗中患者耐药和复发的主要机制[6, 7]。最近的研究发现, 肿瘤中存在干细胞池(CSCs niche) 且干细胞具有可塑性, 即肿瘤干细胞可从静止状态向增殖状态转变, 从药物敏感状态向耐药状态转变, 从不对称向对称分裂转变, 并可从干细胞状态向非干细胞状态转变, 这些也是导致肿瘤治疗耐药和复发的关键原因[8-10]。因此, 深入研究调控CCSCs的分子生物学机制, 并寻找靶向CSCs的药物新靶点是治疗结肠癌的潜在策略。

拥有碱基螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH) 结构的转录因子对于细胞分化具有重要调节作用。ID (inhibitor of DNA binding) 家族蛋白具有HLH样结构, 但由于缺乏碱基富含区域而不具备DNA结合能力, 它们主要通过与具有bHLH样结构的转录因子形成二聚体, 负性调控这些转录因子的功能[11, 12]。ID蛋白能够抑制不同细胞类型祖细胞的分化, 促进细胞周期进程, 延缓细胞衰老[13, 14]。这些特性使其在干细胞维持及肿瘤发生中发挥重要作用。该家族中, ID1主要表达于胚胎干细胞及前体细胞, 其表达量随细胞分化程度增高而降低[15]。研究证实, ID1在乳腺癌、胆管癌、食管癌和胃癌等多种肿瘤细胞中存在异常高表达现象并通过调节细胞增殖、上皮间叶转化及耐药发挥促癌作用[16-21]。且已有研究发现, 结肠癌中ID1可通过维持结肠癌细胞干性特征促进结肠癌的发展进程[22, 23], 但相关分子生物学机制研究并不深入, 尚未发现有效靶点。

通过免疫印迹检测及GSEA (gene set enrichment analysis) 分析, 本研究发现ID1与维持肿瘤细胞干性的八聚体结合蛋白(octamer binding transcription factor, OCT4) 关键信号通路呈正相关关系, ID1直接上调OCT4的蛋白表达。基于此, 本研究猜想ID1通过上调OCT4信号通路维持结肠癌干细胞特性。本研究拟探求ID1对OCT4调控的分子生物学机制, 寻找靶向结肠癌肿瘤干细胞的新药物作用靶点。

材料与方法

试剂和抗体    胰酶、胎牛血清、DMDM、DMEM/F12培养基购于Gibco公司; 原代细胞培养基购自Cell Biologics生物技术有限公司; RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; RNA提取试剂盒购自北京奕杉生物技术有限公司; RNA逆转录试剂盒购自全式金生物技术有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega生物技术公司; 转染试剂VigoFect购于北京威格拉斯生物技术有限公司; Western blot超敏发光液购自Thermo Fisher有限公司; 放线菌酮(cycloheximide, CHX) 购于Sigma Aldrich公司; 干细胞成球半固体培养基CCM012购自R & D生物技术有限公司。OCT4、c-Myc (MYC proto-oncogene)、Nanog (Nanog homeobox)、SOX2 (SRY-box transcription factor 2) 及FOXD3购自Cell Signalling Technology生物技术有限公司; GAPDH购自北京中杉金桥生物技术有限公司; HA、DDK及GFP标签抗体购自北京博尔迈生物技术有限公司。

细胞及细胞培养   原代结肠癌细胞购自Cell Biologics生物技术有限公司; 结肠癌细胞系HCT-8、HT-29购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心; HEK 293T细胞由本实验室长期保存。HCT-8细胞培养于含10%胎牛血清(FBS) 的DMEM培养基中; HT-29细胞培养于含10% FBS的DMEM/F12培养基中; HEK293细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中。所有细胞置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培养, 根据细胞生长状态进行传代。

稳定转染细胞株的构建   为构建HCT-8或HT-29 ID1稳定敲低或过表达的细胞株, 用ID1 shRNA (序列: 5'-GAGGAATTACGTGCTCTGT-3') 的敲低慢病毒或ID1-3×Flag-GFP的过表达慢病毒[由汉恒生物(上海) 科技有限公司合成] 感染HCT-8或HT-29细胞, 48 h后加入40 mg·mL-1嘌呤霉素进行抗性筛选或利用GFP进行流式分选。培养7天后, 挑取单克隆细胞, 经过Western blot鉴定, 筛选获得ID1稳定敲低或高表达的细胞株。

