2. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室, 江苏 南京 210023;
3. 南京中医药大学药学院, 江苏 南京 210023
2. Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medical, Nanjing 210023, China;
3. School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种全身性骨代谢疾病, 在中国大陆慢性病中发病率高居第3位[1], 其特征在于骨量和微结构的全身性损伤, 导致脆性骨折。目前研究认为衰老、雌激素水平下降等多种因素引起的氧化应激是OP发生的重要原因[2]。体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平过高, 可导致线粒体肿胀, 线粒体膜通透性增加, 功能降低, 从而进一步加剧ROS产生, 诱导细胞凋亡[3]。成骨细胞是参与骨骼形成的主要细胞, 其过度凋亡会影响骨骼修复, 导致OP[4]。
目前, 临床用于OP治疗的一线药物主要是双磷酸盐类, 但长期使用会增加非典型骨折、骨坏死等不良反应风险[5]。中医药治疗OP具有显著的潜力和优势, 正逐渐被接受和使用。中医药治疗OP主要以滋补肝肾、养肾健脾和活血化瘀为主。白芍具有补血、柔肝和滋阴等作用, 是组成治疗OP中药复方制剂的重要单味药之一, 其使用频率可达约1/3[6]。白芍的主要化学成分是萜类和酚类化合物。已有报道[7]证实芍药苷等萜类化合物具有抗OP的活性。而以1, 2, 3, 4, 6-五没食子酰葡萄糖(1, 2, 3, 4, 6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose, PGG)为代表的酚类活性成分尚未获得重视。已有研究表明, 酚类化合物可促进成骨细胞增殖、分化, 对成骨细胞具有保护作用, 并且该作用可能与抗氧化作用有关[8]。然而, PGG对成骨细胞是否具有保护作用尚未见报道。核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)是抗氧化的重要信号通路, 能调控下游多种抗氧化酶表达, 如血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)[9]。本文旨在通过斑马鱼OP模型观察PGG的骨保护作用, 并进一步探讨其在氧化应激环境下对成骨细胞的作用及其与Nrf2/HO-1通路的关系。
材料与方法实验动物与细胞 AB品系受精后1天(1 day post fertilization, 1 dpf)斑马鱼, 购自江苏凯基生物技术股份有限公司。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)提取于1~2周龄的SD大鼠, 前成骨细胞系MC3T3-E1购自中国科学院上海细胞库。
主要试剂 PGG(上海源叶生物有限公司, 批号: lw16041905, 纯度为99.9%); 17β-雌二醇(17β-estradiol, E2, Sigma公司); 茜素红染液(武汉谷歌生物科技有限公司); HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix For qPCR (+ g DNA wiper) (Vazyme Biotech公司); Bcl-2抗体、Bax抗体、Nrf2抗体、β-tublin抗体(Proteintech公司); HO-1抗体(Santa Cruz biotechnology公司); Hoechst 33342试剂盒、活性氧检测试剂盒、JC-1检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天公司); 泼尼松龙(prednisolone, Pred)、钙黄绿素(上海源叶生物有限公司)。
主要仪器 酶标仪(Bio-Tek, 型号: SyneRgy2)、电泳仪(型号: mini-protean powerpac basic)、数字化凝胶成像工作站(型号: ChemiDocTMRS+) (美国BIO-RAD公司); 体式显微镜(型号: stemi 2000-C); 活细胞工作站(AXIO vert A1) (德国ZEISS公司)。
