2. 昆明理工大学医学院, 云南 昆明 650500;
3. 中国科学院昆明植物研究所, 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室, 云南 昆明 650201;
4. 苏州大学药学院, 江苏 苏州 215021
2. College of Medicine, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China;
3. State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China;
4. College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou 215021, China
登革病毒(dengue virus, DENV) 属于黄病毒科黄病毒属, 基因组为11 kb的单义正链RNA。DENV基因组编码3种结构蛋白(核壳蛋白C、膜结合蛋白M、胞膜蛋白E) 和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。根据抗原的不同, DENV病毒包括4个血清型(DENV-1、-2、-3、-4), 不同血清型之间的基因序列仅具有65%~70%的同源性[1, 2]。临床上, DENV感染可分为普通登革热(dengue fever, DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF) 和登革休克综合症(dengue shock syndrome, DSS) 3种病型。人体感染任何一种血清型时, 通常只会引起较轻型的发热并能产生特异性中和抗体, 而非中和性异型抗体可引起抗体依赖性增强作用(antibody-dependent enhancement, ADE)。流行病学研究表明, 90%的DHF和DSS病例发生于继发性异型血清型DENV感染[3-6]。
在过去50年中, 全球每年大约有128个国家、3.9亿人口感染, 其中有9 600万人被确诊为不同严重程度的登革热, 全球近一半人口处于DENV感染的风险中[7]。近年来, 我国多个地区发生登革热暴发流行而且有蔓延趋势。尽管DENV感染导致的发病率和死亡率使全球经济和卫生负担日益增加, 但目前尚无批准上市的抗DENV疫苗和药物[8, 9]。因此, 开发有效的抗登革热药物迫在眉睫。
天然产物特有的化学结构使其具有复杂性和生物活性多样性, 其经过了“进化预选”, 是创新药物的重要来源之一。石栗[Aleurites moluccana (L.) Willd] 为大戟科石栗属乔木植物, 主要产于亚洲的热带和亚热带地区。大戟科植物药用价值显著, 在抗菌、抗炎、抗病毒、抗结核、抗肿瘤以及神经生长因子促进作用等方面都有优良的药理活性[10]。石栗的果实石栗子和枝叶都是传统中药材, 主要成分含有脂肪酸类和萜类化合物, 有镇痛、止血、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等功效[11]。石栗树叶提取的半固体药物具有镇痛、抗炎和促进伤口愈合作用[12], 树叶和树皮提取物均具有抗HIV-1病毒活性[13]以及抗金葡菌和绿脓杆菌作用[14], 其树叶提取物在大鼠体内有降血脂作用[15]。至今未检索到石栗及其提取物的抗DENV作用的研究报道。据《中药大辞典》记载, 石栗叶具有活血通经, 止血之功效, 主治闭经、金疮出血。作者前期对其枝叶的化学成分开展了研究, 发现了罗汉松烷型二萜(podocarpane diterpenoids)、3, 4-断裂罗汉松烷型二萜(3, 4-seco-podocarpane diterpenoids)、对映-海松烷型二萜(ent-pimarane diterpenoids) 等多种类型的二萜化合物[16]。作者筛选了这些二萜化合物的抗DENV活性, 发现(3α, 5β, 10α)-13-methoxypodocarpa-8, 11, 13-triene-3, 12-diol (MPTD) 对DENV具有显著抑制作用[17]。本研究旨在探索MPTD抗DENV活性, 并对其作用机制进行初步研究, 期望为开发有效的抗DENV药物奠定科学基础。
材料与方法药物 化合物MPTD从石栗枝叶分离得到, 为无色方晶(CHCl3), 纯度≥98%; 根据质谱ESI-MS m/z 313 [M+Na]+, 推断其分子式为C18H26O3, 相对分子质量为290。核磁波谱数据为: 1H NMR (CDCl3): δH 1.50 (ddd, J = 13.2, 8.8, 4.0 Hz, H-1a), 2.22 (ddd, J = 12.8, 7.0, 3.2 Hz, H-1b), 1.75 (m, H-2a), 1.83 (m, H-2b), 3.31 (dd, J = 12.9, 3.7 Hz, H-3), 1.30 (dd, J = 10.0, 1.6 Hz, H-5), 1.75 (dd, J = 12.6, 6.6 Hz, H-6a), 1.85 (m, H-6b), 2.60 (ddd, J =17.0, 7.2, 5.2 Hz, H-7a), 2.78 (ddd, J = 16.8, 6.8, 4.0 Hz, H-7b), 6.80 (s, H-11), 6.51 (s, H-14), 1.07 (s, Me-18), 0.88 (s, Me-19), 1.17 (s, Me-20), 3.83 (s, OMe); 13C NMR (CDCl3): δC 37.0 (C-1, t), 28.0 (C-2, t), 78.7 (C-3, d), 38.9 (C-4, s), 49.9 (C-5, d), 18.9 (C-6, t), 30.5 (C-7, t), 126.4 (C-8, s), 142.2 (C-9, s), 37.1 (C-10, s), 110.5 (C-11, d), 143.4 (C-12, s), 144.4 (C-13, s), 110.6 (C-14, d), 28.1 (C-18, q), 15.3 (C-19, q), 24.8 (C-20, q), 55.8 (OMe)。