2. 雷允上药业集团有限公司, 江苏 苏州 215003
2. Leiyunshang Pharmaceutical Co. Limited, Suzhou 215003, China
补骨脂为豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia L.) 的干燥成熟果实, 其味辛、苦, 性温, 归肾、脾经, 具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻, 外用消风祛斑的功效。现代研究表明, 补骨脂具有抗肿瘤[1]、抗骨质疏松[2]、抗抑郁[3]以及类雌激素[4]等广泛药理活性。近年来, 多项研究显示补骨脂大剂量、长期应用可引起多种不良反应, 如肝毒性、光毒性、过敏反应、肾毒性和生殖毒性等[5]。其中, 肝毒性为补骨脂引发的主要毒性反应, 国家药监局已通报多例含补骨脂复方制剂出现肝损害的案例[6]。
中药配伍减毒是中医方剂理论的重要组成部分之一, 是基于《神农本草经》所创立的“七情合和”理论中的“有毒宜制, 可用相畏相杀者”的论述逐渐形成的一种临床用药思想, 也是有毒中药用于临床的常见减毒方法[7]。赤芍性微寒, 味苦, 研究表明赤芍对急性肝损伤[8]、胆汁淤积性肝炎[9]、肝纤维化[10]等肝疾病均有一定的防治作用, 且已有报道其在配伍运用时可降低乌头类等药物的肝毒性[11], 据此推测赤芍与补骨脂配伍可在一定程度上降低补骨脂的肝脏毒性。
特异质肝毒性是一种在临床剂量范围内, 仅发生于少数病人、与药物的药理效应无关、无明显临床剂量-效应关系的药物不良反应[12, 13]。其发生机制主要分为代谢特异质和炎症特异质, 其中炎症特异质主要与人的免疫应激状态相关。Roth等[14]最早提出“免疫应激状态下更容易出现药源性特异质肝损伤”, 即脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 特异质模型。目前已有研究表明, 补骨脂引发的肝损伤与机体的免疫应激状态相关[15]。因此, 本研究通过腹腔注射LPS复制免疫应激动物模型, 研究补骨脂与赤芍配伍对其肝脏毒性的影响, 并采用代谢组学研究方法分析其调控代谢网络机制, 以期为补骨脂临床安全用药提供借鉴和参考。
材料与方法仪器 Waters ACQUITY UHPLC系统(包括四元泵溶剂系统, 在线脱气机和自动进样器; 英国Waters公司)、Waters SYNAPT G2-Si质谱仪(英国Waters公司)、MassLynxTM质谱工作站(英国Waters公司)、Millipore Direct-Q3 Advantage超纯水系统(美国Millipore公司)、BX43生物倒置显微镜(日本Olympus公司)。
药材与试剂 LPS (批号: 20001)、赤芍(批号: 20001) 均购于亳州紫锐药业有限公司; 脂多糖(批号: 12190801) 购自Sigma公司; 乙腈、甲酸均为色谱纯(德国Merck公司); 超纯水由Milli-Q系统产生(美国Millipore公司); 谷丙转氨酶测试盒(alanine aminotransferase, ALT; 批号: 20200721)、谷草转氨酶测试盒(aspartate aminotransferase, AST; 批号: 20200730)、肿瘤坏死因子-α测试盒(tumor necrosis factor-α, TNF-α; 批号: 20200803)、白介素-1β测试盒(interleukin-1β, IL-1β; 批号: 20200803)、白介素-6测试盒(interleukin-6, IL-6; 批号: 20200817)、干扰素-γ测试盒(interferon-γ, IFN-γ; 批号: 20200817) 均购自南京建成生物有限公司。
