2. 中国食品药品检定研究院, 北京 102629
2. National Institute for Food and Drug Control, Beijing 102629, China
严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 具有高传染性和高隐蔽性传播特征, 其引发的疾病(COVID-19) 在2019年底爆发, 随即以惊人的速度席卷到全球180多个国家/地区, 导致全球性大流行[1, 2]。近期出现的COVID-19病毒新变种传染性更强, 使疫情防控更加复杂化和具有挑战性[3]。虽然RNA聚合酶抑制剂瑞德西韦(remdesivir) 批准上市用于重症患者的治疗, 但其治疗COVID-19的安全性和有效性尚待进一步验证[4-6]。因此, 寻找抗SARS-CoV-2候选物是全球性公益需求, 更是为应对我国突发性传染性疾病的防控提供充足的战略物资储备, 意义重大。
天然产物历来是抗病毒药物发现的重要源泉, 对具有广谱抗病毒活性的天然产物进行抗SARS-CoV-2活性筛选, 是发现全新抗SARS-CoV-2候选物的重要策略[7, 8]。小檗碱(berberine, BBR) 是中药黄连的有效成分, 具有多种抗病毒活性, 如抗柯萨奇病毒、抗丙肝病毒、抗人巨细胞病毒、抗甲病毒及抗甲型流感病毒等[9-16]。基于此, 利用已构建的SARS-CoV-2假病毒模型对我国传统天然药物小檗碱(BBR) 及其4个主要代谢产物(图 1), 包括9-羟基小檗碱(M1)、10-羟基小檗碱(M2)、2, 3-二羟基小檗碱(M3) 和3-羟基小檗碱(M4) 进行了活性筛选[17]。研究发现仅BBR显示中度抗SARS-CoV-2假病毒活性, 其EC50值为27.0 μmol·L-1, 选择性指数(SI) 大于9.9, 但4个代谢产物均没有活性, 该结果提示, 对BBR的A环和D环的传统结构修饰可能不利于活性的提高。为此, 本论文针对BBR及其类似物巴马汀(palmatine, PMT) 的8, 9-位进行环合, 由此构建了一类全新骨架的N-环化小檗碱衍生物(图 1)。随后评价了它们抗SARS-CoV-2假病毒活性, 发现BBR 8, 9-位环合, 同时亚甲二氧环打开(即PMT的8, 9-位环合) 的衍生物具有一定的抗SARS-CoV-2假病毒活性。在此总结了PMT的8, 9-位环合衍生物的构效关系(structure-activity relationship, SAR), 对代表性化合物开展了初步安全性与抗SARS-CoV-2假病毒作用机制研究。
目标化合物3a~3r均以市售PMT为起始原料, 经胺化保护、脱保护以及环合反应合成得到(合成路线1)。首先, 100 ℃条件下, PMT与2, 4-二甲氧基苄胺经胺化反应, 得到关键中间体1, 收率为49%。然后将1置于盐酸甲醇溶液中, 脱去2, 4-二甲氧基苄基保护基, 以83%收率得到9-氨基巴马汀2[18-20]。最后以不同于文献报道的全新合成方法, 将2与相应的α-甲基酮在碱性条件下, 经曼尼希反应和分子内加成环合得到新型的N-环化小檗碱衍生物3a~3r[21], 收率31%~53%。所有目标化合物结构经1H NMR、13C NMR以及HR-MS分析确证。目标化合物的收率、理化参数和波谱数据见表 1。
采用已构建的含荧光素酶报告系统的SARS-CoV-2假病毒模型评价目标物活性[17]。该模型首先在293T细胞中转染质粒pcDNA3.1.S2, 24 h后感染含荧光素酶报告系统的G*ΔG-VSV假病毒; 病毒感染24 h后通过检测荧光素酶信号值即可定量分析SARS-CoV-2假病毒的复制能力。同时评价了目标物对G*ΔG-VSV假病毒的抑制活性, 用以排除化合物是通过抑制G*ΔG-VSV假病毒的活性而导致的假阳性结果。所有目标物的结构、细胞毒、抗SARS-CoV-2假病毒(EC50-SARS-CoV-2) 和抗G*ΔG-VSV假病毒(EC50-G*ΔG-VSV) 的活性见表 2。
