基于“多肽组-修饰组”比较分析鹿皮与鹿皮胶物质基础

引用本文

LIU Rui, ZHU Yue, ZHENG Yun-feng, ZHAO Ming, LIU Xun, HUANG Yong, XU Hao-kun, DUAN Jin-ao. Comparative analysis of chemical constituents of deer hide and deer hide gelatin by "peptidomics-modifications" methods[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020, 55(8): 1882-1888.

刘睿, 朱悦, 郑云枫, 赵明, 刘逊, 黄勇, 徐浩坤, 段金廒. 基于“多肽组-修饰组”比较分析鹿皮与鹿皮胶物质基础[J]. 药学学报, 2020, 55(8): 1882-1888.

基于“多肽组-修饰组”比较分析鹿皮与鹿皮胶物质基础

刘睿^1,2,3, 朱悦^1,3, 郑云枫^1,3, 赵明^1,3, 刘逊⁴, 黄勇⁵, 徐浩坤⁵, 段金廒^1,3

1. 南京中医药大学, 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏南京 210023;
2. 南京中医药大学, 江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室, 江苏南京 210023;
3. 南京中医药大学药学院, 江苏南京 210023;
4. 苏州卫生职业技术学院, 江苏苏州 215009;
5. 贵州广济堂药业有限公司, 贵州贵阳 550014

收稿日期: 2020-01-30; 修回日期: 2020-03-14

基金项目: 国家重点研发计划资助项目（2018YFC1706100）；国家自然科学基金面上项目（81973450）；江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师（2016年）；江苏省“333工程”第三层次（2016年）；贵州省科技攻关项目[2019]2771号；贵州省科技计划项目[2020]4Y090号；中华中医药学会“青年人才托举工程”（QNRC2-C14）；江苏省高等学校自然科学研究项目（19KJB360020）

^*通讯作者: 段金廒,Tel:86-25-85811116, Fax:86-25-85811116, E-mail:dja@njucm.edu.cn

摘要: 胶原蛋白为胶类动物药主要物质基础，鹿皮在高温煎煮熬制加工成鹿皮胶的过程中胶原蛋白的部分氨基酸位点会发生羟基化与脱酰胺修饰，本文基于“多肽组-修饰组”结合的研究思路系统比较了鹿皮与鹿皮胶的蛋白质肽类物质基础。采用纳升液相-串联质谱法分析鉴定鹿皮与鹿皮胶中蛋白质类、肽类成分组成，并进一步比较鹿皮与鹿皮胶的修饰数量与修饰位点。结果表明，鹿皮胶的羟基化修饰与脱酰胺修饰数量均显著多于鹿皮，提示在高温熬制加工过程中，鹿皮胶原蛋白的部分氨基酸位点发生了修饰，这些修饰与胶原蛋白的特定氨基酸结构单元、亲疏水性等因素有关，鹿皮胶原蛋白发生修饰的阶段与机制有待后续研究阐释。本文为鹿皮胶物质基础研究、加工过程及胶原蛋白修饰的相关性研究提供了重要理论依据，有利于开展鹿皮胶工艺优化、质量标准提升等研究。

关键词: 多肽组修饰组鹿皮鹿皮胶物质基础

Comparative analysis of chemical constituents of deer hide and deer hide gelatin by "peptidomics-modifications" methods

LIU Rui^1,2,3, ZHU Yue^1,3, ZHENG Yun-feng^1,3, ZHAO Ming^1,3, LIU Xun⁴, HUANG Yong⁵, XU Hao-kun⁵, DUAN Jin-ao^1,3

1. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine and Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China;
2. Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
3. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
4. Suzhou Vocational Health College, Suzhou 215009, China;
5. Guizhou Guangjitang Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550014, China

Abstract: Collagen is the main constituent of gelatinous Chinese medicine, with deer hide gelatin (Cervi Corii Colla, DHG) made from deer hide (DH) through a complex thermal and high-pressure processing procedure. During this procedure some amino acids in collagen undergo hydroxylation and deamidation. In the present study, comparative analysis of proteins and peptides in DH and DHG was carried out using "peptidomics-modifications" methods. Nano-LC-MS/MS was used to analyze proteins and peptides in DH and DHG, and the number and sites of modification were determined as well. The amount of hydroxylation and deamidation that occurred in DHG was significantly greater than that in DH, suggesting that under thermal and high-pressure processing these modifications occurred more frequently on certain amino acids in collagen, and might be correlated with hydrophobicity. The occurrence and mechanism of hydroxylation and deamidation in DH processing procedures should be explored in further research. The present study provides important evidence of the chemical constituents and the correlation of processing procedures with these modifications, and also suggests some investigative ideas for DHG processing optimization and improvement of quality standards.