质粒  ID1-HA、FOXD3-DDK及OCT4-DDK质粒均购自长沙优宝生物技术有限公司; PEGFP-C1-ID1重组质粒由本实验室构建。

质粒转染   为获得瞬时过表达FOXD3的HCT-8细胞, 使用转染试剂Lipofectamine®2000, 根据说明书的转染方法将FOXD3-DDK转入HCT-8细胞。

主要仪器   电泳仪(北京六一仪器厂)、qPCR仪(美国BIO-RAD公司)、ImageQuant LAS 4000mini成像系统(美国通用电气公司)、激光扫描共聚焦显微镜(日本奥林巴斯公司)。

实时荧光定量PCR (real-time PCR) 检测    细胞总RNA提取及RNA逆转录均按照试剂盒说明操作, qPCR引物由睿博兴科生物技术有限公司合成。OCT4: 上游5'-ATTCAGCCAAACGACCATCT-3', 下游5'-TCTCACTCGGTTCTCGATACTG-3'; GAPDH: 上游5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3', 下游5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。q-PCR反应体系(20 μL) 如下: SYBR PremixExTaqTM 10 μL, 去离子水6 μL, 上下游引物各1 μL, 模板cDNA 2 μL。两步法反应过程如下: 95 ℃预变性30 s, 进入循环, 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火和延伸30 s, 循环次数40次。以GAPDH作为内参, 将所得Ct值按2-ΔΔCt的方法进行处理。

RNAi实验  FOXD3 siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成, 将适量细胞接种于孔板中, 待其密度合适时, 将FOXD3 siRNA稀释于RPMI-1640中, 轻轻混匀; 另外, 将适量Lipofectamine RNAi MAX稀释于100 μL RPMI-1640中, 室温放置5 min后, 将含有Lipofectamine RNAi MAX的培养基滴加到含有siRNA的培养基中, 轻轻混匀, 室温孵育5 min后滴加到细胞中。

Western blot    收集细胞, 加入裂解液, 置于冰上裂解30 min, 4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min, 收集上清液, 测定其蛋白浓度并进行定量处理, 加入5×上样缓冲液, 98 ℃变性10 min。蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 湿法转膜, 5%脱脂牛奶室温封闭0.5 h, 4 ℃一抗孵育过夜, 次日用TBST洗膜液洗涤3次, 每次10 min, 加入相应二抗室温孵育2 h, 洗膜3次后加入ECL溶液进行显影。

GSEA分析   从GEO数据库下载结肠癌转录组测序数据(GSE41258, n = 390)。按照ID1表达高低进行排序, 前100和后100名患者分别被认为是ID1高表达组和ID1低表达组。从http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp网站下载OCT4、Nanog、c-Myc和SOX2基因集。运用GSEA软件分别对ID1高表达组和低表达组中OCT4、Nanog、c-Myc及SOX2信号集进行富集分析。其中, 伪发现率(false discovery rate, FDR) 值小于0.25被视为具有显著性差异。

免疫共沉淀实验 (co-immunoprecipitation, CO-IP)    待细胞生长到70%的密度时进行质粒转染, 质粒转染24~48 h后收集细胞, 加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂), 冰上裂解30 min, 4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min, 将上清转移至新的1.5 mL离心管中。吸取少量的裂解液用于Western blot分析, 剩余的裂解液加入5 mg的抗体和20 mL protein A琼脂糖珠, 4 ℃缓慢摇晃孵育过夜, 使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。次日, 用缓冲洗液清洗4次, 每次3 000 r·min-1离心5 min。加入2×上样缓冲液, 98 ℃变性10 min, 样品进行Western blot分析。

体外干细胞成球实验   将CCM012半固体培养基在37 ℃预热融化, 用胰酶消化不同组别细胞并计数, 将细胞和胶混合配成每毫升含5 000个细胞, 并接种于Corning-costar 96孔低吸附板, 每孔接种500个细胞。3~7天后观察、计数并拍照。

双荧光素酶报告基因实验   首先将转录因子OCT4或FOXD3的DNA结合元件构建在luciferase报告基因载体中(OCT4-luc、FOXD3-luc), 之后在HCT-8细胞中转染OCT4-luc或FOXD3-luc质粒, 并同时共转染海肾荧光素酶(pRL-TK) 报告基因作为内参。利用Promega双荧光素酶检测试剂盒及酶标仪测出荧光强度后进行计算。荧光强度=萤火虫荧光素酶对应荧光强度/内参荧光强度。

统计学分析    实验平均重复3次以上, 数据用mean ± SEM表示, 使用Graphpad Prism 8统计分析软件进行数据统计和计算, 用t检验各组间的差异, 显著性结果以P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001分别表示。

