2021, Vol. 56
扑热息痛(paracetamol) 又称对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP), 是世界范围内广泛使用的解热镇痛药, 在常规剂量(< 4 g·d-1) 内安全有效, 但过量服用可能导致严重肝损伤, 甚至死亡[1]。APAP所致肝损伤是药源性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)[2]和急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)[3]的主要来源。其导致肝损伤的作用机制为细胞色素P450酶[cytochrome P450, CYP450, 主要为CYP2E1和CYP3A4 (小鼠CYP3A11)] 介导APAP代谢激活, 生成毒性中间体N-乙酰对苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine, NAPQI), 与肝脏内源性谷胱甘肽(glutathione, GSH) 结合生成APAP-GSH复合物, 使GSH耗竭, 最终导致肝细胞坏死[4]。APAP-GSH复合物最终代谢为APAP-半胱氨酸复合物(APAP-cysteinyl, APAP-CYS) 和APAP-N-乙酰半胱氨酸复合物(APAP-N-acetylcysteinyl, APAP-NAC)[5]。抑制APAP的代谢激活是抵抗APAP所致肝损伤的主要防治策略之一。研究表明, 敲除APAP代谢相关CYP450酶[6]或给予CYP450酶抑制剂[7, 8]均可减少APAP代谢激活, 从而抵抗APAP所致肝损伤。
五酯片(Wuzhi Tablet, WZ) 是传统中药南五味子的醇浸膏制剂, 主要活性成分为联苯环辛烯类木脂素[9], 临床上作为护肝中药用于肝炎及各种肝损伤的治疗。作者前期研究[10-14]显示, WZ及五味子醇乙等木脂素类活性单体均可显著预防和治疗APAP所致肝损伤。相关机制包括: 抑制CYP450酶活性从而抑制APAP代谢激活、调控核因子红细胞系相关因子-2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2) 通路从而抗氧化应激、促进肝再生等。由于代谢酶抑制作用与抑制剂浓度密切相关, 因此, WZ与代谢酶底物药物的不同给药时间间隔对CYP3A4等代谢酶活性的抑制作用可能会有差异, 从而导致对底物药物代谢过程产生不同的影响。前期研究[15]发现, 单次灌胃给予WZ (250 mg·kg-1) 0、0.5、2 h后再灌胃给予他克莫司(CYP3A4底物药物), 可分别使他克莫司的AUC升高1.76、1.26、2.48倍, 表明WZ与底物药物给药间隔的不同造成对代谢酶活性抑制程度不同, 因而对他克莫司的代谢和血药浓度产生不同程度的影响。基于此, 作者推测WZ与APAP的不同给药间隔, 也可能由于WZ对代谢酶抑制作用程度的差异, 从而对APAP代谢激活及其所致肝损伤产生不同程度的影响。
本研究采用APAP所致小鼠肝损伤模型, 通过考察WZ与APAP不同间隔给药后, 其肝损伤指标变化、APAP代谢物生成情况和APAP代谢激活相关CYP450酶活性, 研究WZ不同预处理时间抵抗APAP所致肝损伤的作用及机制, 为临床应用WZ防治APAP所致肝损伤提供更多数据。
材料与方法药品和试剂 APAP (美国Sigma公司); 五酯片(广西方略药业集团有限公司); 通用型组织固定液(武汉塞维尔生物科技有限公司); 氢氧化钠(上海阿拉丁公司); 丙二醛(malonaldehyde, MDA) 测定试剂盒、微量GSH测定试剂盒(南京建成生物工程研究所); 甲醇、甲酸(色谱纯, 美国TEDIA公司); APAP-NAC、APAP-CYS、6-羟基氯唑沙宗(6-OH-chlorzoxazone, 6-OH-CHL)、氧化硝苯地平(oxidized nifedipine-d6, DNIF)、酮康唑(ketoconazole, KET) (加拿大Toronto Research Chemicals公司); 对氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid, PABA)、4-甲基吡唑(4-methylpyrazole, 4-ME)、氯唑沙宗(chlorzoxazone, CHL)、硝苯地平(nifedipine, NIF)、还原型辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH) (上海源叶生物有限公司); 氯雷他定(loratadine, LOR) (大连美仑生物有限公司); RIPA裂解液(上海博彩生物科技有限公司); Anti-CYP3A11 (武汉爱博泰克生物科技有限公司); Anti-CYP2E1 (上海生工生物工程有限公司); Anti-GAPDH、Anti-rabbit IgG-HRP (美国Cell Signaling Technology公司); 组织线粒体分离试剂盒、loading buffer (上海碧云天生物技术有限公司); BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白marker (美国Thermo Fisher Scientific公司); ECL显影试剂盒(北京恩格英生物技术有限公司)。