结构如图 1所示。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG, 上海麦克林生化科技有限公司); 利巴韦林(ribavirin, 大连美仑生物技术有限公司); MPTD溶于100%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 中, 保存于4 ℃备用。
主要试剂 低熔点琼脂糖(美国Amresco公司); 结晶紫(北京索莱宝公司); DMEM、RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (Thermo Fisher公司); DENV-2蛋白E抗体(义翘神州公司); 抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗体(北京康为世纪公司); MTT (Sigma公司); 二甲基甲酰胺(N, N-dimethyl formamide, DMF) (西陇化工股份有限公司); 逆转录cDNA试剂盒、实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 试剂盒、引物及TaqMan探针(Takara公司), RNA提取试剂盒Roche High Pure Viral RNA Kit (Roche公司)。
细胞与病毒 非洲绿猴肾细胞(Vero)、人肝癌细胞(HepG2) 和人肝细胞系(Huh7) 均购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。白纹伊蚊细胞(C6/36) 购自中国科学院上海细胞库。Vero、Huh7和HepG2细胞在含10% FBS的DMEM培养基中培养, C6/36细胞于含10% FBS的RPMI-1640培养基中培养, 细胞维持液含2% FBS。所有培养液均含有100 u·mL-1青霉素和100 μg·mL-1硫酸链霉素。DENV-1 D06063株(GenBank: JQ3177413.1)、DENV-2 New Guinea C株(GenBank: KM204118.1)、DENV-3 YNSW1株(GenBank: KR296743.1) 和DENV-4 LD34株(GenBank: 未发表) 均由中国医学科学院昆明医学生物研究所孙明强研究员提供。采用C6/36细胞进行病毒扩增, 噬斑法测定病毒滴度。实验用DENV-1、-2、-3和-4病毒滴度分别为1.07×104、5.6×104、8.69×103和2.32×103 PFU·mL-1。
噬斑法检测MPTD对DENV的抑制活性 将对数生长期Vero细胞用含10% FBS的DMEM培养基重悬并调浓度为每毫升3×105个, 每孔1 mL加至12孔板, 在5% CO2、37 ℃的培养箱中培养过夜。待细胞长至单层后弃掉培养上清, 加入DENV感染2 h, 磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline, PBS) 洗涤细胞3次以除去游离病毒, 待测MPTD用4% FBS进行5倍梯度稀释, 每个浓度设3个复孔, 分别设置含病毒和细胞的阳性对照孔(positive control, PC) 和仅含细胞的阴性对照孔(blank control, BC)。每孔加入1 mL药物稀释液和1 mL 2%低熔点琼脂的混合培养基, 待琼脂糖凝固后转移至培养箱连续培养5天, 用4%多聚甲醛固定琼脂块10~15 min, 用PBS洗涤3次, 再用0.8%的结晶紫染色, 用清水清洗残余结晶紫溶液后烘干。酶联荧光斑点分析仪计数噬斑, 用GraphPad Prism软件计算化合物的半数有效浓度(50% effective concentration, EC50)[18]。
细胞毒性检测 将Vero细胞接种到96孔板中培养过夜, 加入5倍梯度的化合物稀释液(每孔100 μL), 设置实验组和空白对照组, 每个浓度设3个复孔。在37 ℃培养箱中孵育72 h后, 加入20 μL 5 mg·mL-1 MTT, 于37 ℃孵育4 h, 再加入100 μL的12% SDS-50% DMF溶液并在37 ℃孵育过夜。待结晶甲臜完全溶解后, 使用Elx800酶标仪测量吸光度(A) 值, 波长为570 nm, 参比波长为630 nm, 计算其半数细胞毒性浓度(50% cytotoxic concentration, CC50)。
qRT-PCR检测DENV-2 RNA 用试剂盒Roche High Pure Viral RNA Kit提取细胞上清中的病毒RNA, Trizol法提取细胞内的RNA, 实验步骤遵循试剂盒说明书。在37 ℃下, DENV-2分别感染Vero和Huh7细胞2 h, PBS洗涤3次, 然后加入待测MPTD, 并使用DMSO和未感染的细胞分别作为阳性和阴性对照, 设置3个复孔。在5% CO2、37 ℃的培养箱中共同培养72 h后, 收获细胞上清液提取病毒RNA。使用一步法试剂盒RNA-directTM Real-time PCR Master Mix和TaqMan探针定量检测培养上清中释放的子代病毒RNA。应用DENV-2引物(序列为5'-TTCCTATCCATGTGATAAT GACTCCTA-3'和5'-AGGCTCTCCACCAAGTTTTCG G-3') 及TaqMan探针(序列为5'-FAM/TCCAGGCTCA GATGCTTTTT/TAMRA-3') 进行扩增。qRT-PCR反应条件为: 95 ℃预变性30 s; 95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环。