Key words: peptidomics modifications deer hide deer hide gelatin chemical constituent

鹿皮胶(Cervi Corii Colla)以梅花鹿(Cervus nippon T.)或马鹿(Cervus elaphus L.)的皮为原料经熬制、浓缩、干燥而成, 鹿皮胶味咸, 性温, 归肝, 肾经, 具滋阴润燥、补血止血等功效^[1]。《本草纲目》有关于鹿皮(deer hide, DH)的记载: “补气; 涩精; 敛疮”。《四川中药志》记载鹿皮“补气, 涩虚滑。治妇女白带, 崩漏, 肾虚滑精及涂一切疮漏”^[2]。现代研究表明, 鹿皮胶具有补血、调节免疫及抗疲劳作用^[3]。

胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质, 约占动物总蛋白的30%, 主要分布在皮肤、结缔组织、骨骼等部位, 胶原蛋白为鹿皮及鹿皮胶的主要成分。胶原蛋白来源的肽类成分具有抗氧化、抗衰老、皮肤保护等多种功效^[4]。胶原蛋白的基本结构单元为“甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y (Gly-Xaa-Yaa)”, 其中Xaa与Yaa多为脯氨酸(Pro)或羟脯氨酸(Hyp)。Pro的羟基化、天门冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的脱乙酰化为胶原蛋白主要的修饰类型。

翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)通常指蛋白质在生物体信号通路传导、生理生化反应过程中特定位点氨基酸发生的化学变化^[5]。动物药在生产加工、煎煮熬制、体内消化作用等过程中, 部分氨基酸位点会发生化学反应与化学变化, 称之为“修饰”。因而, 课题组基于“动物药修饰组(modifications in animal-derived TCMs)”的研究思路, 围绕胶类动物药蛋白质、肽类成分在炮制加工、提取熬制过程发生的化学修饰、修饰类别、修饰位点、修饰数量等开展定性与定量研究^[6]。本文比较了鹿皮在熬制加工成鹿皮胶的过程中多肽类成分物质组成及其氨基酸修饰类别、修饰位点、修饰数量等变化, 探讨加工熬制过程中鹿皮蛋白质/肽类成分氨基酸位点修饰的变化规律, 以期为胶类动物药物质基础研究提供科学依据及应用基础。

材料与方法

仪器与材料 戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统(美国DIONEX公司); Thermo Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪(美国Thermo Fisher公司); BP 211D电子天平(德国Sartorius公司); Rotavapor R-210旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司); 离心浓缩仪、Freezone 4.5 plus冷冻干燥机(美国Labconco公司)。

碳酸氢铵, 胰蛋白酶(Promega质谱测序级), 乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级(德国Merck公司)。Seppack C18固相萃取小柱(Waters公司); 多肽测定试剂盒(美国, Thermo公司)。鹿皮由贵州广济堂药业有限公司提供, 为鹿科动物马鹿的皮。

鹿皮与鹿皮胶样品的制备 从整张鹿皮上随机切割4块鹿皮, 每块鹿皮剪至3.0×3.0 cm²大小, 充分浸泡5~7天, 经过焯皮、洗皮、高温熬制化皮(温度为117~120 ℃)后, 除去皮渣和油脂, 将熬制液合并, 提沫、浓缩、干燥后得到鹿皮胶样品(DHG), 分别编号为鹿皮胶1~鹿皮胶4 (DHG-1~DHG-4)。从洗皮处理后的4块鹿皮样品上分别切割约0.5×0.5 cm²大小的鹿皮样品, 冷冻干燥后得到鹿皮样品(DH), 编号为DH-1~DH-4。

