2020, Vol. 55
川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)为伞形科(Apiaceae)藁本属多年生草本栽培植物, 主产于我国四川、云南、贵州等地[1]。川芎的干燥根茎作为传统中药, 始载于《神农本草经》, 其性温, 味辛, 归肝经、胆经、心包经, 有活血行气、祛风止痛的功效, 主治血瘀气滞所致月经不调, 痛经经闭, 肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛、风寒湿痹、跌打肿痛等疾病[2]。目前临床主要将其用于治疗心脑血管、呼吸、泌尿系统及妇科方面的疾病[3]。化学成分研究显示, 川芎含有苯酞类、有机酸、生物碱、多糖等多种化学成分, 其中苯酞类化合物是其主要化学成分[4]。现代药理研究证明川芎具有抗脑缺血、抗心肌缺血、保护血管内皮细胞、平喘、镇静、阵痛等作用, 其中苯酞类是主要活性物质[5-7]。前期本课题组从川芎80%乙醇提取物的正丁醇部位分离得到一系列苯酞类新化合物[8-10], 为发现更多结构新颖的苯酞类化合物, 进一步为川芎的开发利用提供科学依据。本实验采用Sephadex LH-20柱色谱和高效液相制备色谱等多种色谱学方法, 从川芎正丁醇部位分离得到3个苯酞类新化合物(图 1), 并通过MS、NMR和CD等波谱技术鉴定结构, 分别为(3Z, 3aE)-(6R, 7R, 2'S)-6-hydroxy-7-(2-carboxyl-2-hydroxyethylthio)-3-(2-hydroxybutylidene)-4, 5, 6, 7-tetrahydro-phthalide (1)、(3Z, 3aZ)-3-butylidene-6, 7-dihydroxy-4, 5, 6, 7-tetrahydro-phthalide 7-O-α-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-fructo-furanoside (2)和3-(3-β-D-glucopyranosyloxy-butylidene)-7-hydroxy-phthalide (3)。
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Figure 1 The chemical structures of compounds 1-3 |
化合物1 白色无定形粉末, UV λmax (MeOH) (log ε): 201 (4.08)、273 (4.03) nm; [α]D20-12.3 (c 0.10 MeOH); HR-ESI-MS m/z 367.083 0 [M+Na]+ (Calcd. 367.082 2), 提示化合物1的分子式为C15H20O7S, 不饱和度为6; IR光谱在3 356、2 932、1 757、1 678、1 636、1 411、1 239和1 090 cm-1处有吸收峰, 说明化合物存在羟基、γ-内酯和二烯结构片段。
1的1H NMR谱(表 1)提示存在1个烯质子信号δH 5.35 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-8); 4个亚甲基信号δH 2.43 (2H, m, H-4)、1.82 (2H, m, H-5)、1.45 (1H, m, H-10a)、1.55 (1H, m, H-10b)、2.85 (1H, dd, J = 7.0, 13.5 Hz, H-1'a)和3.04 (1H, dd, J = 4.0, 13.5 Hz, H-1'b); 1个甲基信号δH 0.84 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-11); 3个连氧次甲基信号δH 4.11 (1H, m, H-6)、4.41 (1H, m, H-9)和4.03 (1H, dd, J = 4.0, 7.0 Hz, H-2')。13C NMR谱(表 2)共显示有15个碳信号, 包括两个羰基信号δC 167.8 (C-1)和174.0 (C-3'), 3个连氧次甲基δC 67.4 (C-6)、66.3 (C-9)和70.7 (C-2')。仔细分析1的质谱和核磁数据发现其与本研究组前期分离得到的化合物thiosenkyunolide C波谱数据非常接近[8], 区别在于9位的亚甲基在1中被羟基化, HMBC谱和1H-1H COSY谱均证实了上述推断(图 2)。ROESY实验中, H-8和H-4相关提示3位双键为Z构型。侧链上C-2'位的绝对构型通过加入钼试剂[Mo2(AcO)4]测定CD谱的方法来确定[11], CD图谱在345 nm处显示了负Cotton效应(图 3), 因此C-2'位的绝对构型为S。
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Table 1 1H NMR data of compounds 1-3 at 500 MHz in DMSO-d6 (J in Hz) |
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Table 2 13C NMR data of compounds 1-3 at 125 MHz in DMSO-d6 |
