药学学报  2020, Vol. 55 Issue (2): 289-293     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0716   PDF    
九蒸九晒熟地黄中的一个新生物碱
吕锦锦1,2, 张靖柯1,2, 张贝贝1,2, 刘娟娟1,2, 李孟1,2, 石静亚1,2, 朱登辉1,2, 杨航1, 郑晓珂1,2, 冯卫生1,2     
1. 河南中医药大学药学院, 河南 郑州 450046;
2. 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心, 河南 郑州 450046
摘要: 采用多种色谱技术从九蒸九晒熟地黄70%丙酮提取物中分离得到6个生物碱,根据化合物的理化性质及波谱特征对其结构进行鉴定,分别为地黄新碱A(4-{[(5-O-α-D-galactopyranosyloxy)methyl]-1H-pyrrole-2-carbaldehyde-1-yl}butyricacid methyl ester)(1)、baimantuoluoamide B(2)、capparisine C(3)、harman-3-carboxylic acid(4)、(2S)-1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]-5-oxopyrrolidine-2-carboxylate(5)和1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one(6)。其中,化合物1为新化合物,化合物2~6均首次从地黄中分离得到。采用细胞实时监控检测方法(RTCA)探究6个化合物对脂多糖(LPS)诱导的NRK-52e细胞损伤的干预作用,结果表明,化合物1~3对LPS诱导的NRK-52e细胞损伤均具有保护作用。
关键词: 熟地黄    化学成分    生物碱    NRK-52e细胞    RTCA    
A new alkaloid from Rehmanniae Radix Preparata
Lü Jin-jin1,2, ZHANG Jing-ke1,2, ZHANG Bei-bei1,2, LIU Juan-juan1,2, LI Meng1,2, SHI Jing-ya1,2, ZHU Deng-hui1,2, YANG Hang1, ZHENG Xiao-ke1,2, FENG Wei-sheng1,2     
1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;
2. Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Disease Diagnosis by Henan and Education Ministry of P. R. China, Zhengzhou 450046, China
Abstract: The chemical constituents of Rehmanniae Radix Preparata were prepared according to the traditional method of "jiu zheng jiu shai" and investigated using multiple chromatographic methods. Six alkaloids were isolated and their structures were elucidated from spectral data and physicochemical properties, as follows:rehmanniae alkaloid A (4-{[(5-O-á-D-galactopyranosyloxy)methyl]-1H-pyrrole-2-carbaldehyde-1-yl}butyric acidmethyl ester) (1), baimantuoluoamide B (2), capparisine C (3), harman-3-carboxylic acid (4), (2S)-1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]-5-oxopyrrolidine-2-carboxylate (5), and 1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one (6). Among them, compound 1 is a new alkaloid. Compounds 2-6 were newly isolated from Rehmannia glutinosa Libosch. The effect of compounds 1-6 on NRK-52e cell injury induced by LPS was investigated. The results show that compounds 1-3 exhibit protective effects against LPS-induced damage to NRK-52e cells.
Key words: Rehmanniae Radix Preparata    chemical compositions    alkaloids    NRK-52e cells    RTCA    

地黄是玄参科植物地黄Rehmanniag lutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根, 主产于河南、山东、山西等地, 以河南焦作为道地产区, 素有“怀地黄”之称, 与怀山药、怀牛膝、怀菊花, 并称“四大怀药”。熟地黄Rehmanniae Radix Preparata为生地黄的炮制加工品, 据2015版药典记载, 熟地黄味甘, 性微温, 归肝肾经, 具有补血滋阴, 益精填髓之功效[1, 2]。现代药理研究表明, 熟地黄具有抗氧化与抗衰老、抗肿瘤、抗突变、抗焦虑、抗疲劳、增强免疫力以及促进造血等方面的作用[3-5]。此外, 查阅文献发现地黄炮制后, 化学成分发生变化, 其中, 环烯醚萜类化合物, 如梓醇; 苯乙醇苷类化合物, 如毛蕊花糖苷, 以及紫罗兰酮类化合物等均发生了很大程度的降解。而还有一些成分, 如5-HMF、DDMP等含量却显著提高[6, 7], 但是目前对熟地黄的化学成分尚缺乏系统的研究。为了明确熟地黄中的化学成分, 本实验采用硅胶、ODS、Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40、薄层色谱以及半制备高效液相等多种色谱方法, 从熟地黄70%丙酮提取物中分离得到6个生物碱。利用MS、IR、UV、1D和2D NMR等波谱技术对其结构进行鉴定, 分别为地黄新碱A (4-{[(5-O-α-D-galactopyranosyloxy)methyl]-1H-pyrrole-2-carbaldehyde-1-yl}butyric acid methyl ester) (1)、baimantuoluoamide B (2)、capparisine C (3)、harman-3-carboxylic acid (4)、(2S)-1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]-5-oxopyrrolidine-2-carboxylate (5)和1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one (6)。其中化合物1为新化合物, 化合物2~6均首次从地黄中分离得到, 化合物结构见图 1。采用RTCA法探究6个化合物对脂多糖(LPS)诱导的NRK-52e细胞损伤的干预作用, 结果表明化合物1~3对LPS诱导的NRK-52e细胞损伤均具有保护作用。

