2. 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室, 四川 成都 610041
2. State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
去乙酰化酶(sirtuins)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的蛋白脱乙酰基酶, 从酵母到哺乳动物细胞都高度保守。由于它们在细胞中分布位置及构成的差异, 使其具有了不同酶的活性, 在生物体内发挥不同的功能。SIRT1主要定位于细胞核, 也有少部分特殊类型的细胞定位于细胞质, 参与胰腺、肝脏、睾丸、卵巢、肌肉和脂肪组织的代谢调控。SIRT2位于细胞质, SIRT3、SIRT4、SIRT5位于线粒体, SIRT6和SIRT7位于细胞核, 分别发挥了去乙酰化活性、去丙二酰基酶活性、去琥珀酰基酶活性、ADP-核糖基转移酶活性等。哺乳动物细胞中的7种去乙酰化酶(SIRT1~SIRT7)在衰老、糖尿病、心血管疾病和癌症方面具有重要的功能意义[1]。SIRT1是哺乳动物沉默信息调节因子2 (SIR2)家族(SIRT11-7)中的一员, 对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)有激活作用[2], 是目前研究最广泛的去乙酰化酶, 它能使各种组蛋白和非组蛋白底物(p53、c-MYC和FOXO)脱乙酰, 从而调节各种生命过程, 比如DNA修复、代谢、细胞周期和生存[3-7]。早期研究认为肿瘤抑制因子p53是第一个非组蛋白SIRT1去乙酰化酶靶点: 在如DNA损伤等压力条件下, p53的去乙酰化减弱其反式激活依赖的凋亡, 从而促进肺癌细胞存活[8, 9]。同样, 在肺癌细胞系中, E2F1也被发现受到SIRT1的负调控[10]。因此, SIRT1被认为是一种致癌蛋白。然而, 最近的研究揭示了SIRT1在干细胞转化中的作用, 包括它在促进DNA的忠实修复和抑制癌基因转化中的作用, 显示SIRT1可以作为某些癌症的抑癌剂靶标[5]。
急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一类由造血细胞发生遗传学改变从而发展为高度异质性的血液系统恶性肿瘤, 是成人急性白血病中最常见的一种类型, 约占成人白血病的70%。AML主要特征是骨髓、血液及其他造血器官中的造血祖细胞/造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSc)恶性增殖失控和分化障碍[11]。AML极易复发, 目前复发难治性AML患者的最佳单一治疗方式是挽救性治疗达到取得完全缓解后进行同种异体干细胞移植(allo-HSCT), 移植后再复发的患者, 目前几乎不可能治愈[12]。研究表明, 白血病细胞起源于一种叫做白血病干细胞(LSCs)的原始造血前体细胞。LSCs是自我更新白血病细胞的一小部分, 在CD34+ CD38-亚群中富集, 在常规治疗后持续存在, 被认为是白血病复发的来源[13, 14]。研究表明AML骨髓中的CD34+CD38-细胞中的SIRT1蛋白水平较正常对照组增加[13]。大样本分析显示, AML患者单核细胞中SIRT1表达与正常对照组相比, 存在持续过度表达的情况[15]。SIRT1能够促进PI3K/beclin1并介导应激诱导的ESCs自噬。这些研究揭示了SIRT1在增强自噬, 最终导致细胞凋亡抵抗中的重要作用[16, 17]。用药物抑制SIRT1可以提高p53乙酰化水平, 导致p53靶基因表达增加, 细胞生长受到抑制, 并增强对酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性[18]。目前对SIRT1在肿瘤干细胞中的作用研究非常广泛[19], 这些结果表明SIRT1在AML干细胞中重要作用, 并提示抑制SIRT1可能是精确靶向AML干细胞的一种潜在治疗策略。寻找和发现结构多样性的新型SIRT1抑制剂先导化合物是开发治疗AML药物的重要工作。
虽然已有不少SIRT1抑制剂分子的报道, 从文献报道的已有的SIRT1抑制剂结构来看, 分子结构类型多样(图 1)。三环类、寡肽、环肽、苯并呋喃、吲哚等多种分子结构片段都出现在SIRT1抑制剂中, 大部分抑制剂为人工合成分子, 天然产物结构较少。目前已报道的SIRT1抑制剂分子均处于较为初级的临床前研究, 还未有进入临床研究的候选药物。不断寻找和发现结构新颖和具有良好成药性的SIRT1抑制剂是开发SIRT1靶向药物的基础, 其中, 利用天然产物分子结构多样性的特点, 从中寻找和发现新型SIRT1抑制剂先导化合物不失为一种良好的策略。