Western blot实验 检测MPTD对DENV-2 E蛋白表达的抑制作用。将Vero细胞加入12孔板(3×105个/孔), 在5% CO2、37 ℃条件下培养过夜。待细胞长成单层, 经DENV-2感染和梯度稀释的MPTD处理后继续共培养72 h, 弃上清并用PBS洗涤3次, 加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(每孔200 μL) 于冰上裂解30 min, 每10 min晃动细胞板, 轻轻将贴壁细胞吹下后转移至1.5 mL离心管中。离心机提前预冷设置4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min, 所得上清即细胞内总蛋白, 用BCA试剂盒测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 法检测, 并将其转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF) 膜上, 5%脱脂牛奶封闭, 将PVDF膜与抗DENV-2 E抗体于4 ℃孵育过夜。用化学发光底物呈现特异性信号, 并使用Tanon-5200 Multi Imaging System软件进行分析。
分时给药实验 采用分时给药实验观察MPTD作用的DENV生命周期阶段。将Vero细胞加入到12孔板(3×105个/孔), 在5% CO2、37 ℃条件下培养过夜。DENV-2感染Vero细胞2 h, 用PBS洗去游离病毒。分别在感染后(0、1、2、4、6、12、24 h) 加入50 μmol·L-1 MPTD, 培养24 h后收集病毒上清。qRT-PCR定量检测上清中的DENV-2 RNA。
病毒结合实验 Vero细胞接种DENV-2后, 将MPTD和细胞添加到12孔板中, 并在4 ℃下孵育2 h, PBS洗涤未结合的病毒颗粒和残留MPTD。然后, Trizol法提取细胞内的RNA并通过qRT-PCR方法检测细胞中DENV的载量。
统计学方法 实验数据采用GraphPad Prism 6软件进行分析, 数据以x±s表示, 组间比较采用t检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 1 MPTD抑制不同血清型DENV的复制据文献报道[19], 利巴韦林具有抗DENV作用, 因此将其设置为阳性对照。应用噬斑法检测利巴韦林和MPTD对不同血清型DENV的抑制效果, 通过统计在不同药物浓度下的噬斑数并与PC组进行比较, 计算化合物对DENV的抑制率。结果显示(图 2), 利巴韦林和MPTD对DENV的抑制均呈剂量依赖关系。利巴韦林对DENV-2的EC50为40.78 ± 1.02 μmol·L-1, MPTD对DENV-1、-2、-3和-4的EC50分别为2.72 ± 0.39、10.99 ± 5.18、18.72 ± 0.21和0.48 ± 0.28 μmol·L-1, 表明MPTD的抗DENV活性优于利巴韦林。
应用MTT法测定MPTD对病毒感染宿主细胞Vero和Huh7的细胞毒性。结果显示, MPTD对Vero和Huh7细胞的毒性都很小, 其CC50均大于200 μmol·L-1 (图 3)。MPTD对DENV 1~4血清型的治疗指数(CC50/EC50) 分别为: > 73.53、> 18.2、> 10.68和 > 416.67。
采用实时荧光定量PCR法检测MPTD对DENV-2的RNA复制的抑制作用, 以利巴韦林给药组为对照实验组。结果表明, 利巴韦林在Vero细胞和Huh7细胞中抑制DENV-2产生病毒RNA的EC50分别为 > 50和7.28 ± 1.23 μmol·L-1, MPTD在Vero细胞和Huh7细胞中抑制DENV-2产生病毒RNA的EC50分别为3.88 ± 0.24和4.125 ± 0.74 μmol·L-1 (图 4A)。因此, MPTD能够有效抑制DENV-2病毒的复制, 其活性略优于利巴韦林。应用免疫印迹实验检测MPTD对DENV-2 E蛋白表达的作用, 结果表明, MPTD对DENV-2 E蛋白的表达呈剂量依赖性抑制作用(图 4B)。以上结果提示, MPTD对DENV-2 RNA的复制及E蛋白的表达均具有显著抑制作用。
应用分时给药实验研究MPTD在不同时间点处理感染细胞的作用, 以观察其作用于DENV生命周期的阶段(图 5A)。结果显示, 用MPTD在病毒感染Vero细胞后的早期阶段(0、2、6 h) 处理, DENV-2 RNA的产生显著减少(图 5B), 提示MPTD对DENV-2的抑制作用可能在病毒复制的早期阶段。已有研究证实EGCG是DENV-E蛋白抑制剂[20], 因此分别设置EGCG给药组和MPTD给药组, 检测MPTD对病毒结合宿主细胞的影响, 分别与感染DENV-2的Vero细胞于4 ℃条件下共培养2 h。结果显示, MPTD组和EGCG组的DENV-2 RNA水平无显著差异, 提示MPTD可能不会影响DENV的结合(图 5C)。
随着对DENV的蛋白结构和功能、病毒与宿主的相互作用、天然免疫通路以及病毒免疫逃逸功能等方面的深入研究, 同时结合天然产物分离鉴定技术和化合物合成等技术的不断进步, 越来越多的抗病毒药物将被发现[21, 22]。
