近年来, 治疗性重组蛋白药物快速发展, 大多数由哺乳动物细胞表达生产, 其中中华仓鼠卵巢(Chinese hamaster overy, CHO)细胞因其广泛被证实的安全性、易于获得高产率细胞株以及和人类蛋白相似的糖基化修饰等优点, 已经成为工业化生产治疗性重组蛋白药物最主要的细胞系。

生产细胞系的构建通常将目的基因克隆到带有筛选标记的载体上, 转染宿主细胞后筛选得到目的基因整合到宿主基因组上的克隆, 以满足高产率、质量符合预期且保持长期稳定生产等要求。由于外源基因整合位点的随机性, 以及多个整合位点表达活性的差异等, 需要开展大规模的克隆筛选。目前短时间内快速获得高表达稳定的单克隆细胞株仍然是工业界最主要的挑战。

细胞工程技术、表达载体优化以及高通量克隆筛选等新技术的应用有助于加快药物研发。本文以CHO细胞为例, 介绍筛选标记在重组蛋白药物生产用哺乳动物细胞系构建中的应用, 设计筛选标记以提高筛选严谨性, 以及细胞基质稳定性和筛选标记安全性的审评思考, 为药物研发提供参考, 同时也为高效建立重组蛋白药物生产用哺乳动物细胞系^{[1, 2]}, 如小鼠骨髓淋巴瘤细胞(NS0和Sp2/0)、人胚肾细胞(human embryonic kidney cell, HEK293)、人成纤维肉瘤细胞系HT-1080和人胚胎视网膜PER.C6细胞等提供借鉴。

1 筛选标记应用的科学基础和技术要求现状

目前可采用多种表达载体、宿主细胞、基因导入方法和筛选标记等进行工程细胞的构建和筛选。将携带有目的基因和筛选标记基因的质粒载体转染CHO细胞, 筛选标记基因通过其编码的蛋白赋予阳性转化子对特定营养缺失条件或抗生素抗性的生长优势, 经药物加压筛选出质粒载体已经整合在染色体上的稳定细胞群。

国际人用药品注册技术协调会(International Council for Harmonization, ICH) Q5D《用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定》中要求“对于重组产品, 细胞系是指克隆自一个祖细胞且含有所需序列的转染细胞”^[3]。《中国药典》2015年版《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》中明确要求, 在细胞克隆过程中, 应选择单个细胞用于扩增, 筛选具有分泌目的蛋白最佳特性的候选克隆, 用于建立细胞种子。

由于外源基因整合位点的随机性和拷贝数差异等, 细胞群在产物表达水平、稳定性和质量等方面均具有不同克隆之间的异质性^[4]。为满足生产和法规要求, 需开展大规模克隆筛选, 以获得高产率的、稳定的和质量符合预期的细胞株。已在多方面开展细胞株开发工艺改进研究, 如使用强启动子/增强子和染色质调节元件以优化质粒载体, 使用荧光活化的细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)和自动克隆挑选设备Clone Pix以实现高通量克隆筛选, 以及通过在活性位点定点整合质粒载体以摆脱基因表达的位置效应等^[5]。可通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)对细胞库进行鉴定, 通过对细胞核型和目的基因整合位点的检测判断细胞库的单克隆性。筛选标记是质粒载体中的关键元件, 在生产细胞系的构建和筛选中发挥重要作用, 通过设计筛选标记提高筛选严谨性, 以获得稳定高产细胞株, 也是一种改进细胞株开发工艺的有效手段。

2 常见筛选标记的应用及研究现状 2.1 营养缺失条件筛选标记

常用于生产治疗性重组蛋白药物的筛选标记包括二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS), 这2种酶都是营养缺失条件下细胞代谢和生长生产的关键酶。DHFR利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)将二氢叶酸还原为四氢叶酸, 后者是核酸代谢的关键原料。采用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷缺失的培养基和DHFR活性抑制剂甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)进行筛选, 只有DHFR基因拷贝数扩增的细胞才能得以存活。目标基因与筛选标记基因位于同一质粒载体上, 二者同步扩增, 多轮逐步提高MTX浓度可实现目标基因拷贝数增加。GS催化谷氨酸和游离分子氨合成谷氨酰胺, 通过谷氨酰胺缺失培养基和氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulphoximine, MSX)进行筛选, 其筛选过程和扩增原理与DHFR类似^[3]。