本文利用基于分子对接技术与广义波恩表面积(MM-GBSA)模型计算结合自由能的手段, 开展SIRT1抑制剂的虚拟筛选, 从约30万个天然产物分子中筛选出8个潜在的抑制剂分子。同时利用已有的SIRT1抑制剂分子建立定量构效关系(QSAR)模型, 并利用QSAR模型预测了虚拟筛选获得的潜在抑制剂分子的IC50值, 最后, 利用分子动力学模拟手段, 验证了所获得的具有潜在活性的SIRT1抑制剂与靶蛋白结合物的稳定性, 为开发针对SIRT1的治疗急性髓性白血病的新型靶向小分子药物提供了潜在的先导化合物, 为进一步的药物开发提供了理论依据。
结果与讨论 1 分子对接与方法学验证结果通过将SIRT1复合物中的抑制剂分子4I5按照分子对接流程, 再次对接到SIRT1蛋白活性位点, 并与晶体结构叠合比较, 计算RMSD, 结果表明, 其重原子RMSD=0.11, 对接分子与晶体结构几乎完全重合(图 2), 证明了对接方法的可靠性。
通过访问网站、数据库, 收集整理了天然产物及衍生物分子298 029个, 经过“里宾斯基五规则”过滤, 得到231 511个天然类药分子。这些分子经过分子对接和MM-GBSA计算结合自由能, 共获得8个分子结合自由能超过阳性分子4I5 (ΔG=-74.62 kJ·mol-1), 即潜在活性分子(表 1和图 3)。其与SIRT1蛋白的典型结合模式见图 4。
以文献中收集到的122个SIRT1抑制剂分子随机分成108个分子的训练集和24个分子的测试集。利用108个分子建立的QSAR模型, TOP10的10个模型, 均是核偏最小二乘法(KPLS)回归的模型, 以其中得分在0.8以上的有5个模型, R2在0.797 6~0.883 4之间, Q2在0.794 2~0.815 1之间(表 2)。其中以2D分子指纹的KPLS回归算法的模型kpls_molprint2D_17表现最佳(图 5), 因此, 最终选择该模型作为后续的QSAR预测模型。对24个测试集分子的预测结果显示, 所有测试集分子的预测p IC50与实验值偏差均较小, 表明预测结果较为准确(表 3)。利用上述QSAR模型预测分子对接虚拟筛选所获得hits分子的IC50值如表 1所示。
虚拟筛选获得的Hits分子中的top5分子的对接复合物的100 ns分子动力学模拟结果显示, 在整个动力学模拟过程中, 化合物分子重原子的RMSD均在1 Å内波动(图 4F), 说明潜在抑制剂分子与SIRT1形成稳定的分子间作用, 且这些潜在活性分子与SIRT1蛋白复合物构象稳定, 处于较低的能量状态, 进一步证明了对接结果的可靠性。
5 AML细胞抑制活性测试结果MTT实验结果显示, 8个hits化合物对MV4-11、OCI-AML2和OCI-AML3三种AML白血病细胞具有不同程度的抑制作用(表 4), 其IC50为2.29~83.21μmol·L-1, 其中ZINC000004836915化合物对OCI-AML2的活性最好, IC50达到了2.29±0.09μmol·L-1。
SIRT1活性比色法定量检测结果显示, 1μmol·L-1浓度时, 不同化合物作用下SIRT1的活性受到不同程度的抑制作用(图 6), 其中化合物ZINC000001774455抑制作用最强, 其酶抑制率达到了65.33%, mangochinine、11-hydroxygelsenicine和opacaline A 3个化合物也有较好抑制作用, 其抑制率分别为52.45%、42.40%和39.65%。优于天然阳性对照药物nicotinamide。而ZINC000000643416和ZINC000035388763两个化合物对SIRT1的抑制较为微弱, 抑制率仅为9.56%和4.12%。
急性髓性白血病(AML)是一种容易复发和难治性白血病, 尚缺乏有效的治疗药物, 最近的研究表明, 抑制SIRT1能够抑制AML的干细胞, 从而抑制AML的复发, 是一种有前景的治疗策略。目前SIRT1抑制剂尚未有上市药物, 寻找结构新颖多样的SIRT1抑制剂先导化合物对开发靶向SIRT1的AML治疗药物具有重要的价值。