DH与DHG样品的酶解 参照2015版《中国药典》的方法, 稍作修改, 取干鹿皮样品0.1 g, 加入液氮充分研磨后, 加入1%碳酸氢铵溶液50 mL, 超声处理30 min, 得鹿皮提取液; 另取鹿皮胶样品0.1 g, 加1%碳酸氢铵溶液50 mL, 超声处理30 min, 10 000 r·min^-1离心后, 得鹿皮胶提取液。分别取鹿皮提取液和鹿皮胶提取液100 μL, 置于2 mL离心管中, 加入0.1 μg·μL^-1的胰蛋白酶溶液20 μL, 摇匀, 37 ℃恒温酶解12 h, 加入10% TFA溶液60 μL终止反应, 用Seppak C18固相萃取小柱脱盐, 用离心浓缩仪干燥, 分别得到鹿皮酶解物和鹿皮胶酶解物, 采用多肽试剂盒测定多肽总量后置于-20 ℃保存, 备用。

nano-LC MS/MS分析 戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统, 色谱柱为5 μm Reprosil C18AQ (75 μm×150 mm), LC-MS/MS系统分析样品。用初始流动相分别将鹿皮酶解物和鹿皮胶酶解物样品复溶至多肽浓度为1 μg·μL^-1, 上样2 μL, 流速400 nL·min^-1, 流动相A (乙腈-甲酸-水, 2:0.2:98), 流动相B (乙腈-甲酸-水, 80:0.2:20), 2%~30% B线性梯度洗脱150 min。Thermo Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪用于肽段分析, 喷雾电压为2.5 kV, 离子传输毛细管温度为200 ℃; 质谱一级全扫描范围为m/z 300~2 000, 分离宽度为3 Da; 串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式, 依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱, 每个样品重复进样1次。采用Xcalibur软件进行数据采集。

DH与DHG的蛋白质、肽类成分鉴定及修饰情况分析 二级质谱数据采用PEAKS 8.5软件进行搜库鉴定分析, 分别检索劳亚兽总目(Laurasiatheria)蛋白质库、自制胶原蛋白质库, 检索参数设置为:前体离子误差10 ppm; 子离子误差1 Da; PTMs的设置参数为:可变翻译后修饰选择氧化修饰(+15.99 Da); N-端乙酰化(+42.01 Da); 脱酰胺(+0.98 Da); 羟基化(+15.99 Da)。允许2个位点误切, 假阳性率(FDR)≤1%;样品搜库选择胰蛋白酶酶切方式; 其他参数为默认参数, 在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P < 0.05)被认定为有效的鉴定结果。对DH与DHG中主要的PTMs进行系统比较与分析。

结果 1 DH与DHG蛋白质、肽类成分的鉴定

DH与DHG样品中共鉴定98个蛋白质类成分, 其中以胶原蛋白为主, 鉴定得到的源于胶原蛋白的肽段占全部肽段数量的90%以上。根据鉴定得到的胶原蛋白种类, 自行构建胶原蛋白数据库, 即含有鹿科来源的胶原蛋白I型胶原α1链(COL1A1), I型胶原α2链(COL1A2), III型胶原α1链(COL3A1), II型胶原α1链(COL2A1), XI型胶原α1链(COL11A1), VII型胶原α1链(COL7A1), IV型胶原α5链(COL4A5), IV型胶原α3链(COL4A3), IV型胶原α1链(COL4A1), XVII型胶原α1链(COL17A1)和X型胶原α1链(COL10A1)的全部氨基酸序列, 进行搜库检索, 以比较DH与DHG中胶原蛋白类成分的共性与差异。从鹿皮样品DH-1~DH-4中共鉴定了4 636个肽段信息, 从鹿皮胶样品DHG-1~DHG-4中共鉴定了4256个肽段信息。DH与DHG鉴定的所有肽段中, 35.1%的肽段仅在DH样品中, 29.3%的肽段仅在DHG样品中, 两者重叠部分占全部鉴定肽段的35.6%。

