2. 山西大学化学化工学院, 山西 太原 030006
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD) 是常见的中枢神经退行性疾病, 也是造成老年人认知功能障碍的主要原因。β-淀粉样蛋白(amyloid-protein, Aβ) 沉积和Tau蛋白异常磷酸化被认为是AD发生的重要特征。其中, Aβ假说得到了广泛的证据支持, 该假说认为由于Aβ “漏出”神经细胞, 引起周围的神经元和神经胶质细胞的细胞膜和线粒体膜损伤, 诱发炎症反应和氧化应激, 导致神经纤维缠结, 进而引发AD。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP) 分解而来[1], 由无毒的Aβ单体、具有神经毒性的Aβ纤维和Aβ寡聚体聚合组成[2], Aβ的清除是通过非酶促和酶促途径, 如LDL受体相关蛋白1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1)、P-糖蛋白(permeability glycoprotein, P-gp) 和各种肽酶等。正常情况下, Aβ的产生和清除存在一个动态平衡[3]; 但是在衰老或病理情况下, 大脑中Aβ的产生和清除的稳态被打破[4], 导致Aβ积累和老年斑形成[5], 从而引发AD[6]。
Aβ25-35引起PC12细胞损伤主要表现在引起细胞凋亡、氧化应激、炎症和神经毒性等方面。研究发现, Aβ25-35可引起PC12细胞c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK) 磷酸化, 上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (cysteinyl aspartate specific proteinase 3, caspase-3) 和活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3, cleaved caspase-3) 凋亡相关蛋白的水平[7], 并通过促进Fas途径来促进细胞凋亡[8]; Aβ25-35通过促进Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1/核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件-1 (kelch-like ECH-associated protein 1/nuclear factor erythroid 2-related factor 2/hemo oxygenase-1, Keap1/Nrf2/HO-1) 信号通路引起PC12细胞内氧化应激[9], 并增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA) 和线粒体过氧化等氧化损伤[10]; Aβ25-35可激活Janus激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 1, JAK2/STAT1)[11]信号通路引起PC12细胞内炎症水平升高, 增加白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、白介素-8 (interleukin-8, IL-8) 和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 等促炎性细胞因子的分泌[12]; 同时Aβ25-35也可使PC12细胞内的钙调蛋白(calmodulin, CaM)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(calmodulin dependent protein kinase kinase, CaMKK)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ (calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ, CaMKIV)、Tau蛋白表达升高, 引起神经毒性[13]。此外, Aβ25-35引起的PC12细胞损伤可通过其他途径消除。例如磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)[14]通路的激活可消除Aβ25-35引起的神经细胞凋亡; 酪氨酸转移RNA合成酶-多腺苷酸聚合酶的自动聚ADP核糖基化1-沉默信息调节因子1 [tyrosyl transfer-RNA synthetase/poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase 1/sirtuin 1, TyrRS-PARP1-SIRT1][15]信号通路的激活可诱导PC12细胞自噬, 减轻神经毒性。
基于天然产物发现改善学习记忆障碍的药物是当前研究的热点。传统中药黄芩最早收录于《神农本草经》, 药用价值高, 历史悠久[16]。黄芩素(baicalein) 是从中药黄芩中提取出来的黄酮类化合物, 具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和清除自由基等作用[17]。研究发现, 在Aβ1-40[18, 19]和Aβ25-35[20]诱导的AD大鼠模型中, 黄芩素均能显著改善AD大鼠的遗忘和记忆障碍; 在Aβ25-35损伤的PC12细胞中, 黄芩素能够抑制氧化应激从而降低Aβ毒性反应[21], 表明黄芩素具有改善认知功能和学习记忆能力[22]。
课题组前期发现200 mg·kg-1黄芩素能够改善D-半乳糖致衰老模型大鼠[23]和快速老化小鼠SAMP8的学习记忆障碍[24]。通过对SAMP8小鼠的大脑皮层进行转录组学研究, 结果表明黄芩素可能通过抑制JAK2/STAT1信号通路发挥神经保护作用[25]。JAK/STATs信号通路[26]是众多细胞因子信号转导的共同途径, 广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程, 研究表明[27]JAK/STATs信号通路激活会导致多种炎症反应。
PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系, 在结构、功能上与神经元有很多相似之处, 与神经元相比又相对容易培养。因此在本研究中, 以PC12细胞为研究对象, 以Aβ25-35损伤PC12细胞构建AD体外模型, 验证黄芩素的保护作用及对JAK2/STAT1信号通路的调节作用。
材料细胞株 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞) 购自中国科学院细胞研究所(上海)。
药物与试剂 黄芩素(批号JZ20150711, 质量分数 > 98%) 购自南京景竹生物科技有限公司; Aβ25-35购自北京Solarbio公司; 高糖DMEM培养基、胰酶、胎牛血清、IL-8检测试剂盒、TNF-α检测试剂盒、细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL显影液、HRP羊抗兔二抗(货号: D110058) 购自上海生工生物工程有限公司; 二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT) 购自Sigma公司; 抗体β-actin (货号: 20536-1-AP)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) (货号: 18985-1-AP)、环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) (货号: 12375-1-AP)、JAK2 (货号: 17670-1-AP)、STAT1 (货号: 10144-2-AP) 购自Proteintech公司; 抗体p-JAK2 (货号: 3776)、p-STAT1 (货号: 7649)、caspase-3 (货号: 9665)、cleaved caspase-3 (货号: 9664) 购自Cell Signaling Technology公司。
仪器 HF safe1800生物安全柜、HF 90 CO2培养箱、Neofuge 1600R台式高速离心机(Heal Force公司, 中国); Nikon Eclipse Ti-S荧光倒置显微镜(Nikon公司, 日本); M200多功能酶标仪(Tecan公司, 瑞士); 高速冷冻离心机(力新仪器上海有限公司, 中国); Mini-PROTEAN Tetra电泳仪、Mini-Trans-Bolt Cell半干转印槽、光成像系统ChemiDocTM XRS+ (Bio-Rad公司)。
PC12细胞的培养 将PC12细胞接种于25 cm2培养瓶, 置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养, 培养基为含10%胎牛血清的DMEM。每2~3天传代1次, 待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。
分组与给药 将实验分为空白组、Aβ25-35组(20 μmol·L-1) 和黄芩素(40、60、80 μmol·L-1) 组, 部分实验选取黄芩素最佳剂量80 μmol·L-1展开。正常组更换DMEM无血清培养液, Aβ25-35组中加入含20 μmol·L-1 Aβ25-35的DMEM无血清培养液, 造模24 h; 黄芩素给药组先用不同浓度黄芩素预处理2 h, 再加入终浓度为20 μmol·L-1 Aβ25-35培养24 h, 每组设置3个复孔。
细胞形态学观察 以每毫升1×105个的浓度将细胞接种于6孔板中, 待细胞生长至对数生长期时, 按“分组与给药”的步骤处理细胞后, 在倒置显微镜下观察细胞形态并进行拍照。
细胞凋亡检测 将PC12细胞接种于6孔板中, 于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h, 按“分组与给药”的步骤分组给药, 继续培养24 h。按照Hoechst染色试剂盒说明书进行染色, 每孔加入Hoechst 33342染色液500 μL, 室温避光染色5 min, PBS洗2次, 于倒置荧光显微镜下观察细胞核, 亮蓝色荧光即为凋亡细胞。
炎症因子检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定黄芩素对IL-8含量的影响。收集培养上清液, 按试剂盒说明书操作, 用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光值, 根据标准曲线得出相应IL-8含量, 每组设置3个复孔, 计算平均值。
Western blotting实验 按照上述分组分别作用PC12细胞24 h, 收集细胞, 并用PBS溶液清洗2~3次, 加入裂解液(含有1% PMSF和10% 10×磷酸酶抑制剂复合物), 冰上裂解30 min后, 14 000 r·min-1、4 ℃离心15 min, 上清液即为蛋白质提取物。BCA法测定蛋白含量, 100 ℃蛋白变性10 min。蛋白上样量为50 μg, 采用8% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白, 转膜, 5%脱脂奶粉/5% BSA室温摇床封闭2 h, 加入一抗β-actin (1∶1 000)、caspase-3 (1∶800)、JAK2 (1∶600)、STAT1 (1∶800)、p-STAT1 (1∶1 000)、p-JAK2 (1∶1 000)、iNOS (1∶500)、COX-2 (1∶1 000), 4 ℃摇床孵育过夜, TBST洗膜3次, 每次10 min, 室温摇床孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000), TBST洗膜3次, 每次10 min, 漂洗并滴加显影液后, 再使用ChemiDocTM XRS+凝胶成像仪对目的条带逐一进行扫描, 使用Quantity One软件对结果进行统计分析。