由于DHFR和GS的合成基因都是内源性CHO基因, 在基因敲除的、改造后的CHO细胞中筛选效率更高, 如GS敲除的CHO K1细胞^[6]和DHFR缺陷的CHO DG44细胞^[7]。更高的基因拷贝数可以提高转录水平进而实现更高产率, 但其缺点包括:细胞株开发周期长^[8], 基因沉默可引起细胞株长时间培养后不稳定表达^[9], 以及基因扩增导致突变几率增加致产物中出现氨基酸序列变异体^[10]。因此, 缩短开发周期、提高目的蛋白产率并降低突变几率成为改进细胞株开发工艺的关键。NS0和Sp2/0细胞系的内源性GS表达水平不足以支持细胞生长, 因此在培养基中去除谷氨酰胺便可以进行筛选^[11]。

2.2 抗生素抗性筛选标记

使用抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)不需要对宿主细胞进行改造^[3], 在含适当浓度抗生素培养基的维持培养过程中, 未发生外源基因整合的细胞将被逐渐清除。常用的抗生素抗性基因包括新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase gene, NEO)、潮霉素抗性基因(hygromycin resistance hyg gene, HYG)、博来霉素抗性基因(zeocin resistant Shble gene, ZEO)、杀稻瘟菌素抗性基因(blasticidin resistant bsd gene, BLA)和嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(puromycin N-acetyl-transferase, PURO)基因等, 通过抑制蛋白合成或切割DNA发挥作用^[12]。不同的抗生素抗性基因用于筛选高表达株的效率不同:和其他抗生素相比, 杀稻瘟菌素和嘌呤霉素作用更快, 可在低浓度下快速杀死无抗性基因的细胞; 在一项比较NEO、HYG、PURO和ZEO等抗性基因的研究中, ZEO在分离高表达株表现更好, 其细胞株的稳定性也优于其他抗性基因^[13]。

使用抗生素抗性基因可以快速鉴别阳性转化子, 无需基因扩增而缩短细胞株开发周期。然而, 由于转化细胞仅需要低水平的抗生素抗性蛋白即可存活, 这意味着建立的稳转细胞群中主要是低表达株。由于无法通过基因扩增提高表达水平, 提高筛选严谨性优化抗生素抗性基因表达就成为获得高表达株的关键因素。

2.3 筛选严谨性研究

提高筛选严谨性可通过减弱筛选标记蛋白的表达水平或表达效率, 只允许那些质粒载体整合在基因组活性位点和/或高基因拷贝数的克隆存活。目标基因和筛选基因的共表达可采用多个启动子, 由各自的启动子在独立的转录单元中驱动表达。可使用弱启动子减少转录、加入序列使mRNA或蛋白去稳定、不进行密码子优化以及非传统AUG起始密码子^[14]以降低翻译效率、突变氨基酸降低酶活性等手段减少筛选标记的表达。

研究表明使用含有弱化的SV40E启动子的表达载体和GS敲除的CHO K1 SV细胞可显著提高筛选严谨性并降低GS表达水平, 获得高产率细胞株^[15]。通过添加富含AU元件以及鼠鸟氨酸脱羧酶PEST区(protein regions of enriched amino acids proline, glutamic acid or aspartic acid, serine and threonine)分别促进mRNA和蛋白降解, 使DHFR筛选标记不稳定以提高筛选严谨性, 从而提高了CHO-DG44细胞中重组人干扰素γ (interferon-gamma, IFNγ)的产率^[16]。通过PEST与DHFR串联促进DHFR降解, 突变核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)以阻碍翻译起始以及对DHFR筛选标记基因不进行密码子优化, 降低了DHFR蛋白表达以提高筛选严谨性, 并在3个月内完成两步MTX (50 nmol·L^-1)筛选, 目的蛋白产率与300 nmol·L^-1浓度的MTX筛选结果相当^[17]。

另有研究表明, 使用降低活性的GS突变体作为筛选标记, 可显著提高稳转细胞群的抗体产率, 而且和野生GS系统相比, 这些稳转细胞群能够更长时间保持高表达水平, 可减少或无需维持MSX的使用^[18]。使用降低活性的NEO突变体作为筛选标记, 有助于提高基因拷贝数进而获得高表达细胞株, 并且与野生型NEO相比, 降低酶活性的筛选体系获得高产率细胞株的几率更高^[19]。