2 DH与DHG羟基化和脱酰胺修饰比较

以自建胶原蛋白库进行搜索鉴定, 结果表明DH与DHG的胶原蛋白主要为COL1A1、COL1A2、COL3A1与COL2A1, 在鉴定的肽段中, 主要发生羟基化与脱酰胺修饰两类修饰。在DH熬制成DHG后, 羟基化和脱酰胺修饰的数量显著变化(P < 0.05; P < 0.01), 如表 1所示, 以单位数量肽段(100个肽段)发生羟基化与脱酰胺修饰的数量为指标进行统计, 结果表明DHG发生羟基化与脱酰胺的数量均显著多于DH (P < 0.01)。在DH样品中每100个肽段发生142.5个羟基化修饰与16.3个脱酰胺修饰; 而经过高温高压煎煮熬制及浓缩干燥后的DHG样品, 每100个肽段中发生羟基化与脱酰胺修饰的数量提升至150.5与20.5个。

Table 1 Number of identified peptides and peptides with PTMs. PTMs: Post-translational modifications; DH: Deer hide; DHG: Deer hide gelatin. ^**P < 0.01 vs DH

COL1A1、COL1A2、COL3A1与COL2A1为构成DH与DHG样品的主要胶原蛋白, 因此, 以DH与DHG样品中4种胶原蛋白的鉴定肽段(identified peptides)数量、蛋白覆盖肽段(coverage peptides)数量、肽谱匹配(peptide spectrum matches, PSM)数量为指标进行对比分析, 结果见表 2, 用每100个肽段中发生羟基化和脱酰胺修饰的PSM数量来比较DH和DHG中4种胶原蛋白修饰数量的变化。

Table 2 Number of identified peptides and peptides with post-translational modifications in collagens. PSM: Peptide spectrum matches; COL1A1: Collagen type I α1 chain; COL1A2: Collagen type I α2 chain; COL3A1: Collagen type III α1 chain; COL2A1: Collagen type II α1 chain. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs DH

DHG样品中鉴定得到的源于COL1A2与COL3A1的肽段数量显著多于DH样品, 为了排除鉴定肽段数量不同对PTMs数量统计的干扰, 以单位数量肽段(100个肽段)发生羟基化和脱酰胺修饰的PSM数量来比较DH熬制前后PTMs数量的变化。结果如表 2所示, 源于COL1A1、COL1A2、COL3A1及COL2A1的肽段中, DHG样品肽段发生羟基化修饰的PSM均显著高于DH (P < 0.01); DHG样品肽段发生脱酰胺修饰的PSM均显著高于DH (P < 0.01)。表明在DH加工熬制过程中发生了较多的羟基化和脱酰胺修饰。

3 DH与DHG羟基化修饰的对比分析

对COL1A1、COL1A2、COL3A1与COL2A1的所有Pro羟基化修饰在DH与DHG中的分布与变化情况进行对比与分析, 以每1 000个肽段中发生羟基化修饰的数量作为指标统计Gly-Xaa-Yaa为胶原蛋白的基本结构, 通常含有Pro的结构主要分为3类: Gly-Xaa-Pro, Gly-Pro-Yaa及Gly-Pro-Pro, 因此, 应重点比对DH与DHG中这3类含Pro的胶原蛋白基本结构上发生羟基化修饰的差异与规律。

结果见表 3, 从所有肽段Pro羟基化修饰的比较来看, DHG的Gly-Ala-Pro、Gly-Asn-Pro与Gly-Thr-Pro结构单元Pro发生修饰的数量显著低于DH (P < 0.05; P < 0.01);而结构单元Gly-Arg-Pro、Gly-Val-Pro及Gly-Pro-Pro的Xaa位Pro发生羟基化修饰的数量显著高于DH (P < 0.05; P < 0.01)。DHG样品中源于COL1A1的结构单元Gly-Phe-Pro、Gly-Leu-Pro、Gly-Val-Pro及Gly-Pro-Pro的Xaa位Pro发生羟基化修饰的数量显著高于DH (P < 0.05; P < 0.01);源于COL1A2的结构单元Gly-Glu-Pro、Gly-Phe-Pro、Gly-His-Pro、Gly-Gln-Pro、Gly-Arg-Pro及Gly-Pro-Pro的Xaa位Pro发生羟基化修饰的数量显著高于DH (P < 0.05; P < 0.01);源于COL3A1的结构单元Gly-Met-Pro及Gly-Arg-Pro的Pro发生羟基化修饰的数量显著高于DH (P < 0.05; P < 0.01);源于COL2A1的结构单元Gly-Glu-Pro、Gly-Phe-Pro、Gly-Leu-Pro的Pro发生羟基化修饰的数量显著高于DH (P < 0.05; P < 0.01)。