计算机辅助药物设计技术是快速经济发现药物先导化合物的重要手段, 通过虚拟筛选, 实现从数十万乃至数十亿的化合物中快速海选可能药物先导化合物, 避免传统药物筛选“盲筛”的盲目性导致的人力物力资源的浪费。本文利用分子对接, MM-GBSA法计算结合自由能, 定量构效关系(QSAR)预测等手段, 从231 511个小分子药分子库中筛选出8个潜在的SIRT1抑制剂分子, 并经过分子动力学模拟验证了这些分子与蛋白的结合模式与结合稳定性, 细胞活性测试结果表明这些化合物具有不同程度的抑制白血病细胞增殖的作用, 酶活性测定结果显示, 其中mangochinine、11-hydroxygelsenicine、ZINC000001774455、opacaline A、normacusine B等5个化合物是SIRT1的抑制剂, 1μmol·L-1浓度下, 对SIRT1酶活性抑制率在28.30%~65.33%之间, 其中活性最强的化合物ZINC000001774455在1μmol·L-1浓度下对SIRT1酶活性抑制率达到了65.33%, 对急性髓性白血病(AML)细胞株OCI-AML2、OCI-AML3、MV4-11的IC50值分别为2.29±0.09μmol·L-1、2.86±0.11μmol·L-1和4.56±0.22μmol·L-1。ZINC000001774455是一个由吲哚环和苯并呋喃环中间通过包含取代酰胺结构的连接链连接的结构, 其与SIRT1蛋白的结合模式与共结晶报道的抑制剂分子有所不同, 其分子除吲哚环部分与疏水区的PHE 273、PHE 297氨基酸形成π-π作用外, 位于口袋另一端的苯并呋喃环与ARG 282也形成了π-π作用, 分子中部亲水部分的酯羰基氧原子与ILE 347和ASP 348形成了双重氢键作用, 吲哚环上的亚胺在离子化状态下质子H与GLN 345残基形成氢键作用, 加强了抑制剂分子与SIRT1的相互作用。目前尚未见文献对该化合物抑制SIRT1活性的报道。因此, 可作为新型SIRT1抑制剂开发的先导化合物。
利用分子对接进行虚拟筛选, 对候选分子打分排序是虚拟筛选的难点, 基于广义波恩表面积(MM-GBSA)模型计算小分子与蛋白的结合自由能代替分子对接的打分函数具有更好的活性分子识别效果, 使分子对接尽可能体现药物分子与靶蛋白结合的能量变化。定量构效关系QSAR模型, 虽然有泛化性差的缺点, 但对于分布于训练集分子附近化学空间的潜在药物分子, 还是具有较好的识别作用, 在药物研发中利用构效关系预测活性也具有一定的参考价值。分子动力学可以模拟药物分子与蛋白复合物在生理环境下的分子构象变化和分子运动情况, 从而了解药物分子与靶蛋白结合的结合模式和稳定性。可作为在没有共结晶数据的情况下的药物分子与靶蛋白作用的评估。综合利用分子对接、定量构效关系QSAR、药效团、分子动力学模拟, 以及机器学习、深度学习等人工智能方法将是未来药物研发的趋势, 这些手段的发展将极大的提高新药研发的效率和成功率。
实验部分 1 天然产物库的收集和预处理从Chemdiv、Chembridge、Enamine、Specs、ZINC等小分子化合物库收集天然产物分子, 利用Discovery studio软件包, 进行小分子预处理, 包括加氢, 去盐、调节电荷, 修正不良价态原子, 生成互变异构体和立体异构体, 加载CHARMm分子力场, 能量最小化得到3D构象。随后剔除不满足里宾斯基五规则的成药性差的分子, 即: 化合物的分子质量小于500道尔顿; 化合物结构中的氢键给体(包括羟基、氨基等)的数量不超过5个; 化合物中氢键受体的数量不超过10个; 化合物的脂水分配系数的对数值(logP)在-2到5之间化合物中可旋转键的数量不超过10个。
2 训练集与测试集分子的准备从文献中收集有SIRT1抑制活性且有IC50值, 相对分子质量 < 500化合物分子122个, 进行小分子预处理, 包括加氢, 去盐、调节电荷, 修正不良价态原子, 生成互变异构体和立体异构体, 加载CHARMm分子力场, 能量最小化得到3D构象, 然后按照80%作为训练集, 20%作为测试集的原则, 随机分成两组。
3 受体蛋白的准备与预处理PDB蛋白晶体数据库(https://www.rcsb.org/)下载SIRT1蛋白的抑制剂共结晶结构(PDB ID: 4I5I), 然后利用Discover studio软件包的Prepare Protein模块对晶体结构进行预处理, 包括加氢, 补全缺失氨基酸支链和缺失的loop, 去除金属离子, 水分子及其他结晶剂分子, 生成二硫键, 生成pH 7.0±2.0的氨基酸电荷价态, 对重原子在RMSD 0.3 Å范围内利用CHARMm分子力场优化构象。