斑马鱼实验 挑选出培养2天后卵健康的3 dpf斑马鱼随机分为6组:空白组、Pred组、阳性药E2组(1×10-8 mol·L-1)、PGG组(1×10-10、1×10-9、1×10-8 mol·L-1), 置于6孔板中, 每孔给予3 mL培养基。从3 dpf开始, 空白组斑马鱼培养基中含0.1%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO), Pred组及其他各加药组参照文献[10]方法选取含0.1% DMSO的Pred (25 μmol·L-1)。从5 dpf开始给药, 空白组斑马鱼培养基不变, Pred组按Pred (25 μmol·L-1)给药, E2组选取含0.1% DMSO对应浓度给药, PGG组按0.1% DMSO对应浓度给药, 每天换液, 连续给药4天。为了检测斑马鱼幼鱼椎骨钙沉积, 进行钙黄绿素染色, 将9 dpf的斑马鱼置于二次蒸馏水中静置1 h, 除去斑马鱼体表药物, 然后将斑马鱼放于暗室中, 用0.2%钙黄绿素(pH 7)孵育1 h, 最后在水中漂洗3次, 并在二次蒸馏水中再静置1 h, 除去未结合染液。置于荧光显微镜下观察拍照。
细胞培养 MC3T3-E1细胞及BMSCs均用含10%热灭活胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基, 在37 ℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中进行培养。隔天换液, 当细胞长至85%左右时, 用含0.02%乙二胺四乙酸的0.25%胰酶消化。
茜素红染色检测钙化结节 BMSCs以5×104个/孔接种于24孔板中, 分为空白组、PGG组(1×10-10、1×10-9、1×10-8 mol·L-1)。细胞贴壁24 h后, 空白组加入成骨细胞分化液, PGG组加入含有相应浓度药物的成骨细胞分化液, 每3天换1次分化液。分化第14天时, 每孔加入4%多聚甲醛1 mL固定10 min, 磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤2次, 加入500 μL茜素红染液染色5 min, 三蒸水洗净, 置于显微镜下拍照。
RT-qPCR检测Runx 2、OCN mRNA水平 通过总RNA提取试剂(Vazyme Biotech公司)分离和纯化总RNA。使用Synergy 2多模式微孔板读数器测定RNA浓度。然后, 使用ABI 7500测序检测系统(Applied Biosystems)和AceQ®qPCRSYBR®两个母体混合系统(Vazyme Biotech, Q111-02)进行qRT-PCR, 每组设置3个复孔, 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参, 计算复孔的Ct平均值, 按照2-ΔΔCt相对定量计算公式得到相对定量结果。序列如下表 1。
MTT检测细胞活力 MC3T3-E1以每孔含培养液200 μL, 1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中。细胞分为6组, 分别为空白组、过氧化氢组(hydrogen peroxide, H2O2, 400 μmol·L-1), PGG组(1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol·L-1), 每孔各设置3个复孔。细胞贴壁24 h后, 除空白组外, 进行H2O2损伤, 4 h后除去上清。空白组、H2O2组加入含0.1% DMSO的α-MEM培养液200 μL, PGG组加入含对应浓度PGG的培养液200 μL。孵育24 h后弃除板中培养液, 每孔加入MTT溶液(5 mg·mL-1) 10 μL和不含血清的α-MEM培养基100 μL, 4 h后弃去培养上清, 每孔加入DMSO 150 μL, 使用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度(A)值。
Hoechst 33342染色检测细胞凋亡 细胞按5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中, 分为4组:空白组、H2O2组、E2组(1×10-8 mol·L-1)和PGG组(1×10-9 mol·L-1), 每组设置3个复孔。给药24 h后, PBS洗涤2次, 将染液用PBS稀释100倍, 每孔加入50 μL稀释后的染液, 细胞培养箱孵育10 min。吸除含染料的培养液, PBS洗涤2~3次即可在荧光显微镜下观察。
DCFH-DA荧光染色检测ROS水平 细胞按3×104个/孔接种于24孔细胞培养板中, 分为4组:空白组、H2O2组、E2组(1×10-8 mol·L-1)和PGG组(1×10-9 mol·L-1), 每组设置3个复孔。给药24 h后弃去培养基, 用PBS冲洗2次, 加入DCFH-DA (10 μmol·L-1), 于37 ℃孵育20 min, PBS洗涤2~3次, 置于荧光显微镜下观察拍照。