统计学分析 实验数据以x ± s表示, 采用GraphPad Prism 6.0对实验数据进行统计学分析, 组间比较采用单因素方差分析结合Dunnett's检验, P < 0.05认为有统计学意义。
结果 1 黄芩素对Aβ25-35诱导PC12细胞存活的影响课题组前期研究[28]结果表明, Aβ25-35能显著性降低PC12细胞存活, 其中20 μmol·L-1 Aβ25-35与PC12细胞孵育24 h后, 细胞存活率显著下降至空白组的57.57%; 用不同浓度黄芩素预处理后均能提高细胞存活, 其中80 μmol·L-1黄芩素使PC12细胞存活显著提高了20.75%。在此基础上, 观察黄芩素对Aβ25-35损伤PC12细胞形态的影响。结果表明, 与空白组相比, Aβ25-35组(20 μmol·L-1) 细胞数量减少, 且细胞皱缩、变圆, 部分细胞悬浮于培养液中; 而80 μmol·L-1黄芩素作用24 h后, 能明显增加细胞数量并改善细胞形态, 使其接近于空白组细胞形态(图 1)。
Hoechst 33342染色结果显示, 空白组细胞核呈现弥散均匀微弱的蓝色荧光, 表明其凋亡细胞少。Aβ25-35组较多细胞呈现出较强的蓝白色荧光, 细胞核变小, 呈现不规则形状, 有些细胞内可见较强的颗粒状荧光, 表明细胞凋亡数量明显增多, 而给予黄芩素(80 μmol·L-1) 后, 可见荧光减弱, 表明黄芩素能够抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡(图 2A)。与空白组比较, Aβ25-35使caspase-3和cleaved caspase-3水平显著增加; 而给予黄芩素能显著降低caspase-3和cleaved caspase-3水平, 说明黄芩素能够抑制caspase-3介导的PC12细胞凋亡(图 2B、C)。
为了考察黄芩素对Aβ25-35诱导的PC12细胞炎症因子的抑制作用, 选取促炎因子IL-8和TNF-α作为检测指标。结果显示, 20 μmol·L-1 Aβ25-35可显著增加IL-8和TNF-α的释放, 而黄芩素能显著抑制Aβ25-35诱导的IL-8和TNF-α的释放(图 3)。
为了考察黄芩素对Aβ25-35诱导PC12细胞JAK2/STAT1通路的作用, 进行了Western blotting检测。结果显示, Aβ25-35刺激PC12细胞24 h后, JAK2、STAT1的磷酸化显著增加, 而黄芩素(80 μmol·L-1) 能显著抑制JAK2和STAT1的磷酸化(图 4), 表明黄芩素可以显著抑制JAK2/STAT1信号通路的活化。
为了验证黄芩素是否可以抑制JAK/STAT通路相关炎症蛋白的表达, 采用Western blotting检测黄芩素对iNOS (图 5A) 和COX-2蛋白表达的影响(图 5B)。结果显示, Aβ25-35能显著增加iNOS和COX-2蛋白表达, 而黄芩素(80 μmol·L-1) 可显著抑制iNOS和COX-2蛋白表达。
细胞凋亡[29]是由基因控制的程序性细胞死亡, 受Bcl-2家族、caspase家族、癌基因和抑癌基因等基因调控。其中, caspases介导的细胞凋亡是主要的凋亡途径[30]。研究表明[31], AD与神经元细胞凋亡密切相关, 而阻断细胞凋亡的药物可在早期预防神经元细胞死亡[32]。本研究发现, Aβ25-35处理组caspase-3和cleaved caspase-3的水平升高, 而给予黄芩素(80 μmol·L-1) 后可抑制caspase-3和cleaved caspase-3的水平, 结合Hoechst染色结果, 表明黄芩素可抑制caspase-3介导的细胞凋亡。
AD与炎症反应密切相关[33]。Aβ沉积可诱发炎症反应; 而非甾体类抗炎药可以降低AD风险[34-36]。通过对AD患者尸检的研究结果发现, 炎症与AD病理相关[37, 38], 而且在AD小鼠大脑皮层中发现处于活化状态的炎症因子[39]。促炎细胞因子[40] (如IL-8) 在神经系统的生长发育、分化调节中具有重要作用, 参与一系列生理功能的调节。因此, 抑制炎症可能是治疗许多慢性神经退行性疾病的关键[41]。本研究发现, 黄芩素给药后可显著降低炎症因子IL-8和TNF-α释放以及炎症蛋白iNOS和COX-2的表达, 表明黄芩素抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞炎症。
JAK/STATs信号通路由酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT级联组成, 该通路不仅参与炎症反应, 同时也与细胞损伤、凋亡和氧化应激有关[42, 43]。JAK/STATs信号转导失调是各种实体癌和造血系统恶性肿瘤发病的驱动力[44], 也与自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、牛皮癣和炎症性肠病)[45]和过敏性疾病(哮喘和过敏性鼻炎)[46]的发生有关。Nevado-Holgado等[47]使用啮齿动物模型和体外模型证明了JAK/STATs信号通路异常是AD的病因之一。研究表明[48], JAK/STATs信号通路的激活会引起IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症因子释放, 并激活下游靶蛋白iNOS和COX-2, 使促炎因子释放增多, 导致炎症反应发生[49]。本研究发现, 黄芩素给药后可显著抑制JAK2和STAT1的磷酸化, 表明黄芩素可通过JAK2/STAT1通路抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞炎症。
综上所述, 本研究结果表明, 黄芩素可以有效地抑制Aβ25-35诱导PC12细胞中JAK2/STAT1信号活化, 从而抑制炎症因子IL-8释放和炎性靶蛋白iNOS和COX-2的表达, 最终阻断炎症的级联反应。
作者贡献: 郑文鸽和周峰负责进行实验和数据分析, 完成文章撰写; 高丽和秦雪梅负责指导实验思路; 所有作者均对本文有所贡献。
利益冲突: 无利益冲突。
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