他克莫司(tacrolimus, FK506)作为一种钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor, CNI)型免疫抑制剂, 是于器官移植术后应用最为广泛的CNI之一^[1], 大部分器官移植术后的患者均需长期甚至终身应用他克莫司, 但他克莫司价格昂贵, 给患者带来沉重的经济负担。研究及临床实践表明, 五酯胶囊与地尔硫䓬均可提高他克莫司血药浓度, 降低其给药剂量, 提高用药经济性^[2-4], 因此被广泛应用于器官移植术后的患者中。作者亦曾开展研究证实五酯胶囊相较地尔硫䓬对他克莫司血药浓度的提升作用更大, 但存在极大的个体差异, 使患者用药风险增加^[5], 但其中原因至今仍不明确。CYP3A5*3 (rs776746)基因多态性被多次证实为造成他克莫司血药浓度个体差异的关键因素^[6-10], 也分别有研究表明CYP3A5*3基因多态性能够影响五酯胶囊^[11]与地尔硫䓬^[12]对他克莫司血药浓度的作用。但截至目前, 鲜有在CYP3A5*3基因多态性指导下将五酯胶囊与地尔硫䓬对他克莫司血药浓度的作用进行比较, 以证实CYP3A5*3基因多态性是否在五酯胶囊相较地尔硫䓬对他克莫司血药浓度的提升作用个体差异中扮演重要角色的相关研究。故本研究拟在肾移植患者中开展回顾性分析, 为临床合理用药提供参考依据。

研究对象  回顾性收集于联勤保障部队第九〇〇医院行肾移植术且随访至今的患者, 肾移植时间为2014年11月~2018年3月。纳入标准: ①患者年龄≥18岁; ②首次移植; ③术后应用三联免疫抑制方案。排除标准: ①患者入院前患有慢性乙肝、丙肝等肝脏疾病或各项肝功能指标异常; ②给药前两周内服用CYP3A酶诱导剂或抑制剂的患者; ③患者因各种原因联用除五酯胶囊外其他明确能够影响他克莫司血药浓度的药物; ④患者因各种原因停用他克莫司、换用CsA或未严格按照实验设计用药方案用药; ⑤患者临床资料缺失或失访。研究方案均符合相关伦理学规范。

免疫抑制治疗方案  所有入组患者肾移植术后均应用三联免疫抑制方案:他克莫司+吗替麦考酚酯/麦考酚钠+糖皮质激素。具体用药方案为: ①他克莫司胶囊(Astellas Ireland Co., Ltd.)标准化给药(0.08~0.12 mg·kg^-1·d^-1, bid), 术后第1天开始口服, 3天后开始监测血药浓度, 之后根据血药浓度监测结果调整给药剂量, 要求患者他克莫司维持血药浓度控制在5~15 ng·mL^-1之间; ②吗替麦考酚酯片(上海罗氏制药有限公司, 0.5~2 g·d^-1, bid), 术后第1天开始口服; ③麦考酚钠肠溶片(Novartis Pharma Schweiz AG, 360~1 440 mg·d^-1, bid), 术后第1天开始口服; ④糖皮质激素术中静脉注射甲泼尼龙琥珀酸钠(Pfizer Manufacturing Belgium NV, 用量不超过1 g); 术后1~3天, 静脉注射甲泼尼龙琥珀酸钠200~500 mg·d^-1冲击治疗; 术后4~30天口服醋酸泼尼松片(山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司) 20~50 mg·d^-1; 术后2~3个月口服醋酸泼尼松片10~20 mg·d^-1。

五酯胶囊及地尔硫䓬的给药方案  所有入组患者肾移植术后在应用他克莫司的同时立即联用地尔硫䓬30 mg, bid。①观察组患者经数次他克莫司剂量调整后他克莫司C₀/D仍低于预期, 即将地尔硫䓬改为五酯胶囊(11.25 mg, bid), 并维持五酯胶囊联用方案仅调整他克莫司口服剂量直至出院; ②对照组患者术后联用地尔硫䓬 (30 mg, bid)即可达到目标浓度, 并维持地尔硫䓬联用方案仅调整他克莫司应用剂量直至出院。

