姜皮为姜科多年生草本植物姜(Zingiber officinale Roscoe.)的干燥皮质部分^[1]。干姜性热、味辛, 归脾、胃、心、肺经, 具有温经散寒, 回阳通脉, 温肺化饮之功^[2]; 而姜皮性凉、味辛; 归脾、肺经, 具有行水消肿的功效, 主治水肿初起, 小便不利^[3], 两者的性味归经和功效均有所差异^[4], 因而干姜是否去皮入药应由病症需求而定。为了明确姜皮的药效物质, 需对姜皮中化学成分进行系统的研究, 本实验采用Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、ODS、硅胶和半制备高效液相等多种色谱分离技术从姜皮含水乙醇提取物中分离得到7个萜类化合物, 分别是(4R, 6S)-1-(羟甲基)-5, 5-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-4-醇(1)、4-(羟甲基)-1-(异丙基)-2-烯-3, 4-二醇(2)、3, 5, 6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one (3)、3-(3-hydroxybutyl)-2, 4, 4-trimethyl-2, 5-cyclohexadien-1-one (4)、angelicoidenol (5)、grasshopper ketone (6)和dihydrophaseic acid (7)。其中, 其中化合物1、2为新化合物, 化合物3~7均为首次从该植物中得到, 结构见图 1。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Structures of compounds 1-7

化合物1  黄色油状物。$\left[ \alpha \right]_{\rm{D}}^{20}$ +40.5 (c 0.30, CHCl₃); HR-ESI-MS [M+Na]⁺ m/z为191.104 1 (Calcd. 191.104 3); IR显示该结构中含有羟基(3 382 cm^-1)、双键(1 589 cm^-1); UV (MeOH) λ_max (log ε): 203 (1.04) nm, 即化合物1分子式为C₁₀H₁₆O₂, 不饱和度为3。其¹H NMR谱显示2个甲基质子信号δ_H 0.83 (3H, s, H-9)、δ_H 1.21 (3H, s, H-10), 3个亚甲基质子信号δ_H 2.23 (2H, m, H-3)、δ_H 3.90 (2H, m, H-8)、δ_H 1.50 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-7a)、δ_H 2.37 (1H, dd, J = 8.2, 6.6 Hz, H-7b), 2个次甲基质子信号δ_H 2.03 (1H, dd, J = 6.6, 2.1 Hz, H-6)、δ_H 5.56 (1H, m, H-2)。¹³C NMR谱和DEPT谱显示10个碳信号, 包括3个季碳δ_C 148.4 (C-1)、δ_C 45.5 (C-5)、δ_C 75.7 (C-4), 3个亚甲基碳δ_C 65.3 (C-8)、δ_C 39.1 (C-3)、δ_C 41.1 (C-7), 2个次甲基碳δ_C 120.8 (C-2)、δ_C 39.8 (C-6)和2个甲基碳δ_C 21.7 (C-10)、δ_C 19.1 (C-9)。