药学学报  2020, Vol. 55 Issue (12): 2955-2959     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1302   PDF    
紫茎泽兰中一个新的杜松烷型倍半萜
梁旭1, 杨新洲2, 吴超群2, 李余钊2, 袁经权1     
1. 广西中医药大学, 广西 南宁 530200;
2. 中南民族大学药学院, 湖北 武汉 430074
摘要: 采用HP20大孔树脂、硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱等对紫茎泽兰95%乙醇提取物的石油醚部位进行分离纯化,得到了4个杜松烷型倍半萜。根据其理化性质及波谱数据分别鉴定为泽兰酚(1)、(+)-(5R,7S,9R,10S)-2-oxocadinan-3,6(11)-dien-12,7-olide(2)、(1S,4R)-7-hydroxycalamenen-3-one(3)和(-)-(5R,6R,7S,9R,10S)-cadinan-3-ene-6,7-diol(4)。其中化合物1为新化合物,化合物3为首次从该属植物中分离得到。生物活性结果表明,化合物1~4均未表现明显的肿瘤细胞毒作用。
关键词: 紫茎泽兰    化学成分    杜松烷型倍半萜    外来入侵植物    
A new cadinane-type sesquiterpenoid from Eupatorium adenophorum Spreng
LIANG Xu1, YANG Xin-zhou2, Wu Chao-qun2, LI Yu-zhao2, YUAN Jing-quan1     
1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China;
2. School of Pharmaceutical Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China
Abstract: Four cadinane-type sesquiterpenes were obtained from the petroleum ether of 95% ethanol extract of Eupatorium adenophorum Spreng by using an HP-20 macroporous resin column, silica gel, and semi-preparative HPLC. Their structures were determined by physical, chemical and spectroscopic methods and identified as eupatorinol (1), (+)-(5R, 7S, 9R, 10S)-2-oxocadinan-3, 6(11)-dien-12, 7-olide (2), (1S, 4R)-7-hydroxycalamenen-3-one(3) and (-)-(5R, 6R, 7S, 9R, 10S)-cadinan-3-ene-6, 7-diol (4). Among them, compound 1 is a new cadinane-type sesquiterpene, and compound 3 was isolated from this genus for the first time. In bioassay, none of these compounds displayed obvious cytotoxicity.
Key words: Eupatorium adenophorum Spreng    chemical constituent    cadinane-type sesquiterpenoid    alien invasive plant    

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)为菊科(Asteraceae)泽兰属多年生草本植物, 原产美洲的墨西哥至哥斯达黎加一带, 大约于20世纪40年代由中缅边境传入云南省, 经半个多世纪的传播扩散, 现已在云南、贵州、四川、广西、西藏等地广泛分布[1], 给农牧林业带来巨大危害。紫茎泽兰虽然是外来入侵植物, 但很快就被我国劳动人民认识使用, 1975年《云南药用植物名录》最先运用中医理论将紫茎泽兰应用到临床上:性凉, 味苦辛, 具有疏风解表, 调经活血, 解毒消肿功效, 主治风热感冒, 温病初起之发热, 月经不调, 闭经、崩漏, 无名肿毒, 热毒疮疡, 风疹瘙痒[2]。此外, 现代研究发现紫茎泽兰提取液和化学成分具有杀虫、昆虫拒食、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等活性[3-5]。充分消耗和利用外来入侵生物的过剩资源, 变废为宝, 从中开发出新药、兽药、农药、化工原料等成为亟待研究的课题。