JC-1荧光染色检测线粒体膜电位 细胞按3×104个/孔接种于24孔细胞培养板中, 分为4组:空白组、H2O2组、E2组(1×10-8 mol·L-1)和PGG组(1×10-9 mol·L-1), 每组设置3个复孔。给药24 h后弃去培养基, 用PBS冲洗2次, 加入JC-1染液工作液, 于37 ℃孵育20 min, PBS洗涤2~3次再置于荧光显微镜下观察。
细胞核、细胞质蛋白Nrf2提取 接种1×106个细胞于100 mm×60 mm大皿中, 细胞分为6组, 分别为空白组、H2O2组、PGG组(1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol·L-1)。按说明书步骤提取细胞核及胞质内蛋白。
Western blot检测Bcl-2和Bax、Nrf2、HO-1蛋白的表达 细胞以3×105个/孔接种于6孔细胞培养板中, 每孔含培养液1.5 mL。细胞分为6组, 分别为空白组、H2O2组、PGG组(1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol·L-1)。每孔各设置3个复孔。给药24 h后, 按照BCA试剂盒说明书对细胞中总蛋白含量进行测定, 加上样缓冲液, 100 ℃变性10 min。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离, 转移至PVDF膜上, 5%脱脂牛奶封闭1 h, 再分别于Bcl-2抗体(1:1 000)和Bax抗体(1:1 000)、HO-1抗体(1:1 000)、Nrf2抗体(1:1 000)、β-tublin (1:1 000)中过夜(4 ℃), 次日TBST洗膜3次, 包被二抗, 曝光, 以β-tublin作为内参。
统计学分析 实验结果采用x±s表示, 使用Graphpad Prism 7.0软件中单因素方差分析方法比较各组间差异, 运用Dunnett检验方法进行组间比较, P < 0.05具有统计学意义。
结果 1 PGG改善斑马鱼骨质疏松钙黄绿素染色结果所示, 与空白组相比, Pred组斑马鱼椎骨节数减少, 椎骨面积减少; 与Pred组相比, E2 (1×10-8 mol·L-1)和PGG (1×10-9、1×10-8 mol·L-1)可以显著增加斑马鱼椎骨节数与面积, 促进骨形成(图 1)。该结果显示, PGG可以改善斑马鱼OP模型, 促进骨形成, 具有骨保护作用。
茜素红染色结果所示, 在BMSCs分化第14天时, 与空白组相比, PGG (1×10-9、1×10-8 mol·L-1)出现大量钙化结节, 并且可以显著提高成骨分化指标Runx 2、OCN的mRNA水平(P < 0.05或P < 0.01)。见图 2。
MC3T3-E1在H2O2的干预下, 细胞活力明显降低(P < 0.01), 当加入1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol·L-1 PGG时, 可明显升高MC3T3-E1的细胞活力(P < 0.01或P < 0.001)。见图 3。该结果显示, PGG可提高氧化应激环境下MC3T3-E1的细胞活力, 在1×10-9 mol·L-1浓度下已有显著作用。因此, 本研究选择该浓度进行后续实验。
Hoechst 33342染色结果显示, 与空白组相比, H2O2组细胞核发生形态皱缩, 出现明亮、致密浓染的凋亡细胞; 与H2O2组相比, E2、PGG组具有凋亡特征的细胞核数目明显减少。并且, 与空白组相比, H2O2组可促使抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达降低, 促凋亡蛋白Bax表达升高, Bcl-2/Bax比率显著降低(P < 0.05);与H2O2组相比, PGG促进Bcl-2蛋白的表达, 降低Bax蛋白的表达, 显著提高了Bcl-2/Bax的比率(P < 0.01)。见图 4。
DCFH-DA荧光染色结果显示, H2O2组细胞内ROS荧光密度值显著高于空白组(P < 0.001);与H2O2组相比, E2、PGG组细胞内的ROS荧光密度值显著降低(P < 0.01)。见图 5。结果表明, PGG可清除氧化应激环境下MC3T3-E1细胞内的ROS。
JC-1荧光染色结果显示, 与空白组相比, H2O2组绿色荧光增强, 红色荧光减弱, 合并图偏绿代表线粒体膜电位下降; 与H2O2组相比, E2、PGG组绿色荧光减弱, 红色荧光增强, 合并图偏黄代表线粒体膜电位提高。见图 6。结果表明, PGG可改善氧化应激环境下MC3T3-E1细胞的线粒体功能障碍。