图 1 Structures of compounds 1-6
结果与讨论 1 结构鉴定

化合物1白色油状物, 126.373 (c 0.017 1, CH3OH), ESI-MS m/z: 410.141 1 [M+Na]+ (calcd. for C17H25NO9Na, 410.142 1), 提示化合物的分子式为C17H25NO9。UV λmax (CH3OH)/nm (logε): 203 (1.40)、292 (1.68)。IR谱显示该化合物结构中含有羟基(3 364 cm-1)和羰基(1 640 cm-1)。在1H NMR (500 MHz, CD3OD)谱中, δH 9.44 (1H, s)为一尖锐的单峰信号, 结合该处氢质子的化学位移值, 可以确定为醛基氢信号; δH 6.98 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-3′)、6.36 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-4′)提示该化合物结构中, 可能存在一个吡咯环; δH 4.43 (2H, m, H-4)、2.04 (2H, m, H-3)、2.38 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2)提示结构中有3个-CH2-; δH 4.92 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-1″)以及δH 3.69~3.88 (6H, m), 推测该结构中可能有糖的结构片段, 且通过计算糖端基氢的偶合常数为3.8 Hz, 可确定该糖为α构型; δH 3.65 (3H, s, H-5)提示结构中有一个-OCH3存在。在13C NMR (125 MHz, CD3OD)谱中, 共给出17个碳信号, 结合DEPT 135谱可知, 共有3个季碳信号[δC 175.2、140.7、133.9, 其中δC 175.2为羰基的碳信号], 8个叔碳信号[δC 181.1、126.3、113.3、99.8、73.0、71.4、71.1、70.1, 其中δC 181.1为一个-CHO的特征碳信号], 5个仲碳信号[δC 62.9、61.4、45.9、31.7、27.6]和1个伯碳信号[δC 52.2, 为-OCH3的碳信号, 结合δC 175.2处的羰基碳信号, 确定该化合物中含有羧酸甲酯的结构片段]; 结合该化合物的氢谱, δC 140.7 (C-5′)、133.9 (C-2′)、126.0 (C-3′)、113.3 (C-4′)为吡咯环上的4个碳信号; δC 99.8 (C-1″)、73.0 (C-5″)、71.4 (C-3″)、71.1 (C-4″)、70.1 (C-2″)、62.9 (C-6″)推测为半乳糖的一组碳信号, 通过酸水解确定该糖为α-D-半乳糖。

1H-1H COSY谱中, δH 2.04 (2H, m, H-3)同时与δH 2.38 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2)、4.43 (2H, m, H-4)相关, 确定了-CH2CH2CH2-的结构片段(图 2)。通过HSQC谱, 进一步将化合物的C-H数据予以归属(表 1)。HMBC谱中, δH 2.38 (H-2)与δC 175.2 (C-1)相关, 可以确定-CH2CH2CH2COOCH3结构片段, 且由δH 4.43 (H-4)与δC 140.7 (C-5′)、133.9 (C-2′)均具有远程相关, 说明-CH2CH2CH2COOCH3连在吡咯环1′位N原子上; δH 4.60 (H-6′a)与δC 113.3 (C-4′)、140.7 (C-5′)相关, δH 9.44 (-CHO)与δC133.9 (C-2′)相关, 说明-CH2O-和-CHO分别连在吡咯环的C-5′位和C-2′位上; 糖的端基氢δH 4.92 (H-1″)与δC 61.4 (C-6′)相关, 说明半乳糖连在C-6′位上; 根据以上解析, 结合参考文献[8, 9], 确定该化合物为(4-{[(5-O-α-D-galactopyranosyloxy)methyl]-1H-pyrrole-2-carbaldehyde-1-yl}butyric acid methyl ester), 命名为地黄新碱A, 其1H NMR和13C NMR数据见表 1