紫茎泽兰富含倍半萜类成分。倍半萜是分子骨架由3个异戊二烯单位构成, 含15个碳原子的化合物类群[6], 其结构骨架类型和数目是萜类成分中最多的一类[7], 具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗缺氧、抗疟疾及保护神经细胞等活性[8-12]。其中, 杜松烷(cadinane)型倍半萜属双环倍半萜基本骨架中的一种, 在菊科飞蓬属、泽兰属、旋覆花属、蒿属、橐吾属、一枝黄花属、姜科姜黄属、唇形科薄荷属、杉科柳杉属、柏科柏木属及苔藓植物中等均有分布, 在海藻和软珊瑚中也有发现[8, 13]。为了进一步研究紫茎泽兰中的化学成分, 特别是倍半萜类成分, 从紫茎泽兰中分离到了4个杜松烷型倍半萜(图 1), 分别为泽兰酚(eupatorinol) (1)、(+)-(5R, 7S, 9R, 10S)-2-oxocadinan-3, 6(11)-dien-12, 7-olide (2)、(1S, 4R)-7-hydroxycalamenen-3-one (3)和(-)-(5R, 6R, 7S, 9R, 10S)-cadinan-3-ene-6, 7-diol (4), 其中化合物1为新化合物, 化合物3为首次从该属植物中分离得到。对化合物1~4进行了肿瘤细胞毒活性测试, 4个化合物对人肝癌细胞HepG 2均未表现出明显的细胞毒活性(IC50 > 10 μmol·L-1)。

Figure 1 Structures of compounds 1-4
结果与讨论

化合物1 褐色油状物。[α]D15.8 -36.3 (c 0.07, CH3OH), 紫外光谱(UV)显示在210.0 (1.40) nm处有最大吸收。红外光谱(IR)在3 375 cm-1处存在着OH的伸缩振动, 在1 655 cm-1中的碳氧键伸缩振动提示有羰基存在。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰[M+Na]+ m/z: 271.130 5 (C15H20O3Na, 计算值: 271.130 5), 确定其分子式为C15H20O3, 不饱和度为6。在1H NMR谱(表 1)显示低场区2个芳香氢信号δH 7.17 (1H, s, H-5)、δH 6.63 (1H, s, H-8), 提示其结构内含有1, 2, 4, 5-四取代苯环片段。此外, 高场区还显示2个次甲基氢信号δH 3.22 (1H, m, H-1)、2.10 (1H, m, H-11), 两个亚甲基氢信号δH 2.77 (1H, dd, J = 14.4, 7.9 Hz, H-2)、2.64 (1H, dd, J = 14.4, 8.6 Hz, H-2)及4个甲基氢信号δH 2.17 (3H, s, H-15)、1.45 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-14)、0.94 (3H, d, J = 7.1 Hz, H-12)、0.83 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-13)。13C NMR (表 1)和DEPT谱给出15个碳信号, 包括1个酮羰基碳信号δC 213.3 (C-3), 6个芳香碳信号156.3 (C-7)、138.9 (C-9)、132.5 (C-10)、124.3 (C-6)、130.6 (C-5)、113.2 (C-8), 4个甲基碳信号δC 24.7 (C-14)、17.8 (C-12)、16.3 (C-13)、16.1 (C-15)。从碳谱上进一步推断化合物有一个四取代苯环结构。将该化合物的波谱数据与1, 6-dihydroxy-1-isopropyl-4, 7-dimethyl-3, 4-dihydronaphthalen-2(1H)-one[14]比较, 发现其结构与后者相似, 二者区别在于C-1、C-4位的构型不同, 此推测通过1H-1H COSY、HMBC和NOESY谱也得到验证。

Table 1 NMR spectral data of compound 1 (CD3OD, 600/150 MHz)

通过1H-1H COSY可以看到H-1和H-2有相关, 证明C-1与C-2相连。在HMBC中, H-2与C-3、C-4相关, 得到C-2与C-3相连, C-3与C-4相连; H-5与C-4、C-9相关, 得到C-4和C-10相连; Me-12和C-11、C-13、C-4相关, Me-13和C-11、C-12以及C-4相关, 得到C-12-C-11-C-13的片段, 进一步提示C-11和C-4相连。此外, δH 2.17 (3H, s, H-15)与δC 130.6 (C-5)、124.3 (C-6)、156.3 (C-7)相关, 结合前面得到的结论, 确定Me-15在C-6上; H-8与36.4 (C-1)和132.5 (C-10)有相关, 得到C-1和C-9相连; Me-14和C-2、C-9、C-1相关, 得到C-1和C-2, Me-14和C-1相连。其相对构型通过NOESY确定, Me-14的氢只与H-2 (δH 2.64)相关, H-2 (δH 2.64)又与H-11相关(图 2), 最终确定Me-14与H-11方向相同, 该化合物的平面结构如图 2所示。