实验样品制备 取补骨脂药材粗粉1 kg, 经8倍量、6倍量纯水回流提取各1次, 每次1 h, 合并煎液, 滤过, 滤液浓缩至1 L, 放至室温, 加乙醇至含醇量达60%, 充分搅拌, 静置24 h, 滤取上清液, 回收乙醇至无醇味, 继续浓缩至1 g·mL-1 (以补骨脂生药浓度计算), 备用。另取补骨脂、赤芍药材, 按1∶2配比同法制备。临用时用生理盐水配制成250 mg·mL-1的溶液, 给药剂量(以补骨脂生药量计) 为3.75 g·kg-1。
动物实验与样本采集 所有实验方案均经南京中医药大学动物实验伦理委员会审查批准(许可号: 202006A020)。雄性SPF级SD大鼠(体重200 ± 20 g) 购自上海市杰思捷实验动物有限公司(许可证号: SCXK沪2018-0004)。常规饲养于南京中医药大学实验动物中心, 温度保持在(22 ± 2) ℃, 相对湿度为(60 ± 2) %, 光照周期为12 h。适应性饲养3天后, 根据体重将36只大鼠随机分为6组, 每组6只, 包括空白组(C)、LPS组(L)、补骨脂组(P, 剂量为3.75 g·kg-1)、补骨脂与LPS联用组(PL, 剂量为3.75 g·kg-1)、补骨脂配伍赤芍组(PP, 剂量为3.75 g·kg-1)、补骨脂配伍赤芍与LPS联用组(PPL, 剂量为3.75 g·kg-1), 实验前禁食不禁水12 h, 称重并计算给药剂量, 实验当天各组分别灌胃给予对应药物, 其中C组和L组给予同等体积的生理盐水; 2 h后参考文献[16]方法对各组进行尾静脉注射, L、PL、PPL组分别给予剂量为2.8 mg·kg-1的LPS, C、P、PP组给予同等体积的生理盐水; 9 h后使用1%戊巴比妥钠(剂量为50 mg·kg-1) 将所有大鼠麻醉, 腹主动脉取血, 离心, 并采集血浆样本和肝组织样本。
肝功能指标、炎症因子测定及肝组织病理学检查 采集大鼠血浆, 采用血生化试剂盒按照其说明书要求测定AST、ALT活力, 采用ELISA试剂盒按照说明书要求测定血浆中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平。采集大鼠肝脏组织并固定在4%多聚甲醛组织固定液中, 将固定好的肝脏组织常规石蜡包埋, 用常规方法进行脱蜡和水合后, 按照HE染色试剂盒的说明进行HE染色, 并对肝脏组织的形态进行病理分级和评分, 共分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4级, 评分标准[17]如下: Ⅰ级: 肝小叶结构正常, 肝索排列整齐, 无明显变性、坏死及炎症细胞浸润, 记1分; Ⅱ级: 肝小叶结构尚正常, 肝索排列整齐, 肝细胞偶见肿胀、气球样变或脂肪变性, 并伴有轻度炎症细胞浸润, 记2分; Ⅲ级: 肝索排列出现紊乱, 肝细胞部分肿胀、气球样变或脂肪变性, 并伴有炎症细胞浸润, 记3分; Ⅳ级: 肝索排列紊乱, 肝细胞肿胀、气球样变或脂肪变性, 并伴有大量炎症细胞浸润, 记4分。
数据处理 采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析, 各项指标结果以均数±标准差(x± s) 表示, 组间比较采用方差分析, 以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
代谢组学血清样品制备 将冻存的血清样本置冰上解冻, 各组分别取100 μL用于分析, 每份血清样本加入冷乙腈300 μL沉淀蛋白, 涡旋混匀1 min, 4 ℃静置30 min后4 ℃、13 000 r·min-1离心15 min, 取上清液注入UHPLC-QTOF MS分析。所有样品在代谢组学分析期间均在4 ℃条件下保存。