Table 3 Number of hydroxylation types in collagens. GRAVY: Grand average of hydropathicity; N-p: N-Terminal hydroxyproline. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs DH

Type		GRAVY	Number of hydroxylation per 1000 peptides
			All collagens		COL1A1		COL1A2		COL3A1		COL2A1
			DH	DHG	DH	DHG	DH	DHG	DH	DHG	DH	DHG
Gly-Xaa-Pro	GAp	−0.067	229.0 ± 7.2	216.6 ± 3.4^*	252.6 ± 5.3	231.1 ± 5.3^*	194.4 ± 15	187.7 ± 6.2	244.7 ± 8.4	239.6 ± 15.3	65.2 ± 12.8	64.2 ± 11.1
	GDp	−1.833	4.1 ± 0.4	3.5 ± 0.3	-	-	2.2 ± 1.3	1.6 ± 0.5	20.5 ± 2.4	14.4 ± 1.0^**	-	8.6 ± 2.8
	GEp	−1.833	120.2 ± 1.3	117.3 ± 2.8	99.0 ± 1.6	99.8 ± 1.8	150.3 ± 2.0	163.4 ± 4.9^**	113.2 ± 9.4	71.6 ± 4.8^**	69.6 ± 9.2	110.3 ± 5.2^**
	GFp	0.267	56.8 ± 2.6	61.2 ± 1.8	65.0 ± 2.2	70.3 ± 1.7^*	49.4 ± 2.3	56.4 ± 3.5^*	70.9 ± 5.7	67.2 ± 3.3	200.9 ± 15.4	237.6 ± 18.2^*
	GHp	−1.733	7.1 ± 1.4	9.1 ± 1.2	-	-	2.4 ± 1.4	7.9 ± 1.0^**	32.0 ± 2.7	38.3 ± 7.3	-	-
	GIp	0.833	25.4 ± 1.7	24.2 ± 1.1	-	-	28.0 ± 0.3	26.8 ± 1.9	67.7 ± 7.1	79.8 ± 3.2	35.2 ± 3.1	30.1 ± 4.9
	GKp	-1.967	14.6 ± 0.9	13.3 ± 0.9	7.8 ± 0.4	5.6 ± 1.5	25.4 ± 2.5	28.9 ± 2.1	9.3 ± 2.3	1.3 ± 1.3^**	-	-
	GLp	0.600	144.2 ± 7.1	141.8 ± 3.6	78.0 ± 3.1	94.3 ± 2.2^**	204.7 ± 5.6	203.4 ± 4.8	188.8 ± 17.3	146.3 ± 5.2^**	113.1 ± 2.0	167.2 ± 13.4^**
	GMp	−0.033	9.3 ± 1.1	11.1 ± 0.9	11.7 ± 2.2	11.8 ± 1.0	-	-	29.1 ± 4	40.7 ± 3.6^**	31 ± 5.4	22.9 ± 4.2
	GNp	−1.833	18.9 ± 1.4	15.1 ± 1.4*	-	-	31.1 ± 3.0	30.7 ± 3.3	40.3 ± 6.7	27.0 ± 3.0^*	-	-
	GPp	−1.200	391.3 ± 8.4	400.7 ± 3.9	511.3 ± 8.8	519.4 ± 4.9	289.0 ± 8.9	291.2 ± 4.5	322.0 ± 20.2	309.3 ± 15.8	267.8 ± 33	230.3 ± 9.1
	GQp	−1.833	15.4 ± 1.3	17.5 ± 0.9	6.9 ± 1.1	4.7 ± 0.3^*	21.1 ± 0.7	31.0 ± 2.3^**	28.3 ± 2.0	30.2 ± 3.2	71.0 ± 6.0	48.7 ± 3.3^*
	GRp	−2.167	36.0 ± 1.9	41.6 ± 1.2^**	47.4 ± 2.0	49.2 ± 1.7	27.1 ± 4.7	34.7 ± 1.3^*	25.8 ± 2.5	31.4 ± 2.7^**	9.7 ± 4.3	11.4 ± 3.9
	GSp	−0.933	74.3 ± 3.7	71.1 ± 2.2	83.3 ± 4.3	85.5 ± 2.3	19.2 ± 1.8	17.7 ± 0.8	168.9 ± 17.7	159.0 ± 9.2	20.0 ± 7.1	-
	GTp	−0.900	13.0 ± 0.9	9.7 ± 0.3^**	19.2 ± 1.1	12.4 ± 0.9^**	7.2 ± 1.1	4.2 ± 0.8^**	8.0 ± 1.3	11.9 ± 3.7	-	-
	GVp	0.733	13.3 ± 1.2	19.0 ± 1.2^**	27.7 ± 2.1	37.0 ± 2.5^**	-	-	-	-	-	-
	GYp	−1.100	4.4 ± 0.7	4.9 ± 0.1	-	-	10.1 ± 1.6	12.2 ± 0.4	-	-	-	-
Gly-Pro-Yaa	GP	−1.000	215.3 ± 5.7	217.5 ± 4.6	234.2 ± 4.8	235.0 ± 6.4	189.1 ± 3.9	178.2 ± 8.6	206.6 ± 6.6	223.5 ± 17.1	187.8 ± 11.6	177.5 ± 4.4
Gly-Pro-Pro	GpP	−1.200	45.0 ± 2.0	49.8 ± 0.9^**	53.8 ± 3.5	61.1 ± 1.2^*	30.7 ± 2.1	35.5 ± 1.1^*	49.7 ± 7.2	35.9 ± 7.0	14.0 ± 4.6	23.0 ± 9.4v
	Gpp	−1.200	24.0 ± 1.6	21.2 ± 1.7P	35.9 ± 1.8	28.9 ± 2.1^**	6.7 ± 1.8	5.8 ± 1.1	19.1 ± 4.6	23.2 ± 5.5	50.9 ± 5.1	44.3 ± 10.7
N-p	N-p	-	48.6 ± 6.2	33.6 ± 1.0^**	57.2 ± 7.0	33.8 ± 2.4^**	42.2 ± 3.6	33.9 ± 1.8^*	23.8 ± 3.8	20.3 ± 1.9	11.3 ± 2.4	5.3 ± 1.1^**