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Figure 2 Key HMBC 1H-1H COSY and ROESY correlations of 1 |
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Figure 3 CD spectrum of 1 with [Mo2(AcO)4] |
通过系统的构象分析结合1H NMR谱和ROESY谱数据, 可以确定H-6和H-7的相对立体构型与thiosenkyunolide C相同, 也为反式。而且1和thiosenkyunolide C的实验ECD图谱Cotton效应趋势一致(图 4), 可以推断1的6, 7位具有与thiosenkyunolide C相同的绝对构型。因此确定该化合物的结构为(3Z, 3aE)-(6R, 7R, 2'S)-6-hydroxy-7-(2-carboxyl-2-hydroxyethylthio)-3-(2-hydroxybutylidene)-4, 5, 6, 7-tetrahydro-phthalide。
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Figure 4 CD spectrum of 1 |
化合物2 白色无定形粉末, UV λmax (MeOH) (log ε): 200 (3.76)、273 (3.85) nm; [α]D2015.7 (c 0.10 MeOH); HR-ESI-MS m/z 571.199 6 [M+Na]+ (Calcd. 571.199 7), 提示2的分子式为C24H36O14, 不饱和度为7; IR光谱在3 380、2 932、2 877、1 751、1 640、1 418、1 049 cm-1处有吸收峰。
在2的1H NMR谱(表 1)低场区观察到1个双键质子信号δH 5.50 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-8), 高场区存在1个甲基氢信号δH 0.91 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-11), 4个亚甲基氢信号δH 2.44 (2H, m, H-4)、1.80 (2H, m, H-5)、2.27 (2H, q, J = 7.5 Hz, H-9)和1.46 (2H, m, H-10), 两个连氧次甲基氢信号δH 4.16 (1H, m, H-6)和4.09 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-7);其13C NMR谱(表 2)显示1个酯羰基碳信号δC 168.6 (C-1), 4个双键碳信号δC 148.0 (C-3)、154.4 (C-3a)、123.5 (C-7a)和113.0 (C-8), 1个甲基碳信号δC 13.7 (C-11), 4个亚甲基碳信号δC 16.4 (C-4)、23.0 (C-5)、27.6 (C-9)和21.7 (C-10), 两个连氧次甲基碳信号δC 65.4 (C-6)和71.1 (C-7), 以上数据说明2的母核骨架与1相同。与此同时2的1H NMR谱还显示存在一组蔗糖氢信号δH 3.47 (1H, overlap, H-1'a)、3.56 (3H, overlap, H-1'b/6')、4.11 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-3')、3.85 (1H, m, H-4')、3.59 (1H, overlap, H-5')、5.15 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-1")、3.10 (1H, overlap, H-2")、3.25 (1H, m, H-3")、3.11 (1H, overlap, H-4")和3.47 (3H, overlap, H-5"/6")。
2的HMBC谱中显示H-8与C-3/C-3a相关, H-7与C-7a/C-3a/C-1相关, H-6和C-7a相关, H-5和C-3a相关, H-4与C-3a/C-7a相关, 结合1H-1H COSY谱中H-8/H-9/H-10/H-11相关, H-4/H-5/H-6/H-7相关证实了丁基四氢苯酞结构母核的存在(图 5)。HMBC谱中, 葡萄糖端基质子(δH 5.15)和C-2'的相关证实了蔗糖的存在, 而H-7和C-3'相关, 说明蔗糖的C-3'位和C-7位通过糖苷键相连。根据H-6和H-7的化学位移和耦合常数可以确定其相对构型为6, 7-trans[8, 10, 12], 葡萄糖端基氢的偶合常数(4.0 Hz)和单糖衍生化样品的气相色谱分析确定为α-D-葡萄糖。ROESY谱中, H-8和H-4相关提示3位双键为Z构型。通过以上分析, 可以确定化合物2的结构为(3Z, 3aZ)-3-butylidene-6, 7-dihydroxy-4, 5, 6, 7-tetrahydro-phthalide 7-O-α-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-fructo-furanoside。
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Figure 5 Key HMBC1H-1H COSY and ROESY correlations of 2 |