仪器 Ultimate 3000 UPLC系统、TSQ Quantum Access系统、Multiskan Go酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); 超纯水仪(美国Millipore公司); Precellys24多功能样本均质仪(法国Bertin公司); 5417R低温高速离心机、微量移液器(德国Eppendorf公司); 低温超高速离心机(美国Beckman公司); AE260电子天平(美国Mettler Toledo公司); RM2016切片机(德国Leica公司); CX48生物显微镜(日本Olympus公司); Mini-Protein3电泳系统、Mini Trans-Blot转移系统(美国Bio Rad公司); Image Quantity LAS 4000成像仪(美国General Electric公司)。
实验动物 C57BL/6雄性小鼠, 6~8周龄, 由广东省医学实验动物中心提供, 生产许可证号: SCXK (粤) 2018-0002, 使用许可证号: SYXK (粤) 2018-0002; 饲养于中山大学(东校园) 实验动物中心SPF级环境, 温度22~24 ℃, 湿度55%~60%, 光照循环12 h, 自由摄取水和食物, 实验前12 h禁食, 不禁水。动物实验经中山大学动物伦理委员会审核通过(批准号: 东-C2020-000035XS)。
动物分组与给药 小鼠随机分为4组, 即APAP对照组(saline + APAP)、WZ间隔0 h组(WZ + APAP 0 h)、WZ间隔0.5 h组(WZ + APAP 0.5 h) 及WZ间隔2 h组(WZ + APAP 2 h)。
取WZ研细, 精密称取适量粉末, 加入生理盐水溶解, 超声处理10 min, 制得35 mg·mL-1 WZ灌胃混悬液(灌胃体积为0.02 mL·g-1, 剂量为700 mg·kg-1)。取APAP粉末适量于温水中溶解, 加入适量氢氧化钠溶液(2 mol·L-1) 调节至pH 10左右, 制得40 mg·mL-1 APAP溶液(腹腔注射体积为0.01 mL·g-1, 剂量为400 mg·kg-1)。各WZ间隔组(WZ + APAP 0、0.5、2 h) 分别在单次灌胃WZ混悬液0、0.5和2 h后, 腹腔注射APAP溶液。APAP对照组(生理盐水+ APAP) 单次灌胃生理盐水后, 腹腔注射APAP溶液。各组小鼠在给予APAP 6 h后, 摘眼球取血, 颈椎脱臼处死, 解剖并收取肝脏。
组织切片染色及观察 肝脏组织于固定液中固定24 h以上, 脱水后石蜡包埋, 厚度约3 μm, 60 ℃烘片后脱蜡, 0.5%伊红-苏木素染色, 梯度酒精脱水, 树脂封片。显微镜观察及拍照。
测定血清转氨酶水平 血液室温静置30 min, 于3 500 r·min-1、4 ℃离心10 min, 取得血清。送样广东省医学实验动物中心生化检测室检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT) 及天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST) 水平。
测定肝脏组织总MDA、总GSH和线粒体GSH水平 称取肝组织约50 mg于匀浆管中, 加入生理盐水500 μL匀浆, 然后3 500 r·min-1、4 ℃离心10 min。按线粒体分离试剂盒操作, 制得肝脏组织线粒体裂解液。按MDA和GSH试剂盒说明书, 使用硫代巴比妥酸法和二硫代二硝基苯甲酸法, 测定肝脏组织总MDA、总GSH水平和线粒体GSH水平。
血清样品处理 取血清5 μL, 加入内标PABA溶液(2 μg·mL-1) 10 μL和甲醇85 μL, 涡旋10 min, 置于-20 ℃冰箱冷冻静置20 min, 15 000 r·min-1, 4 ℃离心15 min, 取上清20 μL, 加入0.1%甲酸水溶液980 μL稀释, 充分涡旋混匀, 15 000 r·min-1、4 ℃离心10 min, 取上清待测。