结果 1 结肠癌中ID1增强4个干性相关转录因子的表达

Nanog、c-Myc、SOX2及OCT4是4个维持肿瘤细胞干性的经典转录因子[24-27]。为探究ID1是否影响这4个转录因子的表达, 本研究首先构建了两个稳定敲低ID1 (ID1KD1和ID1KD2) 及一个稳定过表达ID1 (ID1OE) 的结肠癌HCT-8细胞株及对照细胞株。免疫印迹实验结果显示, 敲低ID1可显著降低Nanog、c-Myc、SOX2及OCT4这4个转录因子的蛋白表达(图 1AB); 而过表达ID1则可显著增加上述4种蛋白的表达(图 1CD); 且表达变化幅度以OCT4最为突出。以上结果提示, ID1可能通过上调Nanog、c-Myc、SOX2或OCT4信号通路发挥其维持结肠癌干性的促肿瘤作用。

Figure 1 Inhibitor of DNA binding 1 (ID1) upregulates the expression of four stemness sustaining transcriptional factors. A: Immunoblot analyses of Nanog homeobox (Nanog), MYC proto-oncogene (c-Myc), SRY-box transcription factor 2 (SOX2), octamer binding transcription factor (OCT4), and ID1 expression in HCT-8 cells stably expressing control (Ctrl) or two ID1-knockdown shRNAs; B: Statistical analyses of the protein levels detected in A; C: Immunoblot analyses of Nanog, c-Myc, SOX2, OCT4, and ID1 expression in Ctrl or ID1-overexpressed HCT-8 cells; D: Statistical analyses of the protein levels detected in C. n = 3, mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1
2 ID1通过上调OCT4信号通路维持结肠癌细胞干性

为进一步探究结肠癌患者肿瘤样本中ID1表达水平与Nanog、c-Myc、SOX2及OCT4信号通路的关系, 本研究对从GEO数据库中获得的结肠癌患者转录组测序数据集(GSE41258, n = 390) 进行分析。将所有患者的转录组测序数据按照ID1转录水平由高到低排序, 并利用GSEA分析比较了ID1表达前100个患者以及后100个患者这4个转录因子信号通路的富集情况(图 2A)。结果显示, ID1的转录水平仅与OCT4信号通路存在良好的正相关关系[normalized enrichment score (NES) = 1.305, FDR q-value = 0.092], 而与Nanog (NES = 0.864, FDR q-value = 0.731)、c-Myc (NES = 0.94, FDR q-value = 0.619)、SOX2 (NES = 1.105, FDR q-value = 0.86) 信号通路无明显相关性(图 2B~E)。这些数据说明, ID1主要调节了OCT4表达及下游信号通路, 进而评估了ID1对结肠癌干细胞特性的影响是否依赖于OCT4。本研究构建了ID1稳定敲低且OCT4稳定过表达的HCT-8细胞株(ID1KD/OCT4OE)。体外干细胞成球结果显示, 敲低ID1造成HCT-8细胞成球能力降低; 该现象可被过表达OCT4所反转(图 2F)。双荧光素酶报告基因实验显示, 过表达ID1可在HCT-8及HT-29细胞株中显著增加OCT4的转录激活活性; 而敲低ID1则降低OCT4的转录激活活性(图 2G~J)。以上结果表明, 结肠癌中ID1表达水平与OCT4信号通路呈正相关关系, ID1可通过增强OCT4的转录激活活性维持结肠癌细胞干性。

Figure 2 ID1 maintains colorectal tumor cells stemness traits through upregulating OCT4 signaling pathway. A: 390 human colorectal tumor tissue samples in the GSE41258 dataset were divided into 3 groups according to the mRNA level of ID1; B-E: Gene set enrichment analysis plot for the OCT4, c-Myc, Nanog, and SOX2 signaling gene modules in ID1-high and ID1-low groups identified in A; F: Phase contrast images and quantification of tumor spheres derived from HCT-8 cells with the indicated gene manipulation; G, H: Relative OCT-4-reporter luciferase activity in HCT-8 cells and HT-29 cells of Ctrl or ID1 overexpression groups; I, J: Relative OCT-4-reporter luciferase activity in HCT-8 cells and HT-29 cells of Ctrl or ID1 knockdown groups. n = 3, mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1
3 ID1通过增强OCT4的转录水平而上调其蛋白质表达

