2. 中国科学院过程工程研究所, 北京 100190
2. Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China
黄芪(Astragali Radix)是豆科植物黄芪属, 广泛分布于全国各地。黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黄芪用药历史悠久, 始载于《神农本草经》, 将其列为上品[2]。黄芪作用广泛, 具有补气固表、利尿托毒、敛疮生肌等功效[3]。现代药理研究表明, 黄芪具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、利尿、抗疲劳等功能[4-8]。黄芪主产于山西、甘肃、内蒙古等地, 受生态环境等影响, 不同产地间黄芪质量存在着差异。
黄芪药材以“豆腥味浓, 质优”被业内所公认, 具有浓的豆腥味是正品优质黄芪的特征[9]。著名现代名医曹炳章曾道: “山西太原府里陵地方出者, 名上芪, 其货直长糯软而无细枝, 切断有菊花纹, 兼有金井玉栏杆之纹, 为最道地; 又大同府五台山出, 粗皮细硬, 枝短味淡, 为台芪, 略次……”。豆腥味来源于挥发性成分, 挥发性成分在道地药材品质形成中具有潜在作用[10]。课题组前期使用同步回流提取法结合气相色谱技术分析黄芪挥发性成分中主要成分正己醛, 而且对黄芪豆腥味产生的内在生化基础和外在化学成分的鉴别表征, 以及豆腥味与黄芪有效成分与黄芪活性成分之间的相关性进行分析, 还研究了不同浓淡豆腥味的黄芪主要药效学(补气、抗疲劳及免疫调节)的异同[9]。
随着挥发性成分提取分析技术的发展, Xu等[11]采用同步蒸馏萃取法结合气质联用技术分析了鲜黄芪和干黄芪中的挥发性成分, 鲜黄芪中共鉴定出43种挥发性成分, 干黄芪中共检测出44种挥发性成分。Sun等[12]运用同时回流提取结合气质联用的方法对干黄芪中挥发性成分进行分析, 共检测出65种化合物。Li等[13]分析了山西、内蒙古、甘肃干黄芪中挥发性成分, 发现内蒙古黄芪中的挥发性成分种类最多, 山西次之, 甘肃最少。然而这些研究虽然在黄芪挥发性成分上进行了指认, 但对道地药材黄芪“豆腥气”的物质组成及比例特点, 以及与不同产地、不同栽培方式黄芪药材的区别, 并没有深入研究。
近年来发展的固相微萃取技术集采样、萃取、浓缩、进样于一体, 具有快速简便, 不使用溶剂, 不破坏样品, 易于与其他技术在线联用等优点[14]。固相微萃取技术为挥发性成分的分析提供了更为先进的分析手段。因此, 本研究采用固相微萃取结合气质联用技术, 通过对18批主流商品蒙古黄芪进行不同产地、不同栽培方式样品(山西仿野生芪、甘肃在栽培芪、内蒙古栽培芪)进行比较, 结合代谢组学分析方法, 通过PCA和PLS-DA分析, 找出挥发性成分间的比例差异, 探讨黄芪产地与挥发性成分的关系, 还进行了相关代谢通路的分析。本研究不仅为黄芪道地性特征“豆腥气”研究奠定了物质基础, 也为黄芪质量控制与评价提供参考。
材料与方法材料 18批黄芪药材采集于山西、甘肃、内蒙古3个不同产地, 经山西大学中医药研究中心秦雪梅教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的根, 样品用清水洗净, 去除芦头, 自然阴干后密封, 置于冷库保存备用, 详细信息见表 1。
仪器与试剂 Trace Polaris Q气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Finnigan公司), 手动进样柄及75 μm Carboxen/PDMS萃取头(美国Supelco公司), CP214电子天平(常州奥豪斯仪器有限公司), FW135中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司), B11-3型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)。
固相微萃取的操作方法 将气相色谱进样口设置到250 ℃, 固相微萃取的萃取头插入进样口老化至无杂峰, 然后取粉碎的样本1 g置于20 mL样品瓶中, 设置磁力搅拌器温度于70 ℃, 待温度稳定后, 将样品瓶置于水浴中平衡15 min后, 将老化后的萃取头插入样品瓶的顶空部分, 萃取60 min, 在温度为250 ℃的气质联用仪进样口解吸5 min后, 进行分析。
GC条件 HP-INNOWAX型色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm); 载气为氦气(He), 流速为1.0 mL·min-1; 进样口温度250 ℃, 柱温50 ℃, 以5 ℃·min-1的升温速度升至100 ℃, 保持2 min, 然后以4 ℃· min-1的升温速度升至160 ℃, 保持2 min, 最后以10 ℃·min-1的升温速度升至230 ℃, 保持2 min。