HPLC-MS/MS方法测定血清APAP代谢物水平 建立血清中APAP代谢物APAP-CYS和APAP-NAC的HPLC-MS/MS检测分析方法。色谱条件: 选用Thermo Fisher Scientific的Hypurity C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μm) 色谱柱, 柱温为40 ℃; 流动相为甲醇: 0.1%甲酸-水(80∶20), 等梯度洗脱; 流速为0.2 mL·min-1, 扫描时间为5 min; 进样量为10 μL, 进样器温度为15 ℃。质谱条件: 离子源为电喷雾离子源, 喷雾正电压为2 500 V, 毛细管温度为350 ℃; 离子检测方式为选择反应监测, 定量监测分析的离子对分别为APAP-NAC, [M+H]+, m/z 312.90→207.80; APAP-CYS, [M+Na]+, m/z 271.00→139.90; PABA, [M+H]+, m/z 138.10→120.00。配制系列浓度范围的APAP-CYS (30 000、15 000、7 500、3 750、1 875、937.5、468.75和234.375 ng·mL-1) 和APAP-NAC (2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ng·mL-1) 标准曲线样品, 加入内标PABA溶液(2 μg·mL-1) 10 μL, 于HPLC-MS/MS系统测得APAP-CYS和APAP-NAC的标准曲线。待测样品按上述血清样品处理方法处理, 于HPLC-MS/MS系统测定APAP代谢物水平。
肝微粒体提取 小鼠断头处死, 摘取肝脏, 使用4 ℃预冷蔗糖溶液漂洗, 加入肝重2倍体积蔗糖溶液, 冰上手动匀浆, 16 000 ×g、4 ℃离心20 min, 上清置于超高速离心管中, 100 000 ×g、4 ℃离心60 min。弃上清, 焦磷酸钾溶液清洗沉淀, 100 000 ×g、4 ℃离心60 min。弃上清, Tris-HCl缓冲液重悬后进行蛋白定量, 制得小鼠肝微粒体蛋白。
WZ提取物溶液制备 按已建立方法[16]制备WZ提取物溶液, 取WZ研细, 精密称取适量粉末, 加100倍体积无水乙醇混匀后超声60 min, 3 500 r·min-1离心10 min, 取上清液; 残渣重复上述过程, 合并2次上清并挥干溶剂, 加入适量DMSO溶解, 制得0.125、0.25和0.5 mg·mL-1的WZ提取物溶液。
肝微粒体孵育及样品处理 按已建立方法[10]制备肝微粒体孵育体系, 含小鼠肝微粒体蛋白和混合探针底物(CHL和NIF), 阳性对照组加入KET及4-ME, 空白组加入甲醇, 给药组加入WZ提取物溶液(0.125、0.25和0.5 mg·mL-1)。体系于37 ℃水浴预孵育, 加入NADPH启动反应, 37 ℃水浴孵育20 min, 加入冰乙酸乙酯终止反应。加入内标LOR溶液(2 μg·mL-1) 10 μL, 旋涡振荡2 min, 静置10 min, 3 500 r·min-1离心10 min, 转移上清并挥干有机溶剂。进样前, 加入80%甲醇水溶液200 μL复溶, 加入内标LOR溶液(2 μg·mL-1) 10 μL, 涡旋振荡1 min, 16 000 r·min-1离心5 min, 制得进样样品。
HPLC-MS/MS方法测定CYP450酶活性 建立肝微粒体孵育体系中探针底物代谢物6-OH-CHL和DNIF的HPLC-MS/MS检测分析方法。色谱条件: 选用Waters的Xetrra C18 (100 mm×2.1 mm, 5 μm) 色谱柱, 柱温为40 ℃; 流动相为甲醇: 0.1%甲酸-水(70∶30), 等梯度洗脱, 流速为0.3 mL·min-1, 分析时间为3.5 min; 进样量为10 μL, 进样器温度为15 ℃。质谱条件: 离子源为电喷雾离子源, 喷雾正电压为3 500 V, 喷雾负电压为2 500 V, 毛细管温度为350 ℃; 离子检测方式为选择反应监测, 定量监测分析的离子对分别为6-OH-CHL, [M-H]-, m/z 184.107→120.20; DNIF, [M+H]+, m/z 345.132→284.107; LOR, [M+H]+, m/z 382.00→266.00。配制系列浓度范围的6-OH-CHL (6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2和0.1 μmol·L-1) 和DNIF (4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 μmol·L-1) 标准曲线样品, 加入内标LOR溶液(2 μg·mL-1) 10 μL, 于HPLC-MS/MS系统测得6-OH-CHL和DNIF的标准曲线。进样样品于HPLC-MS/MS系统测定肝微粒体孵育样品中探针代谢物含量, 计算CYP450酶活性。