本研究进一步探索了ID1上调OCT4蛋白表达的分子生物学机制。GEPIA数据库[28]的mRNA相关性分析结果显示, 结肠癌患者组织中ID1与OCT4的mRNA呈正相关关系, 提示ID1可能上调OCT4的转录水平(图 3A)。荧光实时定量PCR的结果提示, 敲低ID1可显著降低HCT-8及HT-29细胞系中OCT4的转录水平; 而过表达ID1则可增强OCT4转录水平(图 3B~E)。鉴于某些蛋白会同时从转录和蛋白稳定性水平对其他蛋白进行调控, 本研究也分析了ID1对OCT4蛋白质稳定性的影响。在不同的时间点加入蛋白合成抑制剂CHX阻断OCT4从头合成途径, 进而观察其降解速度[29]。结果显示, 过表达ID1并不会延长OCT4的降解半衰期(图 3F)。这一结果提示, ID1并不影响OCT4的蛋白质稳定性。以上结果表明, 结肠癌中ID1可通过增强OCT4的转录水平而上调其蛋白质表达。

Figure 3 ID1 increases OCT4 expression via upregulating its transcriptional level. A: mRNA correlation of OCT4 and ID1 in colorectal cancer analyzed by the web of GEPIA; B, C: Effects of ID1 knockdown on mRNA level of OCT4 in HCT-8 (B) or HT-29 (C) cells; D, E: Effects of ID1 overexpression on mRNA level of OCT4 in HCT-8 (D) or HT-29 (E) cells; F: Effects of ID1 overexpression on OCT4 protein stability in HEK 293 cells. n = 3, mean ± SEM. **P < 0.01, ***P < 0.001
4 转录因子FOXD3抑制OCT4转录

由于ID1自身并无DNA结合能力, 其主要通过与具有bHLH结构的转录因子形成异源二聚体, 进而抑制其DNA结合和转录活性发挥。基于前面的研究结果推测, ID1可能对某个OCT4的转录抑制因子具有负调节作用, 进而间接促进OCT4转录。本研究利用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/) 分析了与OCT4的启动子序列结合的转录调节蛋白, 共预测到37个潜在结合OCT4启动子区域的转录调节蛋白。结合GEPIA数据库分析发现, 在结肠癌患者中只有FOXD3与OCT4的转录呈负相关关系(R =-0.22, P = 0.000 61) (表 1图 4A)。为确认FOXD3是否的确抑制OCT4转录, 分别在敲低和过表达FOXD3的条件下检测了OCT4的转录和蛋白表达。实时定量RT-PCR及免疫印迹结果证明, 敲低FOXD3增强OCT4的mRNA及蛋白表达水平, 过表达FOXD3则相反(图 4B~E)。进一步用OCT4-luc报告基因系统检测了FOXD3对OCT4转录激活活性的影响。在HCT-8细胞中敲低FOXD3可增强OCT4的转录激活活性; 而过表达FOXD3则降低OCT4转录激活活性(图 4FG)。上述结果表明, FOXD3通过抑制OCT4转录, 降低OCT4作为转录因子的转录激活活性。

Table 1 Correlation analysis of OCT4 mRNA level and predictive OCT4 transcription factors in colon cancer

Figure 4 FOXD3 inhibits OCT4 signaling via inhibiting its transcription. A: mRNA correlation of FOXD3 and OCT4 in colorectal cancer analyzed by the web of GEPIA; B, C: Effects of FOXD3 knockdown (B) or overexpression (C) on OCT4 mRNA level in HCT-8 cells; D, E: Effects of FOXD3 knockdown (D) or overexpression (E) on protein level of OCT4 in HCT-8 cells; F, G: Effects of FOXD3 knockdown (F) or overexpression (G) on OCT4-reporter luciferase activity in HCT-8 cells. n = 3, mean ± SEM. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1
5 ID1通过与FOXD3相互作用抑制其转录调节功能促进OCT4表达