综合上述质谱、¹H和¹³C NMR谱数据, 可推测化合物1为一个单萜化合物。化合物1的¹H-¹H COSY谱中(图 2), 可观察到δ_H 5.56 (H-2)与δ_H 2.23 (H-3)的相关, δ_H 2.03 (H-6)与δ_H 2.37 (H-7b)的相关。HSQC谱中, δ_H 5.56 (H-2)与δ_C 120.8 (C-2)相关, δ_H 3.90 (H-8)与δ_C 65.3 (C-8)相关, δ_H 1.50 (H-7a)、δ_H 2.37 (H-7b)与δ_C 41.1 (C-7)相关, δ_H 2.03 (H-6)与δ_C 39.8 (C-6)相关, δ_H 2.23 (H-3)与δ_C 39.1 (C-3)相关, δ_H 1.21 (H-10)与δ_C 21.7 (C-10)相关, δ_H 0.83 (H-9)与δ_C 19.1 (C-9)相关, 进一步确定了C-H的数据归属。HMBC谱中(图 2), δ_H 3.90 (H-8)与δ_C 39.8 (C-6)、δ_C 148.4 (C-1)、δ_C 120.8 (C-2)有远程相关, 结合碳原子的化学位移值, 可以推断δ_C 65.3 (C-8)为连氧亚甲基碳并与C-1相连, 且C-1位于C-6与C-2之间。δ_H 0.83 (H-9)、δ_H 1.21 (H-10)均与δ_C 75.7 (C-4)、δ_C 45.5 (C-5)、δ_C 39.8 (C-6)有远程相关, 可以推断δ_C 19.1 (C-9)、δ_C 21.7 (C-10)为偕二甲基, 位于C-5上且C-5位于C-6与C-4之间。δ_H 2.23 (H-3)与δ_C 75.7 (C-4)、δ_C 45.5 (C-5)、δ_C 148.4 (C-1)、δ_C 120.8 (C-2)有远程相关, 综上所述, 表明结构中存在1个取代的环己烯片段。δ_H 1.50 (H-7a)、δ_H 2.37 (H-7b)与δ_C 75.7 (C-4)、δ_C 45.5 (C-5)、δ_C 39.8 (C-6)存在相关信号, 说明环己烯片段中环桥的存在。化合物1的两个手性碳均于桥环两端, 所以只存在两种绝对构型, 即(4S, 6R)和(4R, 6S), 比较化合物1与文献^[5]报道的5-hydroxynopol的结构式, 发现其差异仅在于1位上1-(羟乙基)替换成1-(羟甲基)。根据5-hydroxynopol的分子旋光值($\left[ \alpha \right]_{\rm{D}}^{20}$ -45.0)与化合物1的($\left[ \alpha \right]_{\rm{D}}^{20}$ +40.5)刚好相反且差异甚微, 推断化合物1与文献中5-hydroxynopol的绝对构型相反。综上所述, 确定化合物1的结构(4R, 6S)-1-(羟甲基)-5, 5-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-4-醇, 为新化合物。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 1H-1H COSY () and key HMBC (H→C, ) of compounds 1 and 2