Figure 2 Key 1H-1H COSY, HMBC and NOESY correlations of compound 1

为了确定化合物1的绝对构型, 应用Gaussian 09 (B3LYP/TZVP)进行ECD计算[15], 并运用SpecDis[16, 17]软件对实验光谱和计算光谱进行了比较, (1R, 4S)-1的计算ECD曲线与化合物1的实验ECD曲线基本一致, 因此确定化合物1的绝对构型为(1R, 4S)-1 (图 3)。通过以上分析, 最终可确化合物的结构(图 1), 鉴定为(1R, 4S)-1, 6-dihydroxy-1-isopropyl-4, 7-dimethyl-3, 4-dihydronaphthalen-2(1H)-one, 命名为泽兰酚(eupatorinol)。

Figure 3 Experimental ECD spectrum of 1 and calculated ECD spectra of (1S, 4R)-1 and (1R, 4S)-1 (UV correction = -10 nm, band width σ = 0.3 eV)
实验部分

Finnigan MAT-95型质谱仪(德国Finnigan公司); Waters ACQUITY SQD液相质谱仪(美国Waters公司); Nicolet 380傅立叶红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司); ZF-6型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司); Bruker Avance III 600 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司); 中压色谱制备系统(青岛Alga公司); Waters 2535半制备型高效液相色谱仪、Waters 2998 DAD检测器、Waters 2707自动进样器(美国Waters公司); 色谱柱为YMC-Pack ODS-AM半制备柱(5 μm, 250 mm×20 mm, 日本维美希公司); 科思美析C18柱, (5 μm, 250 mm×10 mm, 日本COSMOSIL公司); 薄层色谱硅胶H、柱色谱硅胶(300~400目, 烟台江友硅胶开发有限公司); HP-20离子交换树脂(日本三菱化学公司)。HPLC级乙腈(美国Tedia公司); 常规试剂均为分析纯(天津博迪化工公司)。

实验用紫茎泽兰药材于2016年7月采自广西南宁, 经广西中医药大学药用植物教研室韦松基教授鉴定为菊科植物紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)的全草, 药材标本(No.SC0862)存放于中南民族大学药学院标本馆。

1 提取与分离

紫茎泽兰干燥全草19 kg, 粉碎, 用95%乙醇冷浸提取得到浸膏, 浸膏加入蒸馏水震荡均匀分散后依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取, 萃取后减压浓缩得到相应部位。取石油醚部位170 g经HP-20大孔树脂柱色谱分离得9个组分Fr.1~Fr.9, 然后综合利用正相柱色谱、高效液相色谱等方法进行分离、纯化。

以石油醚-乙酸乙酯(100:1→0:100)做洗脱剂对Fr.4进行硅胶柱色谱分离(300~400目), 经点板合并后得到Fr.4-1~Fr.4-8共8个组分, 其中Fr.4-5经硅胶柱色谱分离(300~400目), 以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂(100:1→1:1)进行梯度洗脱, 点板合并后共得到Fr.4-5-1~Fr.4-5-8共8个组分, 其中Fr.4-5-3组分(约2 g), 经硅胶柱色谱分离(300~400目), 以石油醚-乙酸乙酯(100:1→0:100)为洗脱剂进行梯度洗脱, 点板合并, 共得到Fr.4-5-3-1~Fr.4-5-3-9共9个组分, 其中第5份Fr.4-5-3-5 (0.6 g)经半制备高效液相(YMC-Pack ODS-AM柱, 250 mm×20 mm, 5 μm, 乙腈-水37:63→70:30, 两相都含有0.1%甲酸, 流速为9 mL·min-1)得到化合物1 (5.9 mg)。