MS条件 离子源温度230 ℃; 电子电离源; 电子能量70 eV; 质量扫描范围(m/z) 50~500。
GC-MS定性定量方法 通过NIST谱库检索为主, 结合人工解析质谱图; 通过分离出的挥发性成分的保留时间和质核比与文献值对比, 进行GC-MS检测结果的鉴定, 并采用峰面积归一化法对黄芪挥发性成分进行半定量分析。
统计与分析 运用MetaboAnalyst绘制挥发性成分热图, 并进行聚类分析; SIMCA-P软件对GC-MS数据进行PCA和PLS-DA等分析, 利用得分图和载荷图分析挥发性成分在不同产地黄芪分组中的权重影响, 再根据变量对分组的贡献值(VIP), 找出不同产地间差异的化合物。
结果与分析 1 GC-MS定性定量分析本实验对18批3个不同产地黄芪挥发性成分进行了定性和定量分析。3个产地黄芪挥发性成分总离子流图见图 1。通过NIST商业数据库、质核比和保留时间进一步确定目标化合物, 鉴定出的成分见表 2。运用峰面积归一化法对黄芪挥发性成分进行半定量分析。运用MetaboAnalyst绘制不同产地黄芪挥发性成分热图见图 2。
热图的深浅代表化合物的含量多少, 颜色越深含量越高。3个不同产地黄芪样本中挥发性成分共鉴定出76个组分, 主要包括烯烃类14种、醇类11种、醛类10种、酸类8种、酮类7种、酯类7种、酚类5种、杂环类4种及少量其他种类化合物10种。热图Pearson聚类结果表明18个黄芪样本可以分成3类, 其中山西地区为一类(S1~S7);甘肃地区分为(S8~S15);内蒙古地区归为一类(S16~S18)。
2 挥发性成分PCA和PLS-DA分析 2.1 PCA分析PCA分析是通过降维的方法将原来变量重新组合成几个新的相互无关的变量, 以达到尽可能多地反映原来变量的信息[15]。为判别不同地区样品间的差异, 利用SIMCA-P对18批不同产地黄芪的GC-MS结果进行PCA分析, 共得到6个主成分, 累计R2X = 0.776 (代表模型的拟合能力), Q2 = 0.38 (代表模型的预测能力), PCA模型拟合度较好。
由图 3可见, 18批黄芪样本沿着PC1轴方向具有明显的区分趋势, 不同产地的黄芪样本仍可以有效区分, 与上述聚类分析结果一致, 完全按照其产地进行归类。山西地区为一类(S1~S7);甘肃地区分为(S8~S15);内蒙古地区归为一类(S16~S18)。由于PCA分析是一种无监督的模型验证方法, 其不能消除组内噪音。所以下面继续进行PLS-DA的分析, PLS-DA是一种有监督的模式, 能寻找隐藏的损坏模型稳健性的特征变量, 更能突出组间差异[16]。
由图 4可知, 3个不同产地黄芪样本得到有效区分, 证明不同产地黄芪挥发性成分上存在一定差异。模型的主成分回归系数Q2 = 0.932 > 0.5, 说明模型预测内能力较强, R2Y = 0.981, 说明模型对因变量变异贡献的百分比为98.1%, 说明模型拟合度较好。对建立的模型进行200次的置换检测, 结果见图 5。由图 5可知, 位于最右边的R2和Q2值均高于0.9, 远高于左边的R2和Q2值, 且Q2回归线截距为负值, 表明PLS-DA模型结果较好, 能够进行不同产地黄芪挥发性成分分析。
VIP值通常用来反映PLS-DA模型变量的重要性, VIP值越大, 变量越重要。根据PLS-DA模型, 绘制VIP图, 见图 6, 进行差异代谢物的筛选, 共筛选出21种差异代谢物。进一步对差异代谢物进行筛选, 选出VIP值最大的前6种差异代谢物。由图 6可知, 18批黄芪样本区分贡献较大的挥发性成分为己酸(VIP = 2.825)、正己醛(VIP = 2.363)、2-丁基-2-辛烯醛(VIP = 2.355)、正己醇(VIP = 2.119)、苯甲醇(VIP = 2.116)、2-丁基呋喃(VIP = 1.934)等。说明己酸、正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、正己醇、苯甲醇、2-丁基呋喃是区分山西、甘肃、内蒙古这3个黄芪主产区的特征性挥发性成分。对不同产地样品中这6个成分进行分析, 结果见图 7。