本文发现MPTD在体外具有抗DENV活性, 其在细胞水平对DENV的抑制作用优于利巴韦林。病毒的侵入过程是感染宿主的重要阶段, 研发可抑制DENV进入细胞早期阶段的药物具有重要意义。通过分时给药实验发现, MPTD在0、2、6 h对DENV具有抑制作用, 推断其可能作用于病毒复制的早期阶段。E蛋白介导DENV与细胞受体的结合和融合过程, 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG是E蛋白抑制剂, 比较EGCG与MPTD对DENV的抑制活性发现, MPTD不通过抑制DENV-E蛋白而使病毒失去感染能力。由于MPTD在2~6 h同样对DENV的复制具有较强抑制作用, 因此作者推测MPTD的抗DENV作用机制可能是抑制病毒的蛋白质合成过程。本研究结果发现, MPTD为植物来源的化合物且具有较好的抗DENV活性, 将为研发抗DENV感染的新型先导化合物并为临床治疗DENV感染引起的严重疾病奠定基础。
作者贡献: 汪芳、姚债文和罗荣华负责抗病毒活性实验实施并采集整理实验数据; 严欢负责化合物纯化和鉴定; 刘海洋和郑永唐负责指导实验设计、研究经费支持及论文修改。
利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。
[1] |
Gopala Reddy SB, Chin WX, Shivananju NS, et al. Dengue virus NS2 and NS4:minor proteins, mammoth roles[J]. Biochem Pharmacol, 2018, 154: 54-63. DOI:10.1016/j.bcp.2018.04.008 |
[2] |
Kuczera D, Assolini JP, Tomiotto PF, et al. Highlights for dengue immunopathogenesis: antibody-dependent enhancement, cytokine storm, and beyond[J]. J Interferon Cytokine Res, 2018, 38: 69-80. DOI:10.1089/jir.2017.0037 |
[3] |
Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al. The global distribution and burden of dengue[J]. Nature, 2013, 496: 504-507. DOI:10.1038/nature12060 |
[4] |
Whitehorn J, Farrar J. Dengue[J]. Brit Med Bull, 2010, 95: 161-173. DOI:10.1093/bmb/ldq019 |
[5] |
Chareonsirisuthigul T, Kalayanarooj S, Ubol S. Dengue virus (DENV) antibody-dependent enhancement of infection upregulates -the production of anti-inflammatory cytokines, but suppresses anti-DENV free radical and pro-inflammatory cytokine production, in THP-1 cells[J]. J Gen Virol, 2007, 88: 365-375. DOI:10.1099/vir.0.82537-0 |
[6] |
Huang KJ, Yang YC, Lin YS, et al. The dual-specific binding of dengue virus and target cells for the antibody-dependent enhancement of dengue virus infection[J]. J Immunol, 2006, 176: 2825-2832. DOI:10.4049/jimmunol.176.5.2825 |
[7] |
Gubler DJ. Dengue, urbanization and globalization: the unholy trinity of the 21st century[J]. Trop Med Health, 2011, 39: 3-11. DOI:10.2149/tmh.2010-21 |
[8] |
Beesetti H, Khanna N, Swaminathan S. Investigational drugs in early development for treating dengue infection[J]. Expert Opin Inv Drug, 2016, 25: 1059-1069. DOI:10.1080/13543784.2016.1201063 |
[9] |
Guy B, Noriega F, Ochiai RL, et al. A recombinant live attenuated tetravalent vaccine for the prevention of dengue[J]. Expert Rev Vaccines, 2017, 16: 671-683. DOI:10.1080/14760584.2017.1335201 |
[10] |