Fr.4-3经硅胶柱色谱分离, 以石油醚-乙酸乙酯(100:1→0:100)为洗脱剂进行硅胶柱色谱分离(300~400目), 点板合并, 共得到Fr.4-3-1~Fr.4-3-8共8个组分, 其中Fr.4-3-3 (约1.4 g)经半制备高效液相(YMC-Pack ODS-AM柱, 250 mm×20 mm, 5 μm, 乙腈-水52:48→49:51, 两相都含有0.1%甲酸, 流速为9 mL·min-1)得到Fr.4-3-3-1 (约40 mg), 再次经半制备高效液相(科思美析C18柱, 250 mm×10 mm, 5 μm, 乙腈-水35:65→50:50, 两相都含有0.1 %甲酸, 流速为4 mL·min-1)分离得到化合物2 (7.0 mg)。

以石油醚-乙酸乙酯(100:1→0:100)作洗脱剂对Fr.5进行硅胶柱色谱(300~400目)梯度洗脱, 得到Fr.5-1~Fr.5-10共10个组分, 再次对Fr.5-5 (3 g)以石油醚-乙酸乙酯(100:1→0:100)进行硅胶柱色谱(300~400目)梯度洗脱, 点板合并后共得到Fr.5-5-1~Fr.5-5-10共10个组分, 其中, Fr.5-5-6 (200 mg)经半制备高效液相(科思美析C18柱, 250 mm×10 mm, 5 μm乙腈-水42:58→70:30, 两相都含有0.1%甲酸, 流速为4 mL·min-1)分离, 其中Fr.5-5-6-5和Fr.5-5-6-7分别为化合物3 (8.3 mg)和化合物4 (118.0 mg)。

2 结构鉴定

化合物1 褐色油状物。[α]D15.8 -36.3 (c 0.07, CH3OH)。UVλmax (CH3OH): 210.0 (1.40) nm。IR (KBr): 3 375、2 947、2 835、1 655、1 450、1 113和1 032 cm-1。ECD (CH3OH)/nm: 239 (Δε -13.66)、295 (Δε 11.09); HR-ESI-MS给出其准分子离子峰[M+Na]+m/z: 271.130 5 (C15H20O3Na, 计算值: 271.130 5), 确定其分子式为C15H20O3, 1H NMR (CD3OD, 600 MHz)和13C NMR (CD3OD, 150 MHz)数据见表 1

化合物2 褐色油状物。ESI-MS m/z: 245 [M-H]-, 247 [M+H]+1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 6.25 (1H, m, H-4), 4.71 (1H, dd, J = 5.7, 11.0 Hz, H-7), 4.02 (1H, m, H-5), 2.83 (1H, dd, J = 2.4, 16.4 Hz, H-1), 2.61 (1H, dd, J = 4.7, 16.4 Hz, H-1), 2.39 (1H, ddd, J = 3.2, 5.9, 12.3 Hz, H-8), 1.90 (3H, d, J = 1.7 Hz, H-13), 1.88 (1H, m, H-9), 1.83 (1H, m, H-10), 1.80 (3H, dd, J = 1.4, 2.5 Hz, H-15), 1.04 (1H, m, H-8), 1.00 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-14); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 41.0 (C-1), 197.5 (C-2), 137.4 (C-3), 141.2 (C-4), 38.8 (C-5), 162.0 (C-6), 78.4 (C-7), 41.5 (C-8), 27.7 (C-9), 45.0 (C-10), 121.4 (C-11), 174.3 (C-12), 8.6 (C-13), 19.1 (C-14), 15.8 (C-15)。以上波谱数据与文献报道的化合物[18]对照基本一致, 故鉴定化合物2为(+)-(5R, 7S, 9R, 10S)-2-oxocadinan-3, 6(11)-dien-12, 7-olide。