Western blot测定CYP450蛋白水平 按文献[16]方法, 取小鼠肝组织加入RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟) 匀浆, 用BCA试剂盒测定并调整各组匀浆蛋白浓度, 加入loading buffer, 95 ℃水浴使蛋白变性。进行SDS-PAGE电泳和转膜, 5%脱脂牛奶封闭后孵育一抗(Anti-CYP2E1 1∶1 000、Anti-CYP3A11 1∶1 000、Anti-GAPDH 1∶2 000) 4 ℃过夜, 次日孵育二抗(Anti-rabbit IgG-HRP 1∶2 000) 后显影。使用ImageJ软件扫描条带灰度值, 计算相对蛋白表达水平。
统计学方法 本实验各项数据以mean ± S.E.M. 表示, 使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析, 采用unpaired Student's t-test检验比较各间隔组与对照组的组间差异。P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果 1 WZ不同给药间隔抵抗APAP所致肝损伤的作用小鼠肝脏切片H & E染色结果如图 1A所示。APAP对照组各中央静脉区出现肝细胞融合性坏死, 肝小叶间出现肝细胞桥接样坏死, 表明APAP造模导致小鼠肝组织严重损伤; WZ间隔给药各组肝细胞坏死区域显著缩小, 肝组织损伤程度较APAP对照组均显著减轻。血清转氨酶水平变化如图 1B所示。与APAP对照组相比, WZ间隔给药各组血清转氨酶水平均显著下降(P < 0.01); 其中间隔0.5 h组转氨酶水平下降最显著, ALT和AST水平分别降低至1 400 ± 337.9 U·L-1 (-60.25%, P < 0.001) 及968.4 ± 134.3 U·L-1 (-60.97%, P < 0.001)。肝脏总MDA水平变化如图 1C变化所示。相较APAP对照组, WZ间隔给药各组肝脏总MDA水平均显著下降(P < 0.05); 其中间隔0.5 h组降低MDA水平最显著, 相较对照组下降了39.07% (P < 0.01)。肝脏总GSH和线粒体GSH水平变化如图 1D所示。除WZ间隔0 h组的总GSH无显著变化外, 其他WZ间隔给药各组总GSH和线粒体GSH水平相较APAP对照组均显著上升(P < 0.05); 其中间隔0.5 h组减轻GSH耗竭最显著, 其总GSH和线粒体GSH水平相较对照组上升至16.10 ± 0.91 μmol·g-1 (+63.85%, P < 0.01) 及9.30 ± 0.65 μmol·g-1 (+37.92%, P < 0.01)。结果表明, WZ不同给药间隔均起到保护APAP所致肝损伤的作用, 其中间隔0.5 h (即APAP给药前0.5 h给予WZ) 的保护效果最显著。
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Figure 1 Pretreatment with WZ protects against APAP-induced hepatotoxicity in mice. Mice were pretreated with WZ at 0, 0.5, and 2 h before APAP exposure. A: Morphological photographs of liver section; B: Serum biochemical indexes; C: Liver total MDA level; D: Liver total GSH level and mitochondria GSH level. APAP: Acetaminophen; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; MDA: Malonaldehyde; GSH: Glutathione. n = 5 or 6, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs the saline + APAP group |