图 2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表 1 1H NMR (500 MHz in CD3OD) and 13C NMR (125 MHz in CD3OD) spectral data of compound 1
2 化合物活性检测

采用细胞实时监控检测的方法(RTCA)探究6个化合物对脂多糖(LPS)诱导的NRK-52e细胞损伤的干预作用。结果表明, 化合物1~3对LPS诱导的NRK-52e细胞损伤均具有保护作用(表 2)。

表 2 The effect of compounds 1-6 on NRK-52e cell injury induced by LPS. Note: The Cell Index ratio is (experimental group-control group)/control group, and all groups are compared with the model group. *Cell Index ratio of > 10% indicates a significant difference
实验部分

Bruker AVANCE Ⅲ 500核磁共振仪(TMS内标) (Bruker); Bruker maxis HD mass spectrometer, Shimadzu UV-2401PC apparatus; Waters Alliance系列2695高效液相系统, Empower3色谱数据工作站; Thermo Nicolet IS10红外光谱仪(Thermo Scientific, USA); Rudolph AP-Ⅳ型旋光仪(Rudolph, USA); Thermo EVO300紫外分光光度计(Thermo Scientific, USA); LC-52型高压制备液相色谱仪[赛普锐思(北京)科技有限公司], UV200型紫外检测器, reprosil-Pur120 C18-AQ色谱柱(德国Dr. Maisch GmbH); CHIRALPAK AD-H色谱柱(大赛璐药物手性技术有限公司); OSB-2000型旋转蒸发仪、N-1111型冷冻水循环装置、NVP-1000型隔膜真空泵(上海爱朗仪器有限公司); 二氧化碳培养箱(上海STIK); 超净工作台(苏净集团); Arium 611 VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS); 倒置显微镜(Nikon); 细胞实时监控仪(ACEA, 美国)。

柱色谱填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20 (日本三菱化学公司); Toyopearl HW-40 (日本TOSOH公司); Sephadex LH-20 (Parmacia Biotech公司); 柱色谱用硅胶H (100~200目, 200~300目, 青岛海洋化工厂); 制备型薄层色谱硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司); 甲醇(色谱纯, 天津四友精细化学品有限公司); 乙腈(色谱纯, 美国天地有限公司TEDIA); 所用分析纯试剂均为天津市富宇精细化工有限公司及天津市致远化学试剂有限公司生产; D-半乳糖、L-半乳糖标准品(上海源叶生物科技有限公司); 培养皿、E-Plate板(ID725602, ACEA, 美国); NRK-52e细胞(中国科学院上海细胞库); 胰蛋白酶、DMEM高糖培养基(Gibco); 胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司), DMSO (Solarbio); LPS (Sigma, 美国); 水为超纯水, PBS缓冲液等为自配。

药材:熟地黄购自河南省禹州市青山药业有限公司(经九蒸九晒方法炮制), 留样标本存放于河南中医药大学药物化学实验室。

1 提取与分离

干燥熟地黄10 kg, 加10倍量70%的含水丙酮回流提取3次, 提取液过滤, 合并滤液进行减压浓缩, 真空干燥, 得到熟地黄总提取物浸膏(4.4 kg)。将总提物浸膏加3 L水溶解分散, 加95%乙醇调节至醇浓度80%进行醇沉, 静置24 h后, 取上清液, 减压浓缩得到总浸膏(2.7 kg)。浸膏加8 L水溶解, 上Diaion HP-20大孔吸附树脂柱, 按照极性由大到小依次用水、10% EtOH、20% EtOH、30% EtOH、50% EtOH、70% EtOH、95% EtOH进行梯度洗脱, 得到7个洗脱组分, 即Fr.1~Fr.7。