Table 3 Number of hydroxylation types in collagens. GRAVY: Grand average of hydropathicity; N-p: N-Terminal hydroxyproline. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs DH

DHG样品的结构单元Gly-Phe-Pro、Gly-Val-Pro及Gly-Pro-Pro的Xaa位的Pro发生的羟基化修饰数量显著多于DH样品; 此外, 尽管全部肽段的Gly-Phe-Pro结构单元Pro羟基化修饰在DH与DHG样品中未见差异, 但是在COL1A1、COL1A2及COL2A1来源的肽段的Gly-Phe-Pro结构单元中, DHG的羟基化数量均显著高于DH (P < 0.05)。对所有Gly-Xaa-Yaa结构单元的亲疏水性分析结果如表 3的GRAVY (grand average of hydropathicity)值所示, GRAVY为负值则表示该结构单元亲水, 正值则表明疏水, 其中仅Gly-Phe-Pro、Gly-Ile-Pro、Gly-Leu-Pro与Gly-Val-Pro为负值, 表明这4个结构单元为疏水性结构单元, 除了Gly-Ile-Pro未表现出显著性差异外, 其他结构单元在全部肽段或部分胶原蛋白来源肽段比较中均表现出显著性差异, 结果提示, 羟基化修饰可能与结构单元的亲疏水性相关。

尽管Gly-Arg-Pro为亲水结构单元(GRAVY = -2.167), 但DHG样品中该结构单元的羟基化数量显著增加, 这可能与含有N端Hyp (N-Hyp)肽段数量减少有关:在DHG样品处理过程中, 由于羟基化修饰可能影响胰蛋白酶切割效率, 使其切割Arg-Hyp之间酰胺键的效率低于Arg-Pro, 因此Gly-Arg-Hyp结构单元漏切数量增加, 从而导致Gly-Arg-Hyp数量增加(即表现出Gly-Arg-Pro结构单元的羟基化增加, P < 0.01), N-Hyp肽段的数量显著降低(P < 0.05; P < 0.01)。此外, Gly-Asn-Pro结构单元的羟基化数量的变化, 可能与其Xaa位Asn发生脱酰胺修饰而导致Gly-Asn-Pro数量减少, Gly-Asp-Pro数量增加有关。