小鼠血清APAP代谢物APAP-CYS和APAP-NAC水平变化分别如图 2A和2B所示。除间隔0 h组APAP-CYS外, WZ预处理间隔给药各组血清APAP-CYS、APAP-NAC水平相较APAP对照组均显著降低(P < 0.05); 其中间隔2 h组的APAP代谢物水平降低最显著, APAP-CYS和APAP-NAC水平分别降低至5 588 ± 552.4 ng·mL-1 (-47.80%, P < 0.01) 及186.3 ± 18.41 ng·mL-1 (-62.30%, P < 0.01)。结果表明, WZ不同预处理给药间隔均显著降低了APAP代谢物水平, 其中WZ预处理2 h后APAP造模的代谢物水平降低最显著。
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Figure 2 Pretreatment with WZ reduces the production of APAP metabolites. Mice were pretreated with WZ at 0, 0.5, and 2 h before APAP exposure. A: APAP-CYS level; B: Serum APAP-NAC level. APAP-CYS: APAP-cysteinyl; APAP-NAC: APAP-N-acetylcysteinyl. n = 5 or 6, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs the saline + APAP group |
WZ提取物溶液与小鼠肝微粒体共孵育后, APAP代谢相关CYP450酶CYP2E1及CYP3A11活性变化如图 3所示。CYP2E1及CYP3A11阳性抑制剂4-ME及KET均显著降低了探针底物代谢物水平, 表明4-ME和KET显著抑制了CYP2E1和CYP3A11活性(P < 0.001)。WZ各浓度组均显著降低CYP2E1和CYP3A11探针底物代谢物水平, 表明WZ显著抑制CYP2E1和CYP3A11活性, 且呈明显的浓度依赖性, WZ高浓度(0.5 mg·mL-1) (P < 0.001) 的抑制效果相较低浓度(0.125和0.25 mg·mL-1) (P < 0.05) 更为显著。结果表明, WZ对APAP代谢酶CYP2E1和CYP3A11有显著抑制作用, 且呈明显的浓度依赖性。
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Figure 3 WZ significantly inhibits the activities of CYP2E1 and CYP3A11 in mouse liver microsomes. CYPs: Cytochrome P450. n = 3, x±s. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs the control group |
小鼠肝脏APAP代谢酶CYP2E1和CYP3A11的蛋白水平变化如图 4所示。WZ间隔给药各组小鼠肝脏CYP2E1和CYP3A11蛋白水平较APAP对照组均显著下调(P < 0.05); 其中WZ间隔0.5 h组下调最显著(P < 0.01), CYP2E1和CYP3A11蛋白水平分别为对照组的54.62%和54.63%。结果表明, WZ不同预处理给药间隔均显著下调了CYP450酶蛋白水平, 且0.5 h时下调最显著。
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Figure 4 Pretreatment with WZ reduces CYPs protein expression. Mice were pretreated with WZ at 0, 0.5, and 2 h before APAP exposure. A: Western blots of target proteins; B: Grey scanning analysis of CYP2E1 and CYP3A11 blots. n = 3, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs the saline + APAP group |
作者此前在WZ抵抗APAP所致肝损伤的保护作用研究中, 采用的给药方案是连续给予WZ三天, 最后一次给药后间隔15 min给予APAP造模, 阐明了WZ通过抑制代谢激活、抗氧化应激、促进肝修复等多种机制对APAP所致肝损伤的显著预防作用[10-13]。本研究重点考察单次不同间隔时间给予WZ进行预处理抵抗APAP所致肝损伤的作用, 发现WZ预处理(0、0.5和2 h) 均可以显著减轻APAP所致肝组织病理损伤, 降低血清转氨酶、肝组织MDA的升高, 减轻肝总GSH和线粒体GSH耗竭, 从而发挥抵抗APAP所致肝损伤的作用。WZ上述给药方案均能发挥显著抵抗APAP肝损伤的作用, 提示WZ抗APAP肝损伤是一个涉及多重作用机制协同发挥作用的复杂过程。