代谢组学色谱条件 ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm), 流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B), 梯度洗脱条件: 0~6 min, 95%~55% A; 6~13 min, 55%~5% A; 13~14 min, 5% A。采用ESI离子源正、负离子模式(ESI+/ESI-), 质量扫描范围m/z 100~1 000; 毛细管电压、锥孔电压分别为3.0 kV和30 V; 萃取电压: 2.0 V; 离子源温度120 ℃, 脱溶剂气温度为350 ℃; 锥孔气流量: 50 L·h-1; 碰撞能量: 20~50 eV; 准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(ESI+: 556.277 1 m/z, ESI-: 554.261 5 m/z) 溶液为锁定质量溶液。
代谢组学数据分析 参考文献方法[18], 采用MasslynxTM v4.2工作站对色谱峰数据进行噪声去除、重叠峰解析、峰对齐、峰匹配、标准化、归一化等处理, 分别输出正、负离子模式下由保留时间、质荷比值和每个峰值区域的归一化峰面积的数据列表, 导入SIMCA P 14.1进行主成分分析(principal component analysis, PCA) 和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA), 选取VIP > 1和|P| ≥ 0.05的变量作为潜在生物标志物[19], 采用SPSS 22.0软件利用t检验分析方法检验生物标志物的相对峰面积在两组间是否具有显著性差异, 数据采用x± s表示, 以P < 0.05具有统计学意义筛选得到差异代谢物。使用HMDB (http://www.hmdb.ca/) 数据库及Metabo Analyst (http://www.metaboanalyst.ca/) 进行生物标志物的鉴定和代谢通路分析。
结果 1 肝功能指标各实验组大鼠肝功能指标分析结果(图 1A) 显示, 与C组相比, L组与P组血浆AST和ALT活力显著升高(P < 0.05), 提示补骨脂对正常大鼠已表现出一定的肝毒性, 而PP组血浆AST和ALT活力未见显著升高(P > 0.05), 提示赤芍具有一定的缓减补骨脂肝脏毒性的作用; 与L组比较, PL组血浆AST、ALT活力均显著升高(P < 0.01), 表明补骨脂具有引起LPS致免疫应激模型大鼠肝脏损伤的趋势。PPL组仅AST活力显著升高(P < 0.05), 但其升高程度显著低于PL组(P < 0.05), 提示补骨脂与赤芍配伍后对大鼠的肝毒性具有降低趋势。
血浆炎症因子水平分析结果显示(图 1B), 与C组比较, P组、PP组血浆炎症因子水平均未见显著变化, PL组的TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平较C组和L组显著升高(P < 0.05); PPL组与PL组相比各炎症因子水平均显著下调(P < 0.05), 提示补骨脂与赤芍配伍可减轻体内的炎症反应。
3 大鼠肝脏组织病理学观察肝脏组织病理切片结果以及肝组织病变评分结果(图 2) 显示, C组肝小叶边界清楚, 肝索清晰可见, 肝细胞无肿胀、无泡沫状变性, 无坏死, 肝实质内偶见炎细胞浸润; 与C组相比, L组肝窦有淤血, 肝实质内有轻度炎细胞浸润, 各给药组同样出现轻微的病理损伤, 但除P组外与C组均无显著性差异。此外, LPS造模后的各给药组病理损伤程度均显著加重, 其中PL组最为严重, 肝索排列紊乱, 肝细胞肿胀并且伴有泡沫状变性, 肝实质内出现大量炎细胞浸润, 而PPL组肝损伤程度显著减轻。