10% EtOH (Fr.2)洗脱组分(100 g)加水溶解, 进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离, 用不同比例的甲醇-水(甲醇:水=0:1→1:0)梯度洗脱, 洗脱组分经薄层硅胶检识, 合并相同组分, 得到6个组分, 即Fr.2-1~Fr.2-6。其中Fr.2-3反复经过Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40凝胶柱色谱分离, 结合半制备高效液相色谱(乙腈-水=11:89)等度洗脱, 最终得到化合物2 (3.75 mg)和化合物5 (11.47 mg); 20% EtOH (Fr.3)洗脱组分(71 g)加水溶解, 同样进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离, 按照与Fr.2相同的洗脱方法, 得到4个洗脱组分, 即Fr.3-1~Fr.3-4。Fr.3-2组分, 经Toyopearl HW-40凝胶柱色谱, 用70%含水甲醇等度洗脱, 得到3个洗脱组分, 即Fr.3-2-1~Fr.3-2-3。Fr.3-2-1使用半制备高效液相色谱(乙腈-水=10:90)等度洗脱, 最终得到化合物3 (10.34 mg); 50% EtOH (Fr.5)洗脱组分(92 g)加水溶解, 经离心后取上清液, 进行MCI柱色谱分离, 用不同比例的甲醇-水(甲醇:水=0:1→1:0)梯度洗脱, 最终得到5个洗脱组分, 即Fr.5-1~Fr.5-5, Fr.5-2加5%甲醇溶解后, 进行中压制备(ODS)柱色谱分离, 以甲醇-水(甲醇:水=5:95→1:0)梯度洗脱, 得到2个洗脱组分, 即Fr.5-2-1~Fr.5-2-2, Fr.5-2-1进行制备薄层分离纯化, 以二氯甲烷-甲醇-水系统为展开剂(二氯甲烷:甲醇:水=8:1:0.1), 最终得到化合物4 (3.50 mg)和化合物6 (15.34 mg)。Fr.5-2-2加甲醇溶解, 硅胶拌样后(样品:拌样硅胶=1:1)进行硅胶柱色谱分离, 用二氯甲烷-甲醇系统(二氯甲烷:甲醇=20:1)等度洗脱, 最终得到化合物1 (1.71 mg)。

2 酸水解和糖的绝对构型确定

取化合物1 (1 mg), 加入1 mL三氟乙酸溶液(2 mol·L-1), 加热回流3 h, 所得水解液用乙酸乙酯萃取3次, 将水层浓缩至干[9]。加少量乙醇溶解, 经HPLC分析, 采用蒸发光散射检测器, 色谱柱为CHIRALPAK AD-H (250 mm×4.6 mm), 流动相为正己烷-乙醇-三氟乙酸(750:250:0.25), 流速0.5 mL·min-1。通过比较样品的保留时间与半乳糖标准品的保留时间, 鉴定化合物1中半乳糖的绝对构型为D-半乳糖(D-半乳糖和L-半乳糖的保留时间分别为17.0 min和20.8 min)。

3 结构鉴定

化合物1  白色油状物, 126.373 (c 0.017 1, CH3OH); UV λmax (CH3OH)/nm (logε): 203 (1.40)、292 (1.68); IR (MeOH) νmax: 3 364、1 640、706 cm-1; ESI-MS给出分子离子峰m/z: 410.141 1 [M+Na]+ (calcd. for C17H25NO9Na, 410.142 1); 1H NMR (500 MHz, CD3OD)和13C NMR (125 MHz, CD3OD)数据见表 1

化合物2  黄色无定型粉末。ESI-MS m/z: 509.174 4 [M+Na]+1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ: 11.86 (1H, s, -NH), 7.30 (1H, s, H-5), 6.91 (1H, s, H-8), 4.49 (1H, m, H-1′b), 4.16 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1″), 4.01~4.04 (3H, m, H-1′a, H-2′, H-5′b), 3.75 (1H, m, H-4′), 3.64~3.67 (2H, m, H-3′, H-6″b), 3.40~3.44 (2H, m, H-5′a, H-6″a), 3.00~3.16 (4H, m, H-2″-H-5″), 2.22 (3H, s, 6-CH3), 2.18 (3H, s, 7-CH3); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ: 155.7 (C-2), 153.7 (C-3), 131.2 (C-6), 130.9 (C-7), 124.9 (C-9), 123.3 (C-10), 116.5 (C-5), 116.0 (C-8), 103.7 (C-1″), 76.8 (C-5″), 76.3 (C-3″), 73.6 (C-2″/C-3′), 72.1 (C-5′), 70.8 (C-4′), 70.0 (C-4″), 67.9 (C-2′), 60.9 (C-6″), 44.6 (C-1′), 19.3 (6-CH3), 18.7 (7-CH3)。根据以上数据, 结合参考文献[10], 鉴定该化合物为baimantuoluoamide B。