为明确FOXD3是否是介导ID1对OCT4转录调控的关键中间环节, 本研究检测了ID1对FOXD3表达的影响, 结果表明敲低或过表达ID1并不影响FOXD3的蛋白表达(图 5A)。因此, 推测ID1可能通过与FOXD3形成相互作用复合物发挥调节功能。免疫共沉淀实验结果证实, FOXD3与ID1在HEK293中存在相互作用(图 5B), 免疫荧光共定位实验表明二者在结肠癌原代细胞中存在共定位(图 5C)。进一步探索ID1是否调节FOXD3的转录抑制活性, 将FOXD3所识别的特定DNA序列“AATGTTTGTTT”构建到荧光素酶报告基因载体中[30], 建立了FOXD3双荧光素酶报告基因体系。在HCT-8细胞中敲低ID1降低FOXD3-luc荧光素酶报告基因活性, 提示FOXD3的转录抑制活性增强(图 5D); 过表达ID1增强FOXD3-luc荧光素酶报告基因活性, 提示FOXD3的转录抑制活性受到抑制(图 5E)。在HCT-8细胞中利用FOXD3的小干扰RNA敲低FOXD3则可逆转ID1敲低对OCT4的mRNA表达及OCT4转录激活活性的抑制作用(图 5FG)。此外, 在HCT-8细胞中过表达FOXD3质粒可逆转ID1过表达对OCT4的mRNA表达及转录激活活性的增强作用(图 5HI)。以上实验表明, FOXD3是介导ID1增强OCT4转录及信号通路活性的中间转录抑制因子。

Figure 5 ID1 interacts with FOXD3 to promote OCT4 transcriptional level. A: Effects of ID1 knockdown or overexpression on protein level of FOXD3 in HCT-8 cells; B: 293 cells were transfected with plasmids of FOXD3-DDK and ID1-GFP. Cell extracts were immuno-precipitated with anti-DDK antibody or normal mouse IgG and blotted with anti GFP antibody; C: Immunofluorescence staining of ID1 and FOXD3 in primary colorectal cancer cells. Scale bar = 15 μm; D, E: Effects of ID1 overexpression (D) or knockdown (E) on FOXD3-reporter luciferase activity in HCT-8 cells; F, G: Relative mRNA level of OCT4 in HCT-8 cells of indicated groups; H, I: Relative OCT4-reporter luciferase activity in HCT-8 cells of indicated groups. n = 3, mean ± SEM. ***P < 0.001, ****P < 0.000 1
讨论

伴随人们生活质量提高, 高脂、高蛋白等不良饮食习惯的增多, 结肠癌成为威胁我国人民身体健康的主要癌种之一[31]。结肠癌治疗中存在的复发、转移及耐药等问题是威胁结肠癌患者生命的重大医学难题, 而结肠癌干细胞的存在是导致以上3个问题的重要原因。已有报道发现, ID1在胃癌及结肠癌中维持肿瘤干细胞特性, 但具体的生物学机制并不明确, 尚未发现可用的药物靶点。本研究在结肠癌中发现ID1-FOXD3-OCT4调控轴, 即ID1通过与FOXD3相互作用抑制其作为转录抑制因子的活性, 最终上调OCT4转录并激活OCT4信号通路, 增强结肠癌肿瘤细胞干性。因此, 靶向干扰ID1-FOXD3的相互作用, 解除ID1对FOXD3转录抑制活性的负调节作用可能是改善结肠癌复发、耐药及转移的新策略。

具有HLH结构域的ID家族主要通过与完整的bHLH转录因子形成非活性的异二聚体而成为bHLH蛋白的负性调节因子。本研究中发现的介导ID1-OCT4的中间桥梁蛋白是具有叉头样结构的FOXD3而非具有bHLH样结构的转录因子, 这与传统发现的ID家族发挥作用的模式不同。本发现为ID1蛋白作用方式的多样性提供了新的证据。FOXD3在肺癌、神经胶质瘤及结肠癌中的抑肿瘤作用已被广泛报道[32-35]。已有研究认为, 在结肠癌中FOXD3主要通过抑制EGFR-Ras-Raf-Mek-ERK信号通路抑制肿瘤的发展进程[36]。本研究在结肠癌中发现FOXD3对OCT4转录抑制作用, 这为OCT4的调节机制增添了新的理论基础。在今后的研究当中, 本课题组将进一步在体内验证ID1-FOXD3-OCT4的调控关系对结肠癌干细胞的作用; 并深入研究ID1与FOXD3的相互作用结构域, 开发筛选干扰二者相互作用的化学小分子或α螺旋肽。

综上所述, 本研究结果表明, ID1通过与叉头蛋白样转录抑制因子FOXD3相互作用, 抑制其活性而增强OCT4的转录, 最终上调OCT4信号通路活性, 维持结肠癌干细胞的干性特征。本研究结果有利于深入了解ID1促肿瘤功能的机制, 为今后相关靶向药物的开发提供重要的理论基础。

作者贡献:  尚爽负责细胞、动物实验和实验设计及论文的撰写; 宋佳伟负责分子克隆实验; 花芳负责论文的指导及审阅。

利益冲突:  本文的研究内容无任何利益冲突。

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