4 分子对接在经过预处理的SIRT1蛋白的抑制剂共结晶结构(PDB ID: 4I5I)的配体质心处定义一个直径20 Å的球体, 作为进行分子对接的位点, 同时删除原来的小分子配体, 采用受体蛋白基本刚性、配体柔性的分子对接策略进行分子对接, 每个分子保留10个最佳对接点, 聚类半径0.1 Å; 每个分子的初始随机构象数为10, 随机启动构象的高温MD的步骤数为1 000, 高温MD中随机启动构象的目标温度为1 000 K。随机构象包含电荷相互作用, 并利用模拟退火进行构象优化, 其参数为: 加热步数2 000步, 目标温度700 K, 退火步数2 000步, 退火温度300 K。对接过程使用CHARMm力场, 采用Momany-Rone法处理配体原子部分电荷。
5 分子对接的方法验证将上述经过预处理的SIRT1蛋白与抑制剂共结晶中的抑制剂分子, 使用Chemdraw软件构建结构, 保存为SDF格式, 再利用Discovery studio软件对该分子进行括加氢、去盐、调节电荷, 修正不良价态原子, 生成互变异构体和立体异构体, 加载CHARMm分子力场, 能量最小化得到3D构象的预处理。上述生成的配体分子按照分子对接的方法重新对接到受体蛋白中, 并与原晶体结构中的对应配体进行叠合, 计算重原子的RMSD, 以考察分子对接方法的准确性。
6 MM-GBSA计算结合自由能利用分子对接生成的不同构象的配体-蛋白复合物, 基于分子力学的广义波恩表面积(MM-GBSA)模型计算小分子与蛋白的结合自由能。
7 基于分子对接的虚拟筛选将经过预处理的约30万天然产物分子及原共晶中的配体分子依次进行与SIRT1蛋白的分子对接, 随后进行MM-GBSA计算结合自由能, 以结合自由能(ΔG)超过原配体的化合物为潜在活性分子, 并按照结合自由能大小进行升序排列。
8 QSAR模型的建立, 验证与预测将上述收集的SIRT1抑制剂分子构建的训练集和测试集分子利用Schrodinger软件包的Auto QSAR模块, 进行定量构效关系建模, 变量采用由系统生成的二进制的各种分子指纹以及各种分子描述符, 因变量采用p IC50值, 采用训练集5倍交叉验证, 尝试核偏最小二乘法(KPLS)、多元线性回归(MLR)等算法, 寻找最优的QSAR模型, 并保留最优的10个QSAR模型。将最优化的QSAR模型用于分子对接虚拟筛选所得的潜在SIRT1抑制剂分子的IC50预测。
9 分子动力学模拟将Top5的潜在抑制剂分子的对接复合物分别进行100 ns的分子动力学模拟, 考察抑制剂分子与SIRT1蛋白结合的稳定性。模拟过程通过Desmond软件实施, 流程如下: 第一步, 在配体-蛋白复合物周围建立边长为10 Å的TIP3P周期性显性水模型的立方体水盒子, 并添加Cl-作为抗衡离子, 平衡体系电荷, 并添加0.15 mol·L-1浓度的Na Cl, 模拟生理环境, 加载分子力场OPLS3, 建立模拟体系。第二步, 体系能量最小化, 采用0.1 kcal·mol-1·Å2的力常数固定配体-蛋白复合物, 截值法处理短程静电作用, 截值半径9 Å, 利用最陡下降法能量最小化, 步长2 fs, 直至达到梯度阈值25 kcal·mol-1·Å, 随后切换LBFGS法, 继续能量最小化直至收敛。第三步, 体系升温, 利用2.0 kcal·mol-1·Å2的力常数固定复合物, 将体系从0 K缓慢升温至300 K。第四步, 平衡体系, 依次用2.0 kcal·mol-1·Å2、1.0 kcal·mol-1·Å2、0.5 kcal·mol-1·Å2、0.2 kcal·mol-1·Å2、0.1 kcal·mol-1·Å2的力常数限制复合物, 放开小分子配体, 依次做1 ns的动力学模拟。第五步, 全体系不限制进行100 ns的分子动力学模拟。
10 肿瘤细胞抑制活性测试三种急性髓性白血病细胞MV4-11、OCI-AML2和OCI-AML3细胞用含10%胎牛血清(FBS)的Iscove's改良的Dulbecco (IMDM)培养液培养。所有媒介含有100 U·mL-1青霉素和100μg·dL-1链霉素。将细胞在37℃、5%CO2的潮湿环境中孵育。对数生长期细胞将接种到96孔培养板中, 密度为(每孔10 000~15 000个细胞。24 h后, 用0.02、0.2、2、20、100、200μmol·L-1浓度的化合物处理细胞72 h, 终体积为200μL。终点时, 向每个孔和细胞中加入20μL 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基四氮唑溴化物(5 mg·mL-1)再孵育1~3 h。经过20%十二烷基硫酸钠(SDS)的过夜处理后, 用酶标仪(Molecular Devices, Sunnyvale)测定570 nm的吸光度值, 未经药物处理的样品做对照, 计算IC50值。
