2. 上海中药标准化研究中心, 上海 201203
2. Shanghai R & D Center for Standardization of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, China
菊三七(Gynura japonica)又称土三七, 是一种来源于菊科的民间植物药, 用于治疗跌打损伤及外伤出血症[1, 2]。然而, 大量研究表明菊三七中含有多种吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids, PAs), 主要包括千里光碱(senecionine)、千里光菲林碱(seneciphylline)、千里光碱氮氧化物(senecionine N-oxide)、千里光菲林碱氮氧化物(seneciphylline N-oxide)[1, 3, 4]。PAs是一种天然的毒性成分, 大部分PAs经细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)代谢活化产生活性中间体脱氢吡咯(dehydropyrrolizidine alkaloids, DHPAs)。DHPAs不稳定, 具有高度亲电活性, 可与体内大分子物质如蛋白结合产生吡咯蛋白加合物(pyrrole-protein adducts, PPAs), 进一步诱导肝毒性、肺毒性、基因毒性等[5-8]。PAs毒性最典型的为肝毒性, 急性肝毒性引起肝肿大、腹水、肝细胞坏死, 临床上表现为肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome, HSOS); 慢性毒性表现为肝纤维化和肝巨红细胞血症[9, 10]。
近年来, 因服用菊三七所导致HSOS的临床报道逐渐增多[11, 12], 已成为目前我国HSOS发病的主要原因[13-15]。然而, 临床尚无有效的治疗方法[16]。为更有效的诊断及治疗该疾病, 中华医学会消化病学分会肝胆疾病协作组建议将血液PPAs作为PAs致HSOS的诊断依据[17], 并已有研究初步证实了其用于临床PAs所致HSOS诊断的可行性[18-21]。课题组前期初步研究表明PPAs含量高低与菊三七PAs服用量有关, 但其动力学特征尚未有报道。因此, 本研究采用大鼠单次给药不同剂量的菊三七生成PPAs的药代动力学特征, 为其减毒/解毒策略的开发提供实验基础和理论依据。
材料与方法
仪器与试剂 Shimadzu CBM-30A高效液相色谱系统(Shimadzu Co, Kyoto, Japan), 连接ABSCIEX QTRAP6500质谱系统(AB SCIEX Co, CA, USA)。化学纯三氟化硼乙醚、氯仿、无水乙醇、硝酸银、丙酮均购自国药控股化学试剂有限公司(中国, 上海)。分析纯邻四氯苯醌、4-二甲氨基苯甲醛、野百合碱均购自Sigma公司(St. Louis, MO, USA)。色谱纯甲醇、乙腈、甲酸均购自Fisher公司(Santa Clara, CA, USA)。千里光碱购自成都普瑞法科技开发有限公司(纯度>98%)。Ehrlich试剂根据课题组前期报道方法配制[22]。菊三七采集自江苏省扬州市, 经作者鉴定为菊科菊三七属植物菊三七[Gynura japonica (Thunb.) Juel.], 去除泥沙等异物晾干, 临用前60 C烘干打粗粉。参考文献方法[4], 以95%乙醇回流提取3次, 得到菊三七提取物(GJE), 提取率为6.0%, 并根据课题组前期报道的含量测定方法[14]采用LC-MS分析GJE中主要PAs的含量。
动物实验 实验方案经上海中医药大学动物实验伦理委员会批准(PZSHUTCM190912019), 所有程序均严格按照动物使用和护理的伦理原则进行。雄性Sprague Dawley (SD)大鼠(200 ± 20 g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(合格证号:SCXK (沪) 2017-0005)。