在一项研究中, 为了增加高表达株的筛选严谨性, 使用野生型和突变型内部IRES探索CHO K1细胞中5种不同抗生素抗性基因和CHO DG44细胞中DHFR的最佳表达水平, 结果表明, 突变弱化的IRES可减少筛选标记表达有助于提高稳转细胞株的产量, 但是过度弱化会导致细胞无法存活或降低目标产物表达量^[20]。因此, 应该将筛选标记表达优化保持在既能够实现高表达细胞株的筛选严谨性, 又能够保证细胞存活的水平。每一种筛选标记在不同的宿主细胞中有其各自最佳的筛选严谨性水平, 深入研究有助于改进细胞株开发工艺。

基于多启动子的载体设计的主要缺点是目的基因和筛选基因未紧密偶联, 因此载体片段化可能导致那些只表达筛选标记基因而不表达目的基因的细胞能够在药物筛选过程中存活下来^[21]。而使用IRES和2A肽在一个转录子中表达目的基因和筛选标记基因可解决此问题^[3], 还可通过应用弱化的IRES以减少筛选标记表达来提高此类载体的选择严谨性。有研究开发了1个三顺反子载体, 其中包括了2个IRES, 包含1个核心CpG岛元件和半抗原修饰的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, hCMV)启动子以增强表达稳定性。有3个基因轻链(light chain, LC)、重链(heavy chain, HC)和DHFR按顺序分布在整个转录子上并被第1个野生型的IRES和第2个突变的IRES分隔开。由于IRES启动的翻译效率较低, 轻链和重链被野生型IRES分隔开, 实现了LC多肽的超表达, 促进单抗表达并减少聚体产生; 突变的IRES降低了DHFR的表达水平, 增强了选择严谨性^[22]。

3 对筛选标记应用的一般考虑

在所有哺乳动物细胞表达系统中, CHO细胞应用最广泛, 占据了70%的重组蛋白生产, 小鼠骨髓淋巴瘤细胞(NS0和Sp2/0)已获批用于西妥昔单抗(cetuximab)和帕利珠单抗(palivizumab)等抗体的商业化生产, 人胚肾细胞HEK293已获批用于凝血因子Fc融合蛋白商业化生产^[23], HT-1080多用于生产治疗罕见病的重组酶类, 如艾度硫酸酯酶β注射液已在美国、欧盟等获批上市。在其他哺乳动物细胞系的筛选中, 也可考虑通过设计筛选标记以提高选择严谨性的策略。在改进细胞株开发工艺的同时, 还应关注细胞基质稳定性、筛选试剂和筛选标记的去除效果及其安全性风险评估。

在重组蛋白药物开发过程中, 细胞基质稳定性与蛋白产量同等重要。经加压和单克隆筛选获得的候选单克隆细胞株, 在长期传代过程中会呈现不同的稳定性, 若选择的单克隆稳定性欠佳, 当生产工艺或规模发生变更时, 会对产品质量和产量造成影响。因此, 在克隆筛选过程中应对候选克隆的稳定性进行研究, 选择高产、稳定且质量符合预期的单克隆进行后续开发。根据既往审评经验, 部分产品在申请临床阶段细胞库稳定性研究未模拟实际生产工艺开展。例如, 在实际生产中种子扩增加压而生产培养不加压, 如果仅考察加压条件下的稳定性, 则无法证明细胞在实际生产中的稳定性。应模拟实际生产条件, 在加压和/或撤压条件下连续传代, 通过细胞生长状态、产物表达水平、蛋白质量和目的基因序列等几个方面评价细胞的传代稳定性。考察的体外传代限次至少应能覆盖拟申报临床的生产工艺规模, 但原则上, 传代稳定性研究不规范不应阻碍临床进程。

在药品上市注册时, 应基于确定的商业化工艺, 评估培养期间细胞基质的稳定性, 明确体外传代限度。生产细胞的体外传代限度, 应根据试生产规模或全规模生产时生产细胞扩增至建议的细胞体外传代期限或更长期的数据而定^[24]。审评实践中, 部分治疗性蛋白药物在注册生产时, 其传代稳定性研究较为完善。通常考察达到体外细胞龄限度和/或超过体外细胞龄限度细胞库的外源因子安全性和遗传稳定性, 通过Southern杂交分析基因的完整性及整合位点稳定性, 通过Northern杂交和cDNA测序分析转录产物稳定性, 通过实时定量荧光PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)分析整合基因的拷贝数, 并与最少传代数的细胞库(master cell bank, MCB或working cell bank, WCB)比较, 分析遗传稳定性。此外, 研发机构还应关注细胞基质在贮藏条件下的稳定性, 通过临床试验用样品生产积累的细胞活力及细胞生长情况等数据, 可证明复苏细胞在储存过程中的性能。