将数据导入SIMCA P 14.1软件进行PCA分析, 并绘制样品得分散点图。如图 3A1、B1所示, 在正离子和负离子模式下, QC组样品均紧密聚集, 表明UHPLC-MS系统在整个分析过程中稳定性较好。C组、L组、PL组、PPL组可观察到明显的分离趋势, 表明4个组之间存在明显的代谢差异。其中, PL组表现出明显偏离C组和L组的趋势, 而与赤芍配伍后的PPL组呈现出向C组回调趋势。该研究结果与肝功能指标分析结果呈现相似的趋势, 提示低剂量LPS已导致大鼠体内代谢发生紊乱, 并在受到补骨脂毒性影响后, 大鼠体内的小分子代谢物水平进一步发生显著变化, 从而在PCA图中表现出明显偏离C组的趋势, 而与赤芍配伍后的PPL组对大鼠的肝损伤程度减小而呈现出回调趋势。
OPLS-DA分析方法作为一种有监督的模式识别方法可显著提高分类判别能力, 且可减小干扰因素对相似性聚类分析的影响[20]。因此, 为了进一步突出组间差异, 挖掘补骨脂致免疫应激动物模型肝损伤潜在生物标志物, 首先采用OPLS-DA对L组和PL组进行分析, 并通过S-plot分析指标筛选两组之间的差异性变量, 作为潜在的生物标志物。如图 3A2、B2显示, 在正、负离子模式下, L组和PL组均可明显区分, 分别位于纵坐标两侧, 说明在LPS致免疫应激动物模型上, 补骨脂引起了大鼠体内代谢水平显著变化。在S-Plot图中, 代谢物的点与主要离子簇距离越远表明对样品类别的区分贡献越大。提取VIP > 1和|P| ≥ 0.05变异变量作为潜在候选标志物, 进一步采用t检验选出具有显著性差异(P < 0.05) 的化合物导入HMDB数据库进行检索, 最终筛选出L组和PL组的差异代谢物共22个, 如图 3A3、B3所示(其中红色标记为已鉴定得到的22个差异代谢物, 黄色标记为符合筛选要求但未鉴定出的生物标志物, 蓝色标记为满足VIP和|P|值要求但经t检验未见显著性差异的化合物), 详细信息如表 1所示。进一步将潜在差异代谢产物在各组的相对含量进行统计学分析, 结果发现PL组与C组、L组相比均引起代谢产物相对含量的显著升高, 而赤芍与补骨脂配伍后可显著回调其中的9个代谢物趋于C组(图 4), 包括花生四烯酸、二氢鞘氨醇、甘胆酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二十碳三烯酸。
将上述差异代谢物分别输入MetaboAnalyst 4.0在线分析数据库进行通路富集分析, 分别得到补骨脂引起特异性肝毒性的代谢通路共9条以及补骨脂-赤芍配伍减毒的代谢通路共6条, 结果如图 5所示。以pathway impact > 0.1为标准筛选出关键代谢通路[21], 即潜在的靶标代谢路径, 主要涉及花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢信号通路。
药物特异质肝损伤是近年来国内外毒理学研究的热点和难点, 目前关于特异质肝损伤发生机制的研究主要集中在药物代谢酶基因多态性造成相关代谢酶缺失或活力低下、个体免疫应答异常、与免疫应激反应相关等方面。其中免疫应激是特异质肝损伤的重要诱因, 免疫应激状态下的个体更容易出现特异质肝损伤, 轻度的炎症刺激可以增加机体组织对毒性化合物的敏感性, 降低机体对药物产生肝毒性的应答阈值, 即药物在一个较低的剂量范围内便可以产生毒性[14]。目前, 免疫应激相关的特异质肝损伤评价模型主要通过LPS诱导刺激来建立[22, 23], 本研究通过大鼠尾静脉注射LPS使其处于轻度免疫应激状态, 然后给予受试药物, 进一步探究赤芍缓解补骨脂特异质肝损伤的作用机制。
在免疫应激模型的基础上, 本研究采用代谢组学的方法探究补骨脂与赤芍配伍对其特异质肝毒性的影响及其作用机制, 从生化指标和肝脏病理切片结果上看, 补骨脂在免疫应激状态下表现出明显的肝毒性, 与赤芍配伍后, 肝毒性显著降低, 进一步通过代谢组学的方法筛选出了补骨脂-赤芍配伍降低肝损伤的相关的差异代谢标志物和代谢通路。通过多元统计分析, 共筛选并鉴定了与补骨脂致特异质肝毒性相关的差异代谢物22个, 补骨脂与赤芍配伍后可显著回调其中9个代谢物。