临床资料记录  查阅患者住院病历, 记录如下资料:人口学资料(年龄、性别、身高及体重); 他克莫司初始给药剂量、初始给药3天后他克莫司C₀及生化检查指标; 他克莫司维持剂量(他克莫司的维持剂量是指在服用相同剂量下, 患者连续多次测定C₀的值在其治疗窗之间, 且在患者出院前不再进行他克莫司剂量的调整)、术后获得他克莫司维持剂量的时间以及获得维持剂量时对应的他克莫司C₀、五酯胶囊或地尔硫䓬的联用方案和剂量以及患者基因型(检测方法为Sequenom MassARRAY® SNP检测系统)。计算患者他克莫司初始C₀/D (患者术后首次应用他克莫司时C₀/D)、维持C₀/D (获得他克莫司维持剂量时所对应的C₀/D)及C₀/D提升幅度(维持C₀/D-初始C₀/D)。

数据统计与分析  数据用均数±标准差(± s)表示, 统计分析使用SPSS 22.0软件。以C₀/D为主要评价指标。计量资料间比较, 首先进行正态分布和方差齐性检验。对于主要评价指标C₀/D, 先应用配对样本T检验比较患者在获得他克莫司维持剂量时与应用初始剂量时数据的差异, 而后应用独立样本T检验(满足方差齐性与正态分布)或Mann-Whitney U检验(不满足方差齐性与正态分布)比较观察组与对照组的组间差异; 对于如患者年龄等其他指标直接应用独立样本T检验或Mann-Whitney U检验比较观察组与对照组的组间差异。

入组170例患者中, 观察组患者共计105例, 其中男性79例、女性26例。对照组患者共计65例, 其中男性45例、女性20例。两组患者间性别、年龄、身高、体重、体表面积差异均无统计学意义(P > 0.05), 且入院时血肌酐、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、红细胞计数、血红蛋白、红细胞比容、血小板计数、白细胞计数、粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、白蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血糖以及他克莫司初始剂量差异同样均无统计学意义(P > 0.05)。

经Sequenom MassARRAY® SNP检测系统分型, 105例观察组患者中测得CYP3A5*1*1型患者9例, CYP3A5*1*3型患者56例, CYP3A5*3*3型患者40例; 65例对照组患者中测得CYP3A5*1*1型患者1例, CYP3A5*1*3型患者10例, CYP3A5*3*3型患者54例。整体基因型频率分布符合Hardy-Weinberg检验。考虑中国人群CYP3A5*3突变频率较高, 约为77.8%^[13], 本研究纳入CYP3A5*1*1型患者样本量较小, 代表性较差。故根据CYP3A5*3突变将使CYP3A5酶丧失活性^[14], 将CYP3A5*1*1与CYP3A5*1*3型患者合称为CYP3A5表达者, 将CYP3A5*3*3型患者称为CYP3A5非表达者。两组患者CYP3A5基因型分布存在显著差异(P < 0.05)。

经配对样本T检验分析, 观察组CYP3A5表达型的患者在由地尔硫䓬换用五酯胶囊后C₀/D有了极显著提高(P < 0.01), 而非表达型患者C₀/D较前无显著差异(P > 0.05)。在对照组中两种基因型患者获得维持剂量时他克莫司C₀/D较前均无显著变化(P > 0.05);在组内不同基因型患者间差异方面, 经独立样本T检验或Mann-Whitney U检验分析, 观察组CYP3A5表达型患者的初始C₀/D显著低于非表达型患者(P < 0.01), 但在患者都换用了五酯胶囊后, 他克莫司维持C₀/D与非表达型无显著差异(P > 0.05), 他克莫司C₀/D提升幅度与非表达型患者有显著差异(P < 0.01);在相同基因型患者的组间差异方面, 经独立样本T检验或Mann-Whitney U检验分析, 基因型同为CYP3A5表达型, 观察组患者的初始C₀/D显著低于对照组(P < 0.01), 但在观察组患者换用了五酯胶囊后C₀/D反而显著高于对照组(P < 0.05)。观察组CYP3A5表达型患者由于换用五酯胶囊, C₀/D的提升幅度与对照组有显著差异(P < 0.01), 但在CYP3A5非表达型患者中则无此现象, 详见表 1。

表1(Table 1)

表 1 Tacrolimus C0/D in patients with different CYP3A5 genotypes between the observation and the control group. ± s. aaP < 0.01, Initial dose vs Maintenance dose; bP < 0.05, bbP < 0.01, Expresser vs Non-expresser within each group; cP < 0.05, ccP < 0.01, Observation group vs Control group within same CYP3A5 genotype C0(ng·mL-1)/D(mg·kg-1) Observation group (n=105) Control group (n=65) CYP3A5 expresser CYP3A5 non-expresser CYP3A5 expresser CYP3A5 non-expresser Initial 66.81 ± 30.44bb cc 111.47 ± 57.48 101.02 ± 31.69 131.06 ± 59.02 Maintenance 121.90 ± 54.02aa c 132.09 ± 54.64 91.15 ± 25.26b 130.15 ± 55.83 Increase 55.09 ± 49.48bb cc 20.63 ± 72.20 -9.87 ± 31.07 -0.92 ± 63.52