化合物3 黄褐色油状物。ESI-MS m/z: 231 [M-H]-, 233 [M+H]+1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 6.81 (1H, s, H-5), 6.75 (1H, s, H-8), 3.32 (1H, m, H-1), 2.98 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-4), 2.70 (1H, dd, J = 5.4, 17.7 Hz, H-2), 2.23 (1H, s, H-15), 2.19 (1H, m, H-11), 2.12 (1H, dd, J = 10.8, 17.7 Hz, H-2), 1.30 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-14), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-12), 0.85 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13); 3C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 31.4 (C-1), 46.4 (C-2), 213.5 (C-3), 62.1 (C-4), 132.2 (C-5), 121.8 (C-6), 153.1 (C-7), 111.9 (C-8), 140.1 (C-9), 128.6 (C-10), 30.6 (C-11), 19.2 (C-12), 21.1 (C-13), 21.2 (C-14), 15.6 (C-15)。以上波谱数据与文献报道的化合物[19]对照基本一致, 故鉴定化合物3为(1S, 4R)-7-hydroxycalamenen-3-one。

化合物4 白色粉末。ESI-MS m/z: 237 [M-H]-, 239 [M+H]+1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 5.31 (1H, s, H-4), 3.66 (1H, dd, J = 4.7, 11.3 Hz, H-7), 2.53 (1H, brs, H-5), 2.07 (1H, dt, J = 7.0, 14.1 Hz, H-11), 1.90 (1H, m, H-2), 1.87 (1H, m, H-1), 1.76 (1H, m, H-2), 1.64 (1H, m, H-10), 1.61 (1H, m, H-9), 1.59 (1H, m, H-8), 1.51 (1H, m, H-1), 1.43 (1H, dd, J = 12.6, 24.0 Hz, H-8), 1.14 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-13), 1.07 (3H, d, J = 7.1 Hz, H-12), 0.90 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-14); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 24.5 (C-1), 26.2 (C-2), 135.7 (C-3), 119.7 (C-4), 45.0 (C-5), 76.7 (C-6), 72.3 (C-7), 40.2 (C-8), 26.5 (C-9), 36.4 (C-10), 35.2 (C-11), 17.9 (C-12), 19.1 (C-13), 19.5 (C-14), 24.2 (C-15);以上波谱数据与文献报道的化合物[18]对照基本一致, 故鉴定化合物4为(-)-(5R, 6R, 7S, 9R, 10S)-cadinan-3-ene-6, 7-diol。

3 生物活性测试

取对数生长期的细胞株, 分别接种至不同的96孔培养板, 每孔100 μL, 于培养箱中孵育至细胞铺满孔底达到80%。将样品溶解于二甲亚砜(DMSO)中, 使其浓度为50 mg·mL-1。接着用DMEM培养基将样品稀释至指定浓度后每孔分别加入样品200 μL继续培养, 其中空白组不加细胞和样品, 对照组仅不加样品。分别培养至指定时间后, 去除培养基, 向每个孔中加入5 mg·mL-1的MTT 20 μL和DMEM 200 μL。继续培养30 min, 弃去上清液, 每孔加入约DMSO 150 μL, 混合均匀后, 充分溶解细胞中生成的蓝紫色结晶甲臜, 并置于酶标仪上562 nm波长处测定每孔吸光度。

细胞存活率(%) = [(OD样品组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%[20], 并利用Graphpad Prism计算半数抑制浓度(IC50)。结果显示化合物1~4对人肝癌细胞HepG 2没有明显细胞毒活性(IC50 > 10 μmol·L-1)。

致谢: 暨南大学药学院陈国栋副教授在ECD计算方面给予指导和帮助。

作者贡献: 梁旭是本文第一作者, 负责紫茎泽兰石油醚部位的化学成分的分离鉴定和文章撰写; 杨新洲负责化合物分离及鉴定工作的把关和指导; 吴超群负责药物活性的筛选; 李余钊负责药材的前处理、粉碎、提取等; 袁经权是本文的通讯作者, 负责实验设计和把关、论文框架的构建及稿件修改等。

利益冲突: 本文的研究内容无任何利益冲突。

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