SAR主要考察衍生物9-位不同取代基对抗SARS-CoV-2假病毒活性的影响。首先, 对9-位引入苯基, 所得化合物3a对SARS-CoV-2假病毒的EC50为4.06 μmol·L-1, 活性优于BBR, SI值与BBR相当。随后, 在9-位苯基上分别引入供电子甲基(3b~3d)、甲氧基(3e)、氯(3f) 和溴(3g) 和吸电子基氰基(3h~3i), 结果显示, 除化合物3i的活性弱于先导物外, 其他目标物的活性均强于BBR, 但其SI值均小于先导物。以上结果提示: 在9-位引入含不同取代的苯基不利于衍生物SI值提高。
接下来在9-位引入不同杂环取代基(3j~3r), 结果显示, 当9-位取代基为吡咯基、噻唑基和嘧啶基时, 衍生物3k、3l和3q的EC50均大于13.0 μmol·L-1; 当9-位取代基为呋喃基、取代的吡啶基、吡嗪基和吲哚基时, 虽然化合物3j、3o、3p和3r的抗SARS-CoV-2假病毒活性明显强于BBR, EC50介于4.63和6.97 μmol·L-1之间, 但是细胞毒性明显增大, SI低于先导物; 当9-位取代基为含不同取代的吡唑基时, 化合物3n活性强于BBR, EC50为10.2 μmol·L-1, SI值和BBR相当, 特别是化合物3m, 其EC50仅为1.61 μmol·L-1, SI为22.2, 抗病毒活性和SI均明显优于BBR, 并且3m对G*ΔG-VSV假病毒的EC50为31.7 μmol·L-1, 低于BBR的EC50 17.5 μmol·L-1。因此, 选择3m为代表性化合物进行下一步研究。
3 时间添加实验为初步探讨BBR与3m抗病毒机制, 设计了在不同的温度条件和时间点将3m或者BBR和病毒单独或同时加入宿主细胞的药物-病毒-宿主相互作用的时间添加实验[17, 22]。如图 2A所示: 若病毒荧光降低, 提示a: 抑制病毒的入侵; b: 阻碍病毒对细胞膜表面的吸附; c: 阻断病毒与细胞膜表面受体结合; d: 抑制膜融合过程。结果如图 2B和2C所示: BBR对a、b和c过程的抑制率分别为60%、57%、69%, 提示BBR通过抑制病毒对宿主细胞的进入、吸附以及阻断病毒与受体的结合多个过程; 3m对a、b和d过程的抑制率分别为62%、76%、73%, 提示3m对病毒对宿主细胞的进入、吸附和膜融合阶段均有较好的抑制作用。上述结果提示, 3m和BBR均可能通过多靶点的协同作用机制产生抗病毒作用, 而母核骨架结构改变使两者作用机制不完全相同, 值得进一步深入研究。
鉴于目标化合物具有新结构骨架, 使用ADMET Predictor 9.5软件对代表性化合物3m进行初步的成药性预测, 包括吸收、代谢和毒理性质进行打分, 了解其部分成药性质[23] (表 3)。结果显示, 3m的预测分值均在软件设定的合理范围内, 提示化合物3m成药性良好。
选用昆明小鼠, 以灌胃给药方式, 按照0、250、500和1 000 mg·kg-1剂量, 将化合物3m一次性给药, 密切观察7天。结果显示, 不同剂量组小鼠生存状态均良好, 说明3m半数致死量(LD50)大于1 000 mg·kg-1。
小结本研究以BBR为先导物, 以抗SARS-CoV-2假病毒活性为导向, 共设计合成了18个全新结构骨架的N-环化BBR衍生物, 构效关系表明在9-位引入适当的杂环基团可以提高抗病毒活性。其中, 化合物3m显示出最优的抗病毒活性, 其EC50仅为1.61 μmol·L-1, SI为22.2, 明显优于BBR。时间添加实验提示BBR与3m均通过多靶点协同作用机制发挥抗病毒作用, 但因母核骨架结构改变使其作用机制发生变化。本研究结果为N-环化BBR衍生物发展成一类新颖的抗SARS-Co-2候选物提供了重要科学数据。