单次灌胃不同剂量GJE与PPAs生成量及菊三七肝毒性的关系 实验动物适应性喂养3天后随机分为6组, 即空白对照组和不同剂量GJE给药组(0.062 5、0.25、0.5、2.0和4.0 g·kg-1), 每组8只。给药前禁食8 h, 自由饮水。大鼠单次灌胃给药后, 分别于2、12、24和48 h异氟烷麻醉, 眼眶静脉丛取血0.25 mL于1.5 mL离心管中, 室温静置2 h后800 ×g离心15 min分离血清并保存于-80 C。给药48 h后异氟烷麻醉大鼠, 并取肝脏置于组织固定液中, 用于苏木精-伊红染色(HE staining)。
单次灌胃不同剂量GJE生成PPAs的药代动力学研究 实验动物适应性喂养3天后随机分为2组, 即不同剂量GJE给药组(0.25和0.5 g·kg-1), 每组8只。大鼠单次灌胃给药后, 分别于10、20、30 min、1、2、4、6、12、24和48 h异氟烷麻醉, 眼眶静脉丛取血0.25 mL于1.5 mL离心管中, 室温静置2 h后800 ×g离心15 min分离血清并保存于-80 C。
样本制备 PPAs测定参考文献方法进行[15, 22]。取血清50 μL于1.5 mL离心管中, 加冰丙酮250 μL涡旋, 1 000 ×g离心5 min, 沉淀蛋白; 残渣(蛋白)用无水乙醇洗涤两次后加2% AgNO3的无水乙醇溶液200 μL, 室温振摇30 min, 4℃下、1 000 ×g离心5 min, 取上清与Ehrlich试剂(上清液:试剂=4:1, v/v)于55℃反应10 min, 置冰上中止反应。反应混合物于4℃下、15 000 ×g离心15 min, 取上清液进样分析。
LC-MS分析条件 色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm); 流动相为0.1%甲酸水-乙腈, 采用梯度洗脱:0~1 min, 10%乙腈; 1~6 min, 40%乙腈; 6~7 min, 95%乙腈; 7~10 min, 10%乙腈; 流速:0.4 mL·min-1; 柱温:45℃; 进样体积:2 μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI), 正离子模式采集, 喷雾电压5 500 V, 离子源温度550℃; 气帘气35 psi; 去簇电压160 V; 碰撞能46 V。以多反应检测(MRM)检测, 离子通道为:341>252 (定量离子对), 341>296 (定性离子对)。
数据分析 所有药代动力学参数由PK Solutions 2™软件的非房室模型进行拟合求算, 吸收速率常数(ka)、吸收半衰期(t1/2ka)、消除速率常数(ke)、消除半衰期(t1/2ke)、表观分布容积(Vd)、清除率(CL)、平均滞留时间(MRT)、达峰值浓度(Cmax)、达峰时间(tmax)。实验结果均以
结果
1 菊三七提取物中主要PAs含量分析参考课题组前期报道的菊三七中PAs含量测定方法[14], 对本研究制备GJE中主要PAs进行含量分析。结果表明, GJE中主要含千里光碱、千里光菲林碱及其氮氧化物(表 1), 总含量为50.8 mg·g-1。
大鼠单次灌胃不同剂量GJE (0.062 5~4.0 g·kg-1, 折合药材1.04~66.7 g·kg-1, PAs 3.18~203.2 mg·kg-1), 随着剂量的升高, 引起不同程度的损伤。如图 1所示, 与空白组相比, 给药0.062 5 g·kg-1剂量组大鼠无明显肝损伤, 0.25 g·kg-1开始出现肝窦扩张; 给药4.0 g·kg-1后, 肝窦扩张显著增大, 并且伴随着严重的肝窦出血、肝细胞点状坏死、脂肪空泡化及炎症。
大鼠单次给药不同剂量GJE后2、12、24和48 h, 分别测定血清中PPAs的含量。由表 2可知, 同一时间点PPAs含量随着给药GJE剂量的升高而升高, 且呈剂量依赖性(r =0.994 0~0.999 6)。给药后2~48 h, PPAs含量随采样时间而降低。