表 1 Tacrolimus C0/D in patients with different CYP3A5 genotypes between the observation and the control group. ± s. aaP < 0.01, Initial dose vs Maintenance dose; bP < 0.05, bbP < 0.01, Expresser vs Non-expresser within each group; cP < 0.05, ccP < 0.01, Observation group vs Control group within same CYP3A5 genotype

对患者他克莫司C₀/D提升幅度(%)作箱式图, CYP3A5表达型患者在由地尔硫䓬换用五酯胶囊后他克莫司C₀/D提升幅度(%) Me约为76.8%, CYP3A5非表达型患者仅为约15.2%, 详见图 1。

Figure 1

Figure 1

图 1 Increase of tacrolimus C0/D (%) in patients with different CYP3A5 genotypes between the observation and the control group

CYP3A5作为CYP酶系重要的代谢酶之一, 参与多种药物的体内代谢。研究表明, 其表达在不同人群间存在很大的个体差异, 而这种差异主要是由于CYP3A5基因突变造成的。CYP3A5基因位于7q21.1~22.1, 它包含13个外显子, 全长31.8 kb, 编码502个氨基酸。其中, 学者们普遍将第3内含子6986A > G (rs776746)突变称为CYP3A5*3突变, 为CYP3A5基因最常见的突变, 同时也是决定CYP3A5酶活性个体差异的关键因素之一。他克莫司在人体内主要经过CYP3A5酶代谢, 五酯胶囊与地尔硫䓬也是通过抑制CYP3A5酶的作用从而能够提高他克莫司的血药浓度。由此可见, CYP3A5*3基因多态性与五酯胶囊及地尔硫䓬对他克莫司血药浓度作用的关系十分值得关注。

本研究在检测了170例肾移植术后应用他克莫司患者的CYP3A5*3基因型后发现, 观察组基因型为CYP3A5表达型的患者占61.9%, 而在对照组患者中仅占16.9%, 观察组与对照组患者的CYP3A5*3基因型分布频率存在极显著差异(P < 0.01)。由于在应用初始剂量的他克莫司联用地尔硫䓬时, 仅有他克莫司C₀/D低于预期的患者才在后期将联用地尔硫䓬改为五酯胶囊。且在本研究观察组患者中, 应用相同初始剂量的他克莫司, CYP3A5表达型患者的C₀/D也显著低于非表达型患者。综合以上结果认为, 本研究中观察组CYP3A5表达型的患者分布频率显著高于对照组患者是造成观察组患者应用他克莫司初始剂量时C₀/D显著低于对照组患者的关键因素之一。

在根据CYP3A5*3基因型对五酯胶囊相较地尔硫䓬对他克莫司C₀/D的影响进行分析后发现, 五酯胶囊相较地尔硫䓬对他克莫司C₀/D的提升幅度在自身对照及对照组对照中均与患者CYP3A5*3基因型有显著相关, 观察组患者在由地尔硫䓬换用五酯胶囊后能够提升CYP3A5表达型患者他克莫司C₀/D约76.8%, 但在CYP3A5非表达型患者中则几乎无这一作用。出现这一结果的原因可能是由于五酯胶囊能够通过抑制CYP3A酶对他克莫司的代谢作用, 从而提高他克莫司的血药浓度, 而CYP3A5*3突变能够使CYP3A5酶失去活性, 所以五酯胶囊可以显著抑制CYP3A5表达型患者CYP3A5酶的活性, 从而使其对他克莫司的代谢减弱, 但CYP3A5非表达型患者由于其CYP3A5酶活性本身很低, 故受五酯胶囊影响较小, 对他克莫司的代谢作用也没有显著改变。因此, 作者认为五酯胶囊较地尔硫䓬在CYP3A5表达型患者中对他克莫司血药浓度的提升作用更强, 肾移植术后应用他克莫司并联用地尔硫䓬的患者若他克莫司C₀/D仍处于较低水平可考虑检测患者CYP3A5*3基因多态性, 若患者为CYP3A5表达者则可将地尔硫䓬换为五酯胶囊, 若患者为CYP3A5非表达者, 则大部分只能依靠提高他克莫司的给药剂量来提高血药浓度。

但本研究在校正了CYP3A5*3的影响后发现, 基因型同为CYP3A5表达型, 观察组患者的他克莫司C₀/D仍然显著的低于对照组(P < 0.01)。可见, 除CYP3A5*3基因多态性外, 