化合物2  白色油状物。$\left[ \alpha \right]_{\rm{D}}^{20}$ +10.8 (c 0.11, MeOH); HR-ESI-MS [M+Na]⁺ m/z为209.114 3 (Calcd. 209.114 9); IR显示该结构中含有羟基(3 355 cm^-1)、双键(1 682 cm^-1); UV (MeOH) λ_max (log ε): 202 (1.13) nm, 即化合物分子式为C₁₀H₁₈O₃, 不饱和度为2。其¹H NMR谱显示2个甲基质子信号δ_H 1.02 (3H, dd, J = 6.8, 3.9 Hz, H-9)、δ_H 1.02 (3H, dd, J = 6.8, 3.9 Hz, H-10), 3个亚甲基质子信号δ_H 1.64 (1H, m, H-5a)、δ_H 1.75 (1H, m, H-5b)、δ_H 1.94 (1H, m, H-6a)、δ_H 2.19 (1H, m, H-6b)、δ_H 3.39 (1H, d, J = 11.1 Hz, H-7a)、δ_H 3.51 (1H, d, J = 11.1 Hz, H-7b), 3个次甲基质子信号δ_H 2.19 (1H, m, H-8)、δ_H 4.00 (1H, s, H-3)、δ_H 5.33 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-2)。¹³C NMR谱和DEPT谱显示10个碳信号, 包括2个季碳δ_C 147.7 (C-1)、δ_C 72.9 (C-4), 3个亚甲基碳δ_C 29.1 (C-5)、δ_C 24.2 (C-6)、δ_C 67.4 (C-7), 3个次甲基碳δ_C 121.1 (C-2)、δ_C 68.7 (C-3)、δ_C 35.8 (C-8)和2个甲基碳δ_C 21.7 (C-10)、δ_C 21.6 (C-9)。综合上述质谱、¹H和¹³C NMR谱数据, 可推测化合物2为一个单萜化合物。化合物2的¹H-¹H COSY谱中(图 2), 可观察到δ_H 5.33 (H-2)与δ_H 4.00 (H-3)相关, δ_H 1.64 (H-5a)与δ_H 1.94 (H-6a)相关。HSQC谱中, δ_H 5.33 (H-2)与δ_C 121.1 (C-2)相关, δ_H 2.19 (H-8)与δ_C 35.8 (C-8)相关, δ_H 3.39 (H-7a)、δ_H 3.51 (H-7b)与δ_C 67.4 (C-7)相关, δ_H 1.94 (H-6a)、δ_H 2.19 (H-6b)与δ_C 24.2 (C-6)相关, δ_H 1.64 (H-5a)、δ_H 1.75 (H-5b)与δ_C 29.1 (C-5)相关, δ_H 4.00 (H-3)与δ_C 68.7 (C-3)相关, δ_H 1.02 (H-10)与δ_C 21.7 (C-10)相关, δ_H 1.02 (H-9)与δ_C 21.6 (C-9)相关, 进一步确定了C-H的数据归属。HMBC谱中(图 2), δ_H 2.19 (H-8)与δ_C 24.2 (C-6)、δ_C 147.7 (C-1)、δ_C 121.1 (C-2)有远程相关, 结合碳原子的化学位移值, 可以推断δ_C 35.8 (C-8)与C-1相连且C-1位于C-6与C-2之间。δ_H 1.02 (H-9)、δ_H 1.02 (H-10)均与δ_C 147.7 (C-1)、δ_C 35.8 (C-8)有远程相关, 可以推断δ_C 21.6 (C-9)、δ_C 21.7 (C-10)为偕二甲基, 位于C-8上。δ_H 3.39 (H-7a)、δ_H 3.51 (H-7b)与δ_C 72.9 (C-4)、δ_C 29.1 (C-5)、δ_C 68.7 (C-3)有远程相关, 结合碳原子的化学位移值, 可以推断δ_C 67.4 (C-7)为连氧亚甲基碳并与C-4相连且C-4位于C-5与C-3之间。综上所述表明结构中存在1个取代的环己烯片段。化合物2的NOESY谱中(图 3), 可见3-OH和4-OH相关, 证明3-OH和4-OH在同侧, 由此化合物2的相对立体构型被确定。综上所述, 化合物2的结构确定为4-(羟甲基)-1-异丙基环己-2-烯-3, 4-二醇, 为新化合物。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Key NOESY () of compound 2