花生四烯酸作为一类重要的调控炎症介质, 可经多条途径加重机体氧化应激和炎症反应[24]。溶血磷脂酰胆碱等甘油磷脂类代谢产物, 是机体细胞和组织代谢方面关键信号分子, 主要参与质膜形成[25]、细胞生长及死亡[26]和炎症反应[27], 此类化合物具有较强的生物学效应, 能促使红细胞质壁分离, 并破坏细胞膜和线粒体, 且具有直接激活T细胞、B细胞和巨噬细胞并影响其与其他类型细胞的相互作用而引起炎症反应的能力。给予补骨脂后的免疫应激大鼠血清中花生四烯酸的水平显著增加, 反映了体内炎症反应的激发; 而溶血磷脂类代谢物的蓄积, 则提示补骨脂可能破坏细胞生物膜[28], 并进一步加重炎症反应[29]。给予补骨脂-赤芍配伍提取物后, 大鼠血清中花生四烯酸、磷脂类代谢物水平显著降低, 表明赤芍与补骨脂配伍可以抑制炎症反应, 改善大鼠体内脂质代谢紊乱。二氢鞘氨醇属于磷酸鞘脂化合物, 在鞘脂代谢、钙信号通路和神经活性配体-受体相互作用等通路中均表现出强大的生物活性, 主要参与鞘脂代谢通路, 通常由鞘氨醇激酶和神经酰胺激酶生成, 参与调控细胞生理、细胞生存、炎症反应等多个方面[30], 还参与体内COX-2的诱导以及花生四烯酸的生成[31]。甘胆酸是由胆酸和甘氨酸结合而成的结合型胆酸, 是胆汁酸的主要成分之一, 主要参与初级胆汁酸生物合成, 可促进脂肪和胆固醇在肝和肠中的排泄、吸收和转运[32, 33], 当人体肝细胞受损或胆汁淤滞时, 就会引起胆汁酸代谢和循环紊乱, 使肝细胞摄取胆汁酸的能力下降, 导致血液中胆汁酸含量升高, 且胆汁酸值高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关[34]。补骨脂给药后可引起大鼠体内甘胆酸含量的显著增加, 而与赤芍配伍给药后, 其含量显著回调, 提示赤芍可以改善补骨脂造成的胆汁酸代谢紊乱, 以此降低补骨脂引起的肝毒性。
赤芍药用最早记录于《神农本草经》, 有清热凉血、活血祛瘀的功效, 常用于治疗多种肝脏相关疾病, 其对胆汁淤积性肝炎有较好的治疗作用, Meta分析发现在中药复方配伍中使用大剂量的赤芍可以增强该复方对胆汁淤积性肝炎的疗效[35], 并经实验研究发现其作用机制可能与调节胆汁酸分泌相关[36]。其主要活性成分芍药苷能够降低肝组织MDA、ROS、NO、NOX4等氧化应激相关物质的含量, 并增加机体的抗氧化体系如GSH活性, 进而避免肝脏受到氧化损伤[37]。Chen等[38]进一步研究发现芍药苷干预α-萘异硫氰酸酯诱导的肝损伤的机制可能与调节甘油磷脂代谢、初级胆汁酸生物合成、花生四烯酸代谢的功能障碍有关。由此得知赤芍具有良好的抗炎和调节胆汁酸分泌等活性, 这也进一步为本文的研究结果提供了参考依据。
综上, 本研究通过LPS致免疫应激大鼠模型证实补骨脂可导致特异质肝毒性, 其于赤芍配伍后肝毒性显著降低, 其中花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢通路可能是赤芍缓解补骨脂特异质肝毒性的重要通路, 为后续深入探讨其作用机制提供了研究基础。
作者贡献: 武文星负责实验操作和论文撰写; 郭盛负责研究课题总体设计、实验指导、论文修改; 吴励萍、夏玲参与动物实验工作; 赵明参与数据分析; 李全负责药材提供及样品制备; 王恒斌参与研究课题总体设计; 段金廒负责论文选题及论文终稿审查。
利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。
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