结果提示, 在DHG样品中, 结构单元Gly-Xaa-Pro的Pro发生羟基化修饰与Xaa疏水性有关, Val、Leu及Phe均为疏水性氨基酸, Xaa位置氨基酸的疏水性可能促进Pro羟基化的形成, 这一推测有待后续研究的证实。表 3统计结果表明, DH与DHG样品的Gly-Pro-Yaa结构单元中Pro羟基化的数量没有差异, 但是Gly-Pro-Pro结构单元Xaa位Pro发生羟基化的数量DHG显著高于DH。根据统计可初步判断, Yaa位的Pro有利于Xaa位Pro羟基化的发生, 这也有待后续研究的验证。

以COL1A2的肽段Gly₅₄₂~Arg₅₇₁为例, 在DH样品中, 鉴定到的肽段序列为GEQGPAGPP (+15.99) GFQ GLPGPAGTAGEAGKPGER (-10 lgP = 86.8), 而在DHG样品中, 鉴定得到的肽段序列为GEQGPAGPP (+15.99) GFQGLP (+15.99) GPAGTAGEAGKPGER (-10 lgP = 88.6), 其结构单元Gly-Leu-Pro中的Pro₅₅₆发生了羟基化修饰, 当Xaa位为Leu时可能有利于Yaa位Pro的羟基化, 如图 1所示, 为两者MS/MS图谱对比。

Figure 1 Comparison of MS/MS spectra of peptide and hydroxylated peptide

以COL1A1的肽段Gly₂₄₄~Arg₂₅₂为例, 在DH样品中, 鉴定到的肽段序列为GPPGPQ (+0.98) GAR与GPP (+15.99) GPQGAR, 仅Pro₂₄₆发生了羟基化修饰, 而在DHG样品中, 鉴定得到的肽段序列包括GP (+15.99) P (+15.99) GPQGAR、GPP (+15.99) GPQ (+0.98) GAR、GP (+15.99) PGP (+15.99) QGAR及GPP (+15.99) GPQGAR, 其Pro₂₄₅、Pro₂₄₆、Pro₂₄₈均发生了羟基化修饰, 提示Yaa位的Pro有利于Xaa位的Pro羟基化。

以COL1A1的肽段Gly₅₉₈~Lys₆₁₁为例, 在DH-1样品中, 共鉴定到含有6个含Gly-Val-Hyp结构单元的肽段, 而DHG-1样品中, 共鉴定到23个含Gly-Val-Hyp结构单元的肽段, 提示Xaa为Val时有利于Yaa位Pro的羟基化。

4 DH与DHG脱酰胺修饰的对比分析

DH与DHG中发生脱酰胺修饰的氨基酸是Asn与Gln, 无论是所有肽段还是来源于COL1A1、COL1A2、COL3A1与COL2A1的肽段, DHG发生脱酰胺修饰均显著多于DH。在DH加工熬制成DHG的过程中发生脱酰胺修饰的类型的统计结果见表 4, 以单位数量肽段(每1000个肽段)发生脱酰胺修饰的百分比为指标。DHG单位肽段中Asn发生脱酰胺修饰的数量显著高于DH (P < 0.01), 而Gln发生脱酰胺修饰的数量无显著性差别。DH样品中Asn发生脱酰胺修饰的比例为24.3%, 而DHG样品中的Asn脱酰胺修饰达到了41.3%, Gln发生脱酰胺修饰的比例在DH和DHG样品中无明显变化。

Table 4 Number of deamidation types in collagens. ^**P < 0.01 vs DH

讨论

羟基化和脱酰胺修饰在胶类动物药中为常见PTMs^[7], 本文以鹿皮及鹿皮胶为研究对象, 将相同来源的生鹿皮与鹿皮胶经过粉碎、提取、酶切、LC-MS/MS分析鉴定后, 获得生鹿皮与鹿皮胶的全部酶解肽段序列及PTMs信息。对羟基化和脱酰胺修饰进行了全面系统的分析与比较, 寻找鹿皮在加工熬制成鹿皮胶的过程中羟基化与脱酰胺修饰的变化规律。