筛选试剂在生产用细胞株的构建筛选、细胞库建立或生产过程中使用, 作为小分子物质因用量少和常规纯化工艺可去除, 残留风险较低, 但是作为工艺相关杂质, 应关注其去除效果并进行风险评估, 以确保其残留不会影响产品的安全性。例如, 可以根据添加量和最坏情况的每剂最大残留量(将整个生产过程无清除视为最坏情况), 以及毒理学风险评估的可接受日暴露量^[25]来计算杂质安全系数(impurity safe factor, ISF), 如果安全系数较低, 可采用递进式风险评估原则, 进一步根据中间品中筛选试剂残留量或挑战试验计算ISF并进行风险评估^[26]。研发机构可根据积累的平台和产品知识, 合理确定安全系数界值, 依据风险评估结果确定需要进行清除或挑战试验的杂质。在平台和产品知识有限的情况下, 上市申请时鼓励建立特异、灵敏的筛选试剂分析方法, 开展规范全面的方法学验证, 检测商业化工艺性能确认批中间品和原液的残留量, 同时计算安全系数评估安全性风险。

鉴于抗生素使用对人类和环境的危害, 《中国药典》2015年版“凡例”十六要求, 除另有规定外, 不得使用青霉素或其他β-内酰胺类抗生素。生产过程中, 应尽可能避免使用抗生素, 必须使用时, 应选择安全性风险相对较低的抗生素, 且产品的后续工艺应保证可有效去除制品中的抗生素。对于哺乳动物细胞表达系统, 目前已基本不采用青霉素或β-内酰胺类抗生素作为筛选试剂, 通常采用风险较低的博来霉素、杀稻瘟菌素和嘌呤霉素等。在药物开发过程中, 应关注抗生素种类的选择, 以保证产品的安全性。

筛选标记基因及其表达产物的残留, 可能会增加药品免疫原性风险, 因此要严格控制残留DNA和宿主残留蛋白(host cell protein, HCP)。世界卫生组织推荐的非口服生物制品DNA限度为每剂量10 ng, 获得生物技术行业广泛认可^[27]。1997年美国食品药品监督管理局将生物制品可以允许的残余DNA限度定为不超过每剂量100 pg; 对于大剂量的制品(如单克隆抗体), DNA残留量放宽到每剂量10 ng^[28]。《中国药典》 (2015年版三部)对于CHO细胞表达的重组蛋白制品, DNA残留量应不超过每剂量100 pg。一般根据药物临床使用的最大剂量以及积累的多批次检测数据, 拟定残留DNA的质量标准。

目前生物制品行业多以商业化的通用性宿主蛋白酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒来检测产品中的宿主蛋白残留。重组蛋白药物由于表达系统和生产工艺的差异, 不同产品的残留宿主蛋白会存在差异, 若商品化ELISA试剂盒中的多克隆抗体的特异性和适用性不够高, 则会带来漏检HCP的风险, 从而对重组蛋白药物质量带来安全性风险。鼓励在临床试验阶段开发表达系统和生产工艺特异的HCP检测方法, 用于上市产品宿主残留蛋白的质量控制。可采用空细胞系(来自相同的细胞系, 但不含表达目的产品的基因)大量培养, 用相同的下游生产工艺富集HCP^[29]。这种定制的工艺特异性检测方法特异性高, 针对性强, 灵敏度高。可采用荧光差异双向电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)技术高效分离HCP, 再将2D胶上的蛋白转移至膜上进行Western blot检测, 通过2D-DIGE和Western blot结果比较, 评价HCP检测用抗体的特异性和适用性。

4 结语

筛选标记是质粒载体中的关键元件, 在生产细胞系的构建和筛选中发挥重要作用, 通过设计筛选标记提高筛选严谨性, 以获得稳定高产细胞株, 是一种改进细胞株开发工艺的有效手段。研发机构在提高生产用哺乳动物细胞系开发效率的同时, 还应关注细胞基质稳定性、筛选试剂和筛选标记的去除效果及其安全性, 以保证药品质量和患者安全。技术审评将依据现有法规和指导原则, 基于目前科学认知, 对细胞基质稳定性和安全性进行整体评估, 评价产品质量的可控性、临床使用的有效性和安全性。

作者贡献: 本文主要由崔颖撰写, 白玉和程速远修改。

利益冲突: 本文的作者和所涉及的内容不存在潜在的利益冲突。