Bruker AVANCE Ⅲ 500型核磁共振仪(TMS内标); Bruker maxis HD型飞行时间质谱(德国布鲁克公司); AB SCIEX Qtrap 5500液质联用仪(美国AB SCIEX公司); Rudolph AP-Ⅳ型旋光仪(美国鲁道夫公司); 赛谱锐思LC50型高压制备液相色谱仪(赛谱锐思北京科技有限公司); Thermo Nicolet IS 10红外光谱仪(上海斯迈欧分析仪器有限公司); Thermo EV0300紫外分光光度计(美国热电公司); Agilent 1260 Infinity ⅡLC高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司); YMC-Pack ODS-A色谱柱(10 mm×250 mm, 5 μm, 12 μm, 日本YMC有限公司); Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20 (日本三菱化学公司); Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech公司); GF254硅胶薄层板(青岛海洋化工厂)。分析纯和色谱纯试剂(天津四友精细化学品有限公司)。

姜皮购自于安徽亳州市, 2018年5月产于四川宜宾市, 经河南中医药大学董诚明教授鉴定姜皮为姜科多年生草本植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥皮质部分, 实验留样保存在BS630房间, 标本号: JP20180603。

姜皮40 kg, 50%含水乙醇加热回流提取3次, 每次200 L、2 h, 提取液减压浓缩成稠浸膏状, 稀释到适当浓度后过滤, 上Diaion HP-20大孔吸附树脂柱, 依次用水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脱得到6个洗脱组分。其中, 10%组分经乙酸乙酯萃取后得10%乙酸乙酯组分, 通过硅胶柱色谱, 梯度洗脱(二氯甲烷-甲醇)共得到5个组分(Fr.1~Fr.5)。Fr.1通过Sephadex LH-20柱色谱, 等度洗脱(纯甲醇), 得到Fr.1-1~Fr.1-3。Fr.1-3通过半制备液相分离纯化得到化合物1 (15.3 mg)。Fr.2通过半制备液相分离纯化得到化合物2 (4.5 mg)、5 (2.4 mg)、6 (3.5 mg)和7 (2.3 mg)。30%组分通过MCI柱色谱(甲醇-水)共得到6个组分(Fr.A~Fr.F)。Fr.D经硅胶柱色谱, 梯度洗脱(二氯甲烷-甲醇)共得到Fr.D-1~Fr.D-4。Fr.D-1通过Sephadex LH-20柱色谱, 等度洗脱(纯甲醇), 得到Fr.D-1-1~Fr.D-1-3。Fr.4-D-2通过半制备液相分离纯化得到化合物3 (3.7 mg)和4 (2.8 mg)。

化合物1  黄色油状物, $\left[ \alpha \right]_{\rm{D}}^{20}$ +40.5 (c 0.30, CHCl₃); HR-ESI-MS [M+Na]⁺ m/z: 191.104 1 (Calcd. 191.104 3), 分子式为C₁₀H₁₆O₂; IR (υ_max) 3 382、1 589、992、932、912、894、844 cm^-1, UV (MeOH) λ_max (log ε): 203 (1.04) nm。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD)和¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD)数据见表 1。

表1(Table 1)

Table 1 1H NMR (500 MHz in CD3OD) and 13C NMR (125 MHz in CD3OD) spectral data of compounds 1 and 2 Position 1 2 δH δC δH δC 1 148.4 147.7 2 5.56 (1H, m) 120.8 5.33 (1H, d, J = 1.2 Hz) 121.1 3 2.23 (2H, m) 39.1 4.00 (1H, s) 68.7 4 75.7 72.9 5 45.5 1.64 (1H, m), 1.75 (1H, m) 29.1 6 2.03 (1H, dd, J = 6.6, 2.1 Hz) 39.8 1.94 (1H, m), 2.19 (1H, m) 24.2 7 1.50 (1H, d, J = 8.2 Hz) 2.37 (1H, dd, J = 8.2, 6.6 Hz) 41.1 3.39 (1H, d, J = 11.1 Hz) 3.51 (1H, d, J = 11.1 Hz) 67.4 8 3.90 (2H, m) 65.3 2.19 (1H, m) 35.8 9 0.83 (3H, s) 19.1 1.02 (3H, dd, J = 6.8, 3.9 Hz) 21.6 10 1.21 (3H, s) 21.7 1.02 (3H, dd, J = 6.8, 3.9 Hz) 21.7

Table 1 1H NMR (500 MHz in CD3OD) and 13C NMR (125 MHz in CD3OD) spectral data of compounds 1 and 2

化合物2  白色油状物, $\left[ \alpha \right]_{\rm{D}}^{20}$ +10.8 (c 0.11, MeOH); HR-ESI-MS [M+Na]⁺ m/z: 209.114 3 (Calcd. 209.114 9), 分子式为C₁₀H₁₈O₃; IR (υ_max) 3 355、1 682、925、842、801、770、723 cm^-1, UV (MeOH) λ_max (log ε): 202 (1.13) nm。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD)和¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD)数据见表 1。

化合物3  无色油状, 易溶于甲醇, ESI-MS [M-H]⁺ m/z: 241, 茴香醛-浓硫酸显色。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ_H 7.19 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 3.78 (1H, m, H-3), 2.30 (3H, s, H-10), 1.65, 2.33 (2H, m, H-4), 1.59, 1.30 (2H, m, H-2), 1.21 (3H, s, H-12), 1.20 (3H, s, H-11), 0.98 (3H, s, H-13); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ_C34.7 (C-1), 46.2 (C-2), 63.0 (C-3), 40.0 (C-4), 67.4 (C-5), 69.4 (C-6), 144.0 (C-7), 132.4 (C-8), 198.8 (C-9), 23.7 (C-10), 28.4 (C-11), 26.0 (C-12), 18.6 (C-13)。以上数据与文献^[6]报道的3, 5, 6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one基本一致。