Okealtuntas F, Ipekcioglu S, Sahin YA, et al. Phytochemical analysis, antiproliferative and antioxidant activities of Chrozophora tinctoria: a natural dye plant[J]. Pharmac Biol, 2017, 55: 966. DOI:10.1080/13880209.2016.1277767 |
[11] |
Nara LMQ, Lilian WR, Gislaine FS, et al. Contribution of α, β-amyrenone to the anti-inflammatory and antihypersensitivity effects of Aleurites moluccana (L.) Willd.[J]. Biomed Res Intern, 2014, 2014: 636839. |
[12] |
Cesca TG, Faqueti LG, Rocha LW, et al. Antinociceptive, anti-inflammatory and wound healing features in animal models treated with a semisolid herbal medicine based on Aleurites moluccana L. Willd. Euforbiaceae standardized leaf extract: semisolid herbal[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 143: 355-362. |
[13] |
Locher CP, Witvrouw M, De Béthune MP, et al. Antiviral activity of Hawaiian medicinal plants against human immunodeficiency virus type-1(HIV-1)[J]. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol, 1996, 2: 259-264. |
[14] |
Pedrosa RC, Meyre SC, Cechinel FV, et al. Hypolipidaemic activity of methanol extract of Aleurites moluccana[J]. Phytother Res, 2002, 16: 765-768. DOI:10.1002/ptr.1046 |
[15] |
Michael CA, Dominic AS, Anne M, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay[J]. Cancer Res, 1988, 48: 589-601. |
[16] |
Liu HY, Di YT, Yang JY, et al. Three novel 3, 4-seco-podocarpane trinorditerpenoids from Aleurites moluccana[J]. Tetrahedron Lett, 2008, 49: 5150-5151. DOI:10.1016/j.tetlet.2008.06.088 |
[17] |
Liu HY, Li SJ, Zhao Y, et al. Four new podocarpane-type trinorditerpenes from Aleurites moluccana[J]. Helv Chim Acta, 2007, 90: 2017-2023. DOI:10.1002/hlca.200790209 |
[18] |
Zhang CT, Luo RH, Chen H, et al. Activity of azvudine against dengue viruses in vitro[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2018, 53: 944-949. |
[19] |
Dighe SN, Ekwudu O, Dua K, et al. Recent update on anti-dengue drug discovery[J]. Eur J Med Chem, 2019, 176: 431-455. DOI:10.1016/j.ejmech.2019.05.010 |
[20] |
Calland N, Albecka A, Belouzard S, et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry[J]. Hepatology, 2012, 55: 720-729. DOI:10.1002/hep.24803 |
[21] |
Michael CA, Dominic AS, Anne M, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay[J]. Cancer Res, 1988, 48: 589-601. |
[22] |
Zou G, Xu HY, Qing M, et al. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening[J]. Antiviral Res, 2011, 91: 11-19. DOI:10.1016/j.antiviral.2011.05.001 |