化合物3 白色无定形粉末, UV λmax (MeOH) (log ε): 225 (4.24)、265 (4.02) nm; [α]D20-20.9 (c 0.10 MeOH); HR-ESI-MS m/z 405.115 8 [M+Na]+ (Calcd. 405.115 6), 提示3的分子式为C18H22O9, 不饱和度为8; IR光谱在3 410、2 928、2 671、1 759、1 689、1 607、1 015 cm-1有吸收峰。
3的1H NMR谱(表 1)的低场区可以观察到3个苯环上的相邻氢信号δH 7.25 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4)、7.55 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5)和6.90 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 1个双键上的氢信号δH 5.98 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-8), 提示该化合物可能含有1个1, 2, 3-三取代的苯环和1个双键结构片段。在高场区还显示了1个甲基氢信号δH 1.18 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-11), 1个亚甲基氢信号δH 2.53 (2H, dd, J = 7.5, 13.5 Hz, H-9), 1个连氧次甲基氢信号δH 3.91 (1H, m, H-10), 以及1组葡萄糖氢信号δH 4.25 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1')、2.95 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2')、3.12 (1H, m, H-3')、3.04 (1H, q, J = 9.0 Hz, H-4')、3.08 (1H, m, H-5')、3.42 (1H, dd, J = 5.5, 11.5 Hz, H-6'a)和3.65 (1H, dd, J = 2.0, 11.5 Hz, H-6'b)。13C NMR谱(表 2)共显示18个碳信号, 包括1个酯羰基碳信号δC 164.5 (C-1), 6个苯环碳信号δC 141.0 (C-3a)、110.3 (C-4)、136.6 (C-5)、116.5 (C-6)、157.1 (C-7)和109.4 (C-7a), 两个双键碳信号δC 145.6 (C-3)和104.5 (C-8), 1个甲基碳信号δC 21.4 (C-11), 1个亚甲基碳信号δC 32.0 (C-9), 1个连氧次甲基碳信号δC 73.8 (C-10), 以及1组葡萄糖碳信号δC 102.2 (C-1')、73.6 (C-2')、76.8 (C-3')、70.1 (C-4')、76.7 (C-5')和61.1 (C-6')。
3的碳氢谱核磁数据显示, 3与ligusticumolide F母核结构相似[9], 为丁基苯酞类化合物, 该结论可通过HMBC谱中H-6与C-4/C-7a相关, H-5与C-7/C-3a相关, H-4与C-6/C-7a/C-3相关, H-8与C-3/C-3a相关进行证实(图 6)。此外, H-1' (δH 4.25)和C-10相关, 说明葡萄糖连接在C-10位。根据葡萄糖端基氢的偶合常数(8.0 Hz)和单糖衍生化样品的气相色谱分析确认为β-D-葡萄糖。通过以上分析, 可以确定化合物3的结构为3-(3-β-D-glucopyranosyloxy-butylidene)-7-hydroxy-phthalide。
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Figure 6 Key HMBC correlations of 3 |
最后, 由于所得化合物的量太少, 在检测完1~3的各种波谱数据、确定平面结构和1的部分立体构型后, 无法满足后续的绝对构型的确定。下一步将继续对川芎中化学成分进行深入研究, 为川芎的开发利用提供理论和实验依据。
实验部分JASCO P-2000型旋光仪, JASCO V-650型紫外分光光度计, JASCO J-712型圆二色谱仪(美国JASCO公司); Nicolet 5700型红外光谱仪(美国Thermo公司); Bruker AVANCE III 500型核磁共振仪(美国Bruker-Biospin公司); Agilent 1100 LC/MSD TOF型高分辨质谱仪(美国Agilent公司); Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司); Shimadzu LC-6AD型半制备液相色谱仪(日本岛津公司); YMC ODS-A C18制备柱(250 mm×10 mm, 5 µm, 日本YMC公司); Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱填料(瑞典Pharmacia Fine Chemicals公司); 硅胶色谱填料(青岛海洋化工厂)。