由图 7可知, 山西产黄芪中正己醛、2-丁基呋喃含量均高于其他两个地区; 己酸、正己醇、2-丁基-2-辛烯醛、苯甲醇含量均低于其他两个产地; 正己醇含量高于内蒙古地区, 低于甘肃地区。甘肃产黄芪中己酸、正己醇含量均高于其他两个地区; 正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、2-丁基呋喃含量均低于其他两个地区; 苯甲醇含量高于陕西地区, 低于内蒙古地区。内蒙古产黄芪苯甲醇、2-丁基-2-辛烯醛均高于其他两个地区。整体而言, 不同产地、栽培方式黄芪中正己醛和己酸比值存在很大差异, 其中山西仿野生芪中正己醛/己酸平均相对含量比值为7.8:1, 而内蒙古、甘肃栽培芪中正己醛/己酸的比值分别为2.3:1和0.96:1。
黄芪中挥发性成分含量的不同赋予黄芪特殊的豆腥味。黄芪的豆腥味不是一种挥发性成分作用, 是几种甚至十几种挥发性成分对人嗅觉共同作用的结果。6个特征化合物中, 己酸具有奶酪腐臭、油脂腥臭等气息[17]。己醛具有油脂和青草气, 低浓度己醛具有令人愉悦水果味清香, 高浓度会产生强烈的腐臭味, 有酸败的气味[18]。2-丁基-2-辛烯醛是熟的果汁香味伴有青香、甜香[19]。正己醇具有淡青嫩枝叶气息, 微带酒香、果香和脂肪气息。苯甲醇具有苦杏仁味和涩味[20]。2-丁基呋喃具有温和的果酒甜香。在这些挥发性成分形成过程中, 脂肪氧合酶(LOX)和脂过氧化物裂解酶(HPL)是形成这些物质的关键性酶。黄芪中的亚油酸、亚麻酸等多不饱和脂肪酸被脂氧合酶(LOX)氧化, 生成脂氢过氧化物, 而后再进一步被脂氢过氧化裂解酶(HPL)分解成醛类、醇类、酮类、酸类等小分子挥发性化合物。黄芪的挥发性成分是其中多不饱和脂肪酸经酶促反应的产物。本课题前期工作[9]表明, 山西仿野生黄芪中正己醛的含量和LOX活性呈正相关, 正己醛含量与LOX活性也有显著的正相关性; 而且正己醛含量与黄芪质量评价的两个重要指标(黄芪甲苷和多糖)含量具有明显的正相关性。说明挥发性成分可以成为评价黄芪质量的重要指标。通过挥发性成分与主要活性成分关联研究, 为阐明黄芪道地性科学内涵奠定了基础。
差异代谢物通路分析京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes, KEGG)是整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库。MetPA数据库通过代谢通路富集浓缩和拓扑分析, 能识别出可能受生物扰动的代谢通路, 并且可以对通路进行进一步筛选, 找到与差异代谢物最相关的关键性通路[21]。为了进一步了解差异代谢物在差异样品中代谢途径变化机制, 所以对差异代谢物进行通路富集浓缩和拓扑分析。将筛选出的21种差异代谢物上传至Metaboanalyst, 利用MetPA数据库根据代谢通路进行富集浓缩, 结果如表 3所示。
富集分析共标注到5个重要的代谢途径, 包括维生素K的代谢、长链脂肪酸的氧化反应、短链饱和脂肪酸的线粒体氧化、脂肪酸合成和丙酸的代谢。植物中脂肪酸分布广泛、种类繁多、具有很多重要的功能。细胞膜和细胞器膜主要由脂肪酸组成; 同时脂肪酸还可以帮助植物抵御外来侵袭如环境因素导致的热量和水分散失以及病原菌侵害; 甚至一些脂肪酸可以作为信号分子, 调控植物生长发育[22-25]。丙酸作为一种短链脂肪酸, 可以有效抑制好氧性细菌的繁殖[26]。维生素K是植物维生素的重要组成, 有报道表明维生素K3作为一种新型的植物生长调节剂, 对植物生长具有明显的促进作用, 可使植物更容易适应外部环境变化[27]。
讨论黄芪用药以“豆腥味浓者, 为佳”, 其中豆腥味是经验鉴别中一个十分重要的评价指标。黄芪中主要挥发性成分(正己醛)与所含的化学成分(黄芪甲苷和多糖)含量有直接的关联[9]。挥发性成分一定程度上能反映药物的内在本质, 是中药外在质量表现与内在物质基础的关联点[28]。产地与中药道地性形成密不可分, 黄芪挥发性差异化合物与产地密切相关[29]。本研究以我国3个黄芪主要产地18批蒙古黄芪样本作为研究对象, 首先采用SPME结合GC-MS技术对不同产地黄芪样本挥发性成分进行分析鉴定, 比较不同产地样品挥发性成分差异。本实验共鉴定出76种挥发性成分, 利用多元统计分析发现不同产地黄芪挥发性成分根据产地的不同可以分成3类。通过PLS-DA模型VIP值进一步分析发现己酸、正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、正己醇、苯甲醇、2-丁基呋喃是区分不同产地黄芪样本主要差异成分来源, 其中不同产地、栽培方式黄芪中正己醛和己酸比值存在较大差异, 山西仿野生芪中正己醛/己酸平均相对含量比值为7.8:1, 而内蒙古、甘肃栽培芪中正己醛/己酸的比值分别为2.3:1和0.96:1。本文通过黄芪挥发性成分研究为黄芪道地性特征研究奠定了基础, 并为黄芪药材的道地性判别提供了新的科学依据。
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