大鼠分别单次灌胃给药GJE 0.25和0.5 g·kg-1, 测定给药后10 min~48 h内不同时间点血清PPAs含量, 绘制血药浓度-时间曲线(图 2)并计算其药代动力学参数(表 3)。可知大鼠灌胃GJE后PPAs符合非房室模型, 进行拟合求算药动学参数。结果PPAs在体内的消除率随着给药剂量的增加明显减慢(t1/2e为591.3 ± 361.0 min, 约9.9 h; t1/2e为1 441.5 ± 422.2 min, 约24.0 h), 表明PPAs在大鼠体内的药代动力学受剂量的影响。
讨论
菊三七又名土三七, 为民间常用药, 因其名与五加科药用三七(Panax notoginseng)相似, 也同样具有止血、活血化瘀的功效[23], 被当作三七混淆使用, 是我国造成临床HSOS的主要原因。目前, 吡咯蛋白加合物(pyrrole-protein adducts, PPAs)已作为临床诊断PAs诱导HSOS的指标[15, 17-22, 24], 然而PPAs的含量受药物的用量、服药时间及采血时间的影响较大[20]。本研究利用大鼠研究不同剂量菊三七灌胃后生成PPAs的药代动力学特征。
药用三七的推荐服用量为每日不超过9 g[25], 折合大鼠等效剂量为1.05 g·kg-1。本研究中大鼠单次灌胃GJE提取物0.062 5~4.0 g·kg-1, 折合菊三七药材1.04~66.7 g·kg-1, 相当于临床等效剂量的1~64倍。在等效剂量, 菊三七未对大鼠造成明显肝损伤, 但4倍人临床等效剂量下可见显著的肝窦损伤(图 1), 且损伤程度随剂量增加而严重, 然而在最高剂量即64倍人临床等效剂量下未见大鼠死亡。患者服用菊三七的时间、剂量均会对其是否发病及发病的严重程度有所影响, 服用菊三七的剂量越大、时间越长, 其发病的几率及严重程度都更高[11]。本实验的结果也证明, 大鼠单次灌胃小剂量(即人等效剂量)的菊三七不会造成肝损伤, 与临床相符。此外, 血清PPAs生成量也随给药GJE剂量的升高而升高, 且呈剂量依赖性(r>0.99)。进一步研究了大鼠给药0.25和0.5 g·kg-1剂量GJE后生成PPAs的药代动力学特征。结果表明, 不同给药剂量下AUC0-t、MRT、Vd随剂量而明显增大, 而tmax和CL未见明显剂量依赖性。此外, 不同给药剂量t1/2a无明显差异, 但t1/2e随剂量而明显增大, 即PPAs在体内的消除率随着给药剂量的增加明显减慢(t1/2e0.25~591.3 min, 约9.9 h; t1/2e0.5~1441.5 min, 约24.0 h)。高剂量下肝损伤较为严重, 可能与PPAs清除较慢相关。
本研究也存在一定的缺陷。首先, PAs经CYP450酶代谢活化生成DHPAs, 并进一步与蛋白结合生成PPAs从而导致肝毒性[8]。然而目前明确报道可与DHPAs结合的蛋白结构仅有氢离子转运ATP酶线粒体F1复合体Β肽(ATP5B)[26]和血红素蛋白(hemoglobin)[27], 是否有其他蛋白以及其具体种类仍未明确。然而, 目前已有文献均采用AgNO3水解蛋白再与Ehrlich试剂进行衍生化反应, 以生成的衍生化产物来表征总PPAs的含量[15, 18-21, 26, 27]。采用本方法来测定大鼠灌胃菊三七提取物后生成PPAs的含量仍具有一定的代表性。其次, 根据菊三七致HSOS流行病学研究表明, 患者服用菊三七的方式多样, 包括水煮、泡酒、打粉吞服、切片泡茶等。由于提取方法的不同, 可能会影响提取物中PAs的种类和含量及其他非PAs成分如有机酸、黄酮类成分的含量, 不同成分之间亦可能产生代谢性相互作用, 从而影响到其各自及PPAs的药代动力学, 这将是本课题组后续工作的重点之一。因此, 本研究参考Lin等[15]报道, 以醇提物初步考察并了解大鼠灌胃菊三七生成PPAs的动力学特征。以本研究为基础, 进一步开展深入研究, 一方面丰富以PPAs含量作为PAs毒性的标识物, 另一方面将其作为药物干预是否有效的依据, 为PAs减毒及解毒策略的开发提供方法和理论参考, 以期有利于临床HSOS患者的预后和治疗。
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