11 酶活性测试将待测化合物与阳性对照药物Nicotinamide精密称定后分别先用DMSO, 随后用缓冲液稀释至DMSO含量1%的贮备液, 在96孔板上依次加入10μL的SIRT1蛋白缓冲液, 按照SIRT1活性比色法定量检测试剂盒的说明操作, 依次加入缓冲液、底物缓冲液、补充液稀释, 使最终化合物浓度为1μmol·L-1, 按照试剂盒的方法测定待测化合物作用下SIRT1的酶活性, 并计算化合物对SIRT1酶活抑制率。
致谢: 感谢四川大学华西药学院提供Schrodinger软件及技术支持。
作者贡献: 该论文是在所有作者共同参与贡献下完成, 该论文的最后版本通过了所有作者认可。
利益冲突: 本文所有作者申明, 不存在利益冲突关系。
[1] |
Chalkiadaki A, Guarente L. The multifaceted functions of sirtuins in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2015, 15: 608-624. DOI:10.1038/nrc3985 |
[2] |
Voelter-Mahlknecht S, Mahlknecht U. Cloning, chromosomalcharacterization and mapping of the NAD-dependent histonedeacetylases gene sirtuin 1[J]. Int J Mol Med, 2006, 17: 59-67. |
[3] |
Brooks CL, Gu W. How does SIRT1 affect metabolism, senescence and cancer?[J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9: 123-128. DOI:10.1038/nrc2562 |
[4] |
Herranz D, Serrano M. SIRT1: recent lessons from mouse models[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10: 819-823. DOI:10.1038/nrc2962 |
[5] |
Chalkiadaki A, Guarente L. The multifaceted functions of sirtuins in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2015, 15: 608-624. DOI:10.1038/nrc3985 |
[6] |
Chen YR, Lai YL, Lin SD, et al. SIRT1 interacts with metabolic transcriptional factors in the pancreas of insulin-resistant and calorie-restricted rats[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40: 3373-3380. DOI:10.1007/s11033-012-2412-3 |
[7] |
Chang HC, Guarente L. SIRT1 and other sirtuins in metabolism[J]. Trends Endocrin Met, 2014, 25: 138-145. DOI:10.1016/j.tem.2013.12.001 |
[8] |
Luo JY, Nikolaev AY, Imai SI, et al. Negative control of p53 by Sir2α promotes cell survival under stress[J]. Cell, 2001, 107: 137-148. DOI:10.1016/S0092-8674(01)00524-4 |
[9] |
Vaziri H, Dessain SK, Ng Eaton E, et al. hSIR2(SIRT1) functions as an NAD-dependent p53 deacetylase[J]. Cell, 2001, 107: 149-159. DOI:10.1016/S0092-8674(01)00527-X |