APAP过量后, 经CYP450酶代谢激活生成毒性代谢产物NAPQI。因此抑制CYP450酶活性, 进而抑制APAP代谢激活, 是抵抗APAP所致肝损伤的重要策略之一。作者前期研究[17]显示, WZ可抑制CYP450酶, 其机制包括竞争性抑制(与目标底物竞争CYP450酶, 具有浓度依赖性) 和不可逆抑制(与CYP450酶形成复合物, 不可逆地抑制CYP450酶活性)。本研究确证了WZ可浓度依赖性抑制APAP代谢激活相关CYP450酶活性, 从而减少APAP代谢物APAP-CYS、APAP-NAC的生成, 抵抗APAP所致肝损伤。由于代谢酶抑制作用与抑制剂浓度密切相关, 因此, WZ给药后不同时间其血药浓度不同从而抑制代谢酶活性的程度也不同, 导致WZ对代谢酶底物药物的体内代谢和处置过程产生不同的影响[15]。
作者前期研究WZ与他克莫司(CYP3A4底物药物) 相互作用时也发现不同给药间隔的类似影响。WZ中含量最高的三种成分五味子酯甲、五味子甲素及五味子醇乙在大鼠体内的半衰期分别为2.79 ± 1.51、3.65 ± 0.94及4.51 ± 1.75 h, 整体代谢消除较快[18]。进一步研究显示, WZ与他克莫司的不同给药间隔, 会不同程度影响WZ升高他克莫司血药浓度: 单次灌胃给予WZ (250 mg·kg-1) 0、0.5和2 h后再灌胃给予他克莫司, 可使他克莫司的AUC分别升高1.76、1.26和2.48倍, 表明WZ预处理时间的长短对代谢酶有不同影响, 从而显著影响了他克莫司血药浓度[15]。基于不同给药间隔对WZ-他克莫司药物相互作用的影响, 作者推测不同给药间隔对WZ-APAP相互作用有类似作用, 从而影响WZ对APAP肝损伤的作用, 因此, 本研究着重考察了预处理给药间隔对WZ抵抗APAP肝损伤作用的影响。
本研究发现WZ与APPA间隔0、0.5和2 h给药均具有显著抵抗APAP所致肝损伤的作用, 其中WZ预处理0.5 h组(即APAP造模0.5 h前给予WZ) 逆转各项指标效果最为显著。作者此前曾考察了大鼠单次灌胃给予WZ (250 mg·kg-1) 后, WZ中木脂素单体在各组织的分布, 发现给药后0.25 h大鼠肝脏中可检测到五味子甲素、醇甲、醇乙、酯甲, 且均为峰值, 表明五味子甲素、醇甲、醇乙、酯甲灌胃后可以被迅速吸收至肝脏; 给药后0.25 h到1.5 h期间, 这些木脂素单体在大鼠肝脏的浓度下降较快[19]。基于代谢激活在APAP所致肝损伤的重要作用及WZ对代谢激活相关代谢酶的抑制作用, 作者推测可能是由于相较于同时给药或预处理后2 h, APAP造模前0.5 h给予WZ, 此时WZ在肝脏的浓度较高, 能充分抑制CYP450酶活性及其介导的代谢激活; 相比之下, 0 h (同时) 给药时, WZ可能未完全到达肝脏, 而2 h时肝脏中WZ木脂素单体浓度已开始下降, 其肝药浓度低于0.5 h时, 因此, WZ预处理0.5 h组(即APAP造模0.5 h前给予WZ) 抵抗APAP所致肝损伤的效果稍优于同时给药组及预处理2 h组。但总体而言, 由于WZ灌胃后迅速到达肝脏, 且在2 h内血药及肝药浓度均较高, 所以, 无论是APAP与WZ同时给药, 还是APAP造模前0.5 h或2 h给予WZ, 均发挥抵抗APAP肝损伤的显著作用。
本研究还观察到, WZ单次预处理给药显著下调了CYP2E1和CYP3A11的蛋白表达水平。作者此前研究发现, WZ预处理三天后可逆转APAP所致的CYP2E1及CYP3A11蛋白水平下调[13], 且WZ长期给药可诱导大鼠肝脏CYP3A蛋白表达[16], 亦证明了WZ对CYP3A瞬时抑制、长期诱导的复杂作用。但本次研究仅为WZ单次给药, 故其对CYP450的诱导作用未能体现。因此, 本研究WZ单次预处理给药可下调APAP代谢激活相关CYP2E1和CYP3A11的蛋白水平和活性, 抑制APAP代谢激活, 从而抵抗APAP所致肝损伤。
综上所述, 本研究采用APAP所致小鼠急性肝损伤模型, 进一步确证了WZ通过抑制CYP2E1和CYP3A11等代谢酶活性、抑制APAP代谢激活, 从而抵抗APAP所致肝损伤的作用, 证明了WZ不同预处理给药间隔均显著抵抗APAP所致肝损伤, 但作用程度稍有差异。本研究结果为应用WZ预防和治疗APAP所致肝损伤提供更多数据和参考。
作者贡献: 徐乐千负责部分实验设计与实施、统计分析结果、撰写论文; 周艳莹负责部分实验设计与实施、统计分析结果、部分修订; 姜伊鸣负责部分指导实验; 邢云惠负责实施部分实验; 黄民与毕惠嫦负责研究思路的提出及实验设计、统筹指导实验、修订论文。
利益冲突: 本文所有作者之间不存在利益冲突。
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