化合物3  无色油状物。ESI-MS m/z: 260.064 3 [M+Na]+1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.80 (1H, s, H-13), 7.41 (1H, d, J = 3.4 Hz, H-11), 6.66 (1H, dd, J = 1.5, 3.4 Hz, H-12), 5.01 (1H, d, J = 18.0 Hz, H-1), 4.40 (1H, d, J = 18.0 Hz, H-2), 4.40 (1H, m, H-3), 2.49 (2H, m, H-4, H-5a), 2.16 (1H, m, H-5b); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 184.3 (C-9), 178.7 (C-7), 174.7 (C-6), 152.3 (C-10), 149.0 (C-13), 119.6 (C-11), 113.6 (C-12), 61.6 (C-3), 30.1 (C-4), 24.0 (C-5)。根据以上数据, 结合参考文献[11], 鉴定该化合物为capparisine C。

化合物4  白色无定形粉末。ESI-MS m/z: 249.064 2 [M+Na]+1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ: 12.02 (1H, s, -COOH), 8.75 (1H, s, H-4), 8.35 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-5), 7.65 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-8), 7.59 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-7), 7.30 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-6), 2.82 (3H, s, -CH3); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ: 166.7 (-COOH), 141.7 (C-3), 140.8 (C-8a), 136.1 (C-1/C-9a), 128.3 (C-7), 127.1 (C-4a), 122.1 (C-5), 121.3 (C-4b), 120.1 (C-6), 115.4 (C-4), 112.2 (C-8), 20.2 (-CH3)。根据以上数据, 结合参考文献[12], 鉴定该化合物为harman-3-carboxylic acid。

化合物5  浅黄色油状物。ESI-MS m/z: 274.069 0 [M+Na]+1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.81 (1H, s, H-5), 7.42 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-3), 6.66 (1H, m, H-4), 4.97 (1H, d, J = 18.1 Hz, H-7a), 4.43 (1H, d, J = 18.1 Hz, H-7b), 4.41~4.44 (1H, m, H-12), 3.73 (3H, s, H-15), 2.44~2.53 (2H, m, H-10, H-11a), 2.15~2.21 (1H, m, H-11b); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ:184.2 (C-6), 178.6 (C-9), 173.4 (C-13), 152.3 (C-2), 149.0 (C-5), 119.9 (C-3), 113.6 (C-4), 61.6 (C-12), 53.0 (C-15), 48.0 (C-7), 30.0 (C-10), 23.8 (C-11)。根据以上数据, 结合参考文献[13], 鉴定该化合物为(2S)-1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]-5-oxopyrrolidine-2-carboxylate。

化合物6  浅棕色油状物。ESI-MS m/z: 216.063 4 [M+Na]+1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.82 (1H, s, H-5), 7.42 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-3), 6.67 (1H, t, H-4), 4.63 (2H, s, H-7), 3.52 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-12), 2.44 (2H, t, J = 8.0 Hz, H-10), 2.08~2.14 (2H, m, H-11); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 184.3 (C-6), 178.6 (C-9), 152.3 (C-2), 149.0 (C-5), 119.5 (C-3), 113.6 (C-4), 49.6 (C-7), 49.0 (C-12), 31.4 (C-10), 19.0 (C-11)。根据以上数据, 结合参考文献[13], 鉴定该化合物为1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one。

4 化合物1~6对LPS诱导的NRK-52e细胞损伤的干预作用

采用细胞实时监控检测的方法(RTCA)探究化合物对脂多糖(LPS)诱导的NRK-52e细胞损伤的干预作用[14]。将NRK-52e细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期, 按照细胞密度为每毫升2×104个, 每孔2 000个细胞接种于E-Plate板(ID725596)中, 24 h后, 实验分为正常对照组(空白培养基)、模型组(LPS)和给药组, LPS (1 μg·mL-1)与6个生物碱类化合物(10 μmol·L-1)刺激NRK-52e细胞48 h, 细胞实时监控仪检测细胞活力, 与模型组相比, Cell Index比率[(给药组-模型组)/模型组]大于10%则表示化合物对LPS诱导的NRK-52e细胞损伤具有保护作用。

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