实验部分CXM-300型精密熔点仪测定目标物熔点, 温度未校正; 所有目标物的1H NMR和13C NMR用Bruker Avance Ⅲ 600MHz核磁共振仪测定, 溶剂为DMSO-d6、CD3OD或者CD3OD和CDCl3混合溶剂; HR-ESI-MS用Autospec Ultima-TOF质谱测定仪测定; Flash柱分离纯化用Combiflash Rf 200快速制备液相, 试剂均为分析纯。
1 化合物合成将PMT (5 g, 12.9 mmol) 加入到2, 4-二甲氧基苄胺25 mL中, 100 ℃条件下反应7 h。体系冷却至室温, 随后加入丙酮100 mL, 搅拌, 抽滤, 丙酮2×100 mL洗涤。滤渣经硅胶柱, 以二氯甲烷/甲醇为流动相分离纯化得红色化合物1。化合物1 (3 g, 5.74 mmol) 溶于10 mL甲醇中, 加入浓盐酸3 mL, 室温搅拌8 h, 抽滤, 沉淀以80%乙醇洗涤, 得红色化合物2。将化合物2 (300 mg, 0.81 mmol) 和相应的α-甲基酮(1.47 mmol) 置于无水甲醇(10 mL) 中, 加入甲醇钠调节反应体系始终为碱性, 60 ℃反应2~8 h, 将反应体系充分冷却, 用盐酸酸化, 减压旋干反应体系, 固体经硅胶柱以二氯甲烷/甲醇为流动相分离纯化得目标物3a~3r。
2 生物实验 2.1 体外细胞水平抗SARS-CoV-2假病毒活性评价将每种化合物(终浓度200 μmol·L-1) 的系列稀释液与1.3×104 TCID50 SARS-CoV-2假病毒混合于96孔Costar板中(Corning, Inc., 康宁, 纽约), 37 ℃下孵育1 h, 然后加入Huh 7细胞(每孔2×104细胞), 孵育24 h。通过测量生物发光值来确定病毒感染性。根据剂量-反应曲线确定化合物抗病毒的EC50值。同时, 在没有假病毒的情况下, 进行细胞毒性测试以确定每种测试化合物的CC50值。
2.2 体外细胞水平抗G*ΔG-VSV假病毒活性评价将每种化合物(终浓度200 μmol·L-1) 的系列稀释液与1.3×104 TCID50 G*ΔG-VSV假病毒混合于96孔Costar板(Corning, Inc., 康宁, 纽约), 37 ℃下孵育1 h, 然后加入Huh 7细胞(每孔2×104细胞), 孵育24 h。通过测量生物发光值来确定病毒的感染性, EC50由剂量反应曲线确定。
2.3 急性毒性实验本部分动物实验遵循中国医学科学院药物研究所动物实验中心标准操作规程。以昆明种小鼠(18~20 g) 为动物模型, 称重后按照每组10只、雌雄各半随机分组。将化合物3m在研钵中充分研磨, 分别配制成0、25、50和100 mg·mL-1混悬液, 给药前充分震荡, 使药物混悬均匀, 每只小鼠按照0、250、500和1 000 mg·kg-1的剂量灌胃给药0.2 mL, 密切观察动物7天内的死亡情况, 计算LD50。
2.4 时间添加实验将Huh 7细胞在96孔板中培养24 h, 随后将化合物(终浓度25 μmol·L-1) 在SARS-CoV-2假病毒感染前1 h (-1 h), 病毒感染中(0 h) 及病毒感染后(+1 h) 的不同时间段进行孵育。病毒感染后24 h检测生物发光值, 对化合物抗假病毒的效果进行分析[14]。
作者贡献: 范田运负责所有目标物的合成、文献的调研整理及初稿的撰写; 吴佳静负责抗SARS-CoV-2假病毒活性筛选; 李迎红、黄维金、汪燕翔和王佑春教授负责实验把关及稿件修改等工作; 郭茜茜和赵丽萍帮助目标物的分离; 本文的通讯作者宋丹青教授负责实验设计和把关、稿件修改等工作。
利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。
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