与空白组相比, H2O2组核内Nrf2表达降低, 胞质内Nrf2表达升高; 与H2O2组相比, PGG可促进核内Nrf2表达, 降低胞质内Nrf2表达。同时, H2O2可降低Nrf2下游蛋白HO-1表达, PGG可升高HO-1表达。见图 7。结果表明, PGG可能通过Nrf2/HO-1通路发挥对氧化应激环境下MC3T3-E1的保护作用。
机体步入衰老期后, 体内氧化应激水平升高, 骨吸收速率超过骨形成速率, 骨重建失衡形成OP[11]。目前, 抑制破骨细胞介导的过度骨吸收是治疗OP的主要策略, 而对成骨细胞介导骨形成的干预研究相对较少, 促进骨形成治疗OP的策略已经成为一个新热点。白芍在治疗OP方剂中常被重用, 用量约10~15 g。作为白芍的主要活性成分, 芍药苷被发现可通过调节NF-κB信号通路抑制骨吸收, 并可抑制成骨细胞凋亡、促进骨形成从而改善OP[12, 13]。PGG在白芍中是仅次于芍药苷的标志性成分, 含量高达约20 mg·g-1 [14]。然而PGG对OP的干预效应尚未见报道。研究发现多酚类化合物可促成骨细胞矿化从而促进骨形成, 同时也具有抗成骨细胞凋亡和抑制骨吸收的作用, 该作用可能与其抗氧化能力有关[15]。PGG是一种典型的多酚化合物, 其抗氧化能力也早已被证实。Ahn等[16]发现PGG可增强超氧化物歧化酶的活性, 清除细胞内ROS水平, 可延长秀丽隐杆现虫的寿命。Choi等[17]发现PGG在神经2A细胞中可增强HO-1的表达, 对保护神经细胞有很大的潜力。本研究证实了作为白芍代表性活性成分PGG具有显著的骨保护作用。
成骨细胞起源于骨髓基质的间质细胞, 在骨形成过程中经历增殖、分化、基质矿化及凋亡等过程。本研究采用泼尼松龙诱导的斑马鱼OP模型在整体上观察了PGG对OP的作用。斑马鱼与人类基因高度同源, 具有体积小、产卵量多、发育迅速、胚胎透明, 可直接在体观察骨骼发育等特点, 是研究OP的理想模式生物[18]。泼尼松龙作为糖皮质激素类药物, 过量使用会导致体内氧化应激水平升高, 骨吸收增强, 骨形成抑制, 使骨量降低最终导致OP[19]。泼尼松龙诱导的OP模型已获得广泛应用。Zhao等[20]运用25 μmol·L-1 Pred成功建立了斑马鱼OP模型, 并验证了淫羊藿低糖苷组分有良好的抗斑马鱼OP作用。本课题组也运用该模型, 用钙黄绿素染色观察斑马鱼脊椎骨荧光强度, 证明了藁本内酯及芍药苷对斑马鱼OP模型有明显改善作用[10, 13]。本研究结果表明PGG可显著增加斑马鱼椎骨节数, 增加斑马鱼骨量, 促进骨形成, 对斑马鱼OP模型有明显改善作用。在成骨分化过程中, Runx 2主要调节骨基质蛋白的表达, 是分化早期的标志物, OCN是中晚期成骨细胞形成的标志物, 其可通过与钙及羟基磷灰石结合促进骨形成。本研究体外进行了BMSCs分化实验, 进一步验证PGG促进骨形成的作用。结果显示, PGG可促进BMSCs产生大量钙化结节, 并可提高Runx 2、OCN mRNA水平, 促进骨形成。
在骨形成过程中, 成骨细胞凋亡引起成骨减少, 抑制其凋亡对促进骨形成至关重要。研究表明, 氧化应激水平升高是导致成骨细胞凋亡的重要因素[21]。体内过高的ROS水平会引发线粒体膜电位降低, ATP产生减少, 导致线粒体结构和功能受损, 加速细胞凋亡。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之间的平衡控制细胞线粒体凋亡途径[22]。ROS水平过高时, Bax促进线粒体通透性转换孔(PTP)开放, 导致线粒体结构和功能的紊乱, 线粒体的内、外膜依次裂解, 释放出细胞色素C, 诱导细胞凋亡, Bcl-2作用与之相反[23]。本研究发现, 氧化应激环境下PGG可上调Bcl-2蛋白的表达, 降低Bax蛋白的表达, 清除细胞内的ROS, 恢复线粒体膜电位, 具有抗成骨细胞凋亡的作用。Nrf2是细胞氧化还原稳态的主要调节因子。在生理条件下, Nrf2分布于细胞质内, ROS水平过高时, Nrf2易位至细胞核, 激活下游抗氧化基因HO-1的表达。HO-1可催化血红素分解释放胆绿素, 然后进一步降解为抗氧化活性更强的胆红素[24], 清除细胞内的ROS。本研究进一步发现, PGG在氧化应激环境下对成骨细胞的保护作用可能与促进Nrf2入核、增强HO-1表达有关。
综上所述, 体内外实验证明, PGG可促进骨形成, 具有骨保护作用, 该作用可能与激活Nrf2/HO-1通路, 改善线粒体功能从而抗成骨细胞凋亡有关。本研究为临床应用PGG治疗OP提供了依据, 为OP治疗药物发现提供了新思路。
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