化合物4  无色油状, 易溶于甲醇, ESI-MS [M+H]⁺ m/z: 209, 茴香醛-浓硫酸显色。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ_H 6.95 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 6.16 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-2), 3.83 (1H, m, H-9), 2.61, 2.40 (2H, m, H-7), 1.90 (3H, s, H-13), 1.60 (2H, m, H-8), 1.29 (6H, s, H-11, 12), 1.24 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-10); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ_C 187.1 (C-1), 124.6 (C-2), 158.7 (C-3), 40.8 (C-4), 164.1 (C-5), 130.9 (C-6), 26.5 (C-7), 37.3 (C-8), 67.4 (C-9), 21.9 (C-10), 24.5 (C-11), 24.7 (C-12), 10.1 (C-13)。以上数据与文献^[7]报道的3-(3-hydroxybutyl)-2, 4, 4-trimethyl-2, 5-cyclohexadien-1-one基本一致。

化合物5  黄色固体, 易溶于甲醇, ESI-MS [M-H]⁺ m/z: 169, 茴香醛-浓硫酸显色。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ_H 3.83 (1H, m, H-5), 3.75 (1H, m, H-2), 1.65, 2.25 (2H, m, H-3), 1.30 (1H, s, H-4), 1.30, 1.65 (2H, m, H-6), 1.07 (3H, s, H-10), 0.89 (6H, s, H-8, 9); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ_C 51.4 (C-1), 76.4 (C-2), 36.7 (C-3), 53.7 (C-4), 75.9 (C-5), 39.1 (C-6), 48.0 (C-7), 21.7 (C-8), 20.1 (C-9), 13.1 (C-10)。以上数据与文献^[8]报道的angelicoidenol基本一致。

化合物6  黄色固体, 易溶于甲醇, ESI-MS [M-H]⁺ m/z: 223, 茴香醛-浓硫酸显色。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ_H 5.81 (1H, s, H-8), 4.20 (1H, m, H-3), 2.18, 2.21 (2H, m, H-4), 1.90, 2.18 (2H, m, H-2), 1.35 (9H, s, H-10, 11, 12), 1.14 (3H, s, H-13); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ_C 37.0 (C-1), 50.0 (C-2), 64.4 (C-3), 49.7 (C-4), 72.4 (C-5), 120.0 (C-6), 211.5 (C-7), 101.1 (C-8), 200.9 (C-9), 26.5 (C-10), 29.3 (C-11), 32.3 (C-12), 30.8 (C-13)。以上数据与文献^[9]报道的grasshopper ketone基本一致。

化合物7  白色固体, 易溶于甲醇, ESI-MS [M-H]⁺ m/z: 281, 茴香醛-浓硫酸显色。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ_H 7.98 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-4), 6.52 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-5), 5.75 (3H, s, H-2), 4.10 (1H, m, H-9), 3.69, 3.79 (2H, m, H-12), 2.08 (3H, s, H-15), 1.72, 2.03 (2H, m, H-8), 1.62 (2H, m, H-10), 1.13 (3H, s, H-14), 0.92 (3H, s, H-13); ¹³C NMR (CD₃OD, 125 MHz) δ_C 169.6 (C-1), 119.2 (C-2), 151.5 (C-3), 131.8 (C-4), 135.2 (C-5), 83.2 (C-6), 87.8 (C-7), 46.0 (C-8), 66.0 (C-9), 44.5 (C-10), 49.4 (C-11), 77.3 (C-12), 16.4 (C-13), 19.7 (C-14), 21.3 (C-15)。以上数据与文献^[10]报道的dihydrophaseic acid基本一致。