1 提取与分离川芎的干燥根茎共100 kg, 粉碎后经80%乙醇回流提取(3×2 h), 得浸膏(约23.1 kg)。浸膏经水分散后, 依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取。所得正丁醇部位(1.3 kg)加水分散, 水溶解部分上大孔吸附树脂, 依次用0%~95%乙醇梯度洗脱。取正丁醇部位大孔吸附树脂15%乙醇洗脱部分进行中压ODS柱色谱分离, 用水和甲醇梯度洗脱, 得到Fr1~Fr 84共计84个洗脱部分。Fr 19 (60 mg)上样Sephadex LH-20柱色谱, 随后使用pre-HPLC (C18, 5 μm, 250 mm×20 mm, YMC; 5.0 mL·min-1; 254 nm; 25% MeOH/H2O)纯化得到化合物1 (3.1 mg, tR = 26.0 min, 纯度: 93%)。Fr 32 (55 mg)经pre-HPLC (C18, 5 μm, 250 mm×10 mm, YMC; 3.0 mL·min-1; 254 nm; 18% MeOH/H2O)分离, 得到化合物2 (3 mg, tR = 23.7 min, 纯度: 97%)。Fr 42 (55 mg)经Sephadex LH-20分离, 随后使用pre-HPLC (C18, 5 μm, 250 mm×10 mm, YMC; 3.0 mL·min-1; 254 nm; 12% ACN/H2O)柱色谱分离, 得到化合物3 (2.8 mg, tR = 21.0 min, 纯度: 95%)。
2 化合物2和3糖取代基绝对构型的确定分别取化合物2和3各1.5 mg, 溶于3 mL三氟乙酸溶液(1 mol·L-1)中, 60 ℃水浴加热4 h, 真空减压回收溶剂, 残渣冷冻干燥。将冻干样品溶于1 mL吡啶溶液中, 加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐3 mg, 60 ℃水浴加热1 h。反应液经减压回收溶剂后, 加入三甲基硅烷咪唑0.5 mL, 60 ℃水浴加热1 h。然后加入水2 mL至反应液中, 用正己烷萃取3次(每次2 mL)。有机相浓缩至0.2 mL, 过滤后进气相色谱分析。通过与标准品的保留时间比较(D-葡萄糖的保留时间为29.61 min)[13], 确定2和3中葡萄糖的绝对构型。
3 结构鉴定化合物1 白色无定形粉末, UV λmax (MeOH) (log ε): 201 (4.08)、273 (4.03) nm; [α]D20-12.3 (c 0.10 MeOH); HR-ESI-MS m/z 367.083 0 [M+Na]+ (Calcd. 367.082 2); IR: 3 356、2 967、2 932、1 757、1 678、1 636、1 519、1 411、1 307、1 239、1 188、1 090、1 045、972 cm-1; ECD (MeOH)/nm: 247 (∆ε 1.71)、289 (∆ε -2.12); 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)数据参见表 1, 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)数据参见表 2。
化合物2 白色无定形粉末, UV λmax (MeOH) (log ε): 200 (3.76)、273 (3.85) nm; [α]D2015.7 (c 0.10 MeOH); HR-ESI-MS m/z 571.199 6 [M+Na]+ (Calcd. 571.199 7); IR: 3 380、2 962、2 932、2 877、1 751、1 679、1 640、1 418、1 331、1 256、1 049、996、930 cm-1; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)数据参见表 1, 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)数据参见表 2。
化合物3 白色无定形粉末, UV λmax (MeOH) (log ε): 198 (4.04)、225 (4.24)、265 (4.02)、230 (3.79)、239 (3.80) nm; [α]D20-20.9 (c 0.10 MeOH); HR-ESI-MS m/z 405.115 8 [M+Na]+ (Calcd. 405.115 6); IR: 3 410、2 975、2 928、2 671、1 759、1 689、1 607、1 472、1 377、1 288、1 199、1 162、1 076、1 015、897 cm-1; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)数据参见表 1, 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)数据参见表 2。
作者贡献:本文中苑祥和韩冰主要负责分离纯化工作, 苑祥负责解析, 冯子明和姜建双负责指导分离工作, 杨桠楠和张培成负责指导结构解析工作, 张培成全程指导实验设计、结构解析和论文撰写。
利益冲突:文中没有任何利益冲突。
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