本文研究表明, 鹿皮加工熬制成鹿皮胶后, 羟基化与脱酰胺修饰的数量显著增加, 修饰位点存在一定规律性, 然而加工过程中修饰发生的反应机制, 以及加工前后特定修饰肽段的绝对/相对定量的研究仍有待后续研究。基于本研究的数据的充分归纳总结, 可得出以下结论:在鹿皮熬制加工过程中①羟基化与脱酰胺修饰的数量显著增加; ②发生羟基化修饰的结构单元Gly-Xaa-Pro中, Xaa多数为疏水性氨基酸, 如Val、Phe、Leu等, Xaa位氨基酸的疏水性有利于Yaa位Pro发生羟基化; ③结构单元Gly-Pro-Pro的Xaa位Pro易发生羟基化修饰; ④脱酰胺修饰主要发生在Asn上, Gln发生脱酰胺修饰数量较少。

I型胶原蛋白为动物皮肤中主要的胶原类型, 由两条α1链与一条α2链形成三股螺旋结构, 胶原蛋白本身不溶于水, 但经过高温煎煮熬制, 胶原蛋白发生变性、溶胀、降解等化学/物理变化后, 得到胶原蛋白或胶原肽溶液。对于胶类动物药来说, 加工熬制过程是可溶性蛋白质、多肽释放的过程。此外, 加工熬制过程增加的部分氨基酸位点的修饰数量, 也参与了胶原蛋白类成分水溶性变化过程, 如羟基化和脱酰胺这两类修饰的共同特点都是形成-OH基团, Asn脱酰胺后形成Asp, -NH₂转变为-OH, 而Pro发生羟基化后变为Hyp, 即在Pro的五元环3-或4-位上引入-OH^[8], -OH基团的引入一定程度上增加了肽类分子与水形成氢键的趋势, 有利于改善肽段水溶性。胶类成分的熬制过程, 增加了胶原蛋白、胶原肽的溶出, 胶类动物药中可溶性肽类成分具有造血、提高免疫、抗疲劳等功效^[9], 提示胶类的熬制加工步骤对于胶类动物药功效的发挥具有积极作用。

在质量控制方面, 基于“多肽组-修饰组”比较分析结果丰富了鹿皮胶专属性鉴别与含量测定的指标性成分, 有利于鹿皮胶的质量控制标准的提升。以鹿皮胶专属性肽段SGETGASGPPGFAGEK为例^[7], 其中含有2个可发生羟基化修饰的Pro位点, 则该专属性肽段的不同修饰形态均可作为专属性成分用于鉴别, 即肽段SGETGASGP (+15.99) PGFAGEK、SGETGASGPP (+15.99) GFAGEK、SGETGASGP (+15.99) P (+15.99) GFAGEK均为专属性成分; 含量测定方面, 将不同修饰形态的专属性/指标性肽段的总量作为含量测定的限度具有更好的科学性。针对当前市场阿胶药材质量控制难的问题, 也可以通过“修饰组”的系统分析, 在明确阿胶专属性肽段的基础上^[10], 分析鉴定其可能的修饰类型, 以所有修饰肽段的总量为指标规定含量限度, 从而制定更合理可靠的鉴别与含量测定方法, 提升阿胶质量标准。

本文研究以鹿皮及鹿皮胶为研究对象, 采用“多肽组-修饰组”结合的分析策略, 不仅全面分析鹿皮样品中肽类成分的物质组成, 并深入揭示肽段可能发生的修饰类型与修饰规律, 这一方法具有较好的普适性:胶类动物药尽管基源动物不同, 但本质上仍然是胶原蛋白发生变性、降解、溶出、修饰等一系列变化, 可通过“多肽组-修饰组”分析过程中同源蛋白质数据库的构建来完善本研究思路与方法。因此, 本文研究对胶类动物药的物质基础、质量标准等研究具有重要借鉴意义。

作者贡献:刘睿负责实验方案的设计与论文撰写; 朱悦、郑云枫、赵明负责实验方案的修改与完善; 刘逊、黄勇、徐浩坤负责样品采集与处理; 段金廒对论文进行整体设计与指导。

利益冲突:研究内容无任何利益冲突。

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药学学报 2020, Vol. 55 Issue (8): 1882-1888 DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0081	PDF