[10] |
Wang CG, Chen LH, Hou XH, et al. Interactions between E2F1 and SirT1 regulate apoptotic response to DNA damage[J]. Nat Cell Biol, 2006, 8: 1025-1031. DOI:10.1038/ncb1468 |
[11] |
Medinger M, Passweg JR. Acute myeloid leukaemia genomics[J]. Br J Haematol, 2017, 179: 530-542. DOI:10.1111/bjh.14823 |
[12] |
O'Donnell MR, Tallman MS, Abboud CN, et al. Acute myeloid leukemia, version 3.2017, NCCN clinical practice guidelines in oncology[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2017, 15: 926-957. DOI:10.6004/jnccn.2017.0116 |
[13] |
Li L, Osdal T, Ho Y, et al. SIRT1 activation by a c-MYC oncogenic network promotes the maintenance and drug resistance of human FLT3-ITD acute myeloid leukemia stem cells[J]. Cell Stem Cell, 2014, 15: 431-446. DOI:10.1016/j.stem.2014.08.001 |
[14] |
Ng SW, Mitchell A, Kennedy JA, et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia[J]. Nature, 2016, 540: 433-437. DOI:10.1038/nature20598 |
[15] |
Bradbury CA, Khanim FL, Hayden R, et al. Histone deacetylases in acute myeloid leukaemia show a distinctive pattern of expression that changes selectively in response to deacetylase inhibitors[J]. Leukemia, 2005, 19: 1751-1759. DOI:10.1038/sj.leu.2403910 |
[16] |
Ou X, Lee MR, Huang XX, et al. SIRT1 positively regulates autophagy and mitochondria function in embryonic stem cells under oxidative stress[J]. Stem Cells, 2014, 32: 1183-1194. DOI:10.1002/stem.1641 |
[17] |
Tian WL, Guo R, Wang F, et al. The IRF9-SIRT1-P53 axis is involved in the growth of human acute myeloid leukemia[J]. Exp Cell Res, 2018, 365: 185-193. DOI:10.1016/j.yexcr.2018.02.036 |
[18] |
Houtkooper RH, Pirinen E, Auwerx J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13: 225-238. |
[19] |
Qiang MJ, Hu Y, Zhu H, et al. Sirtuins in malignant progression of tumor[J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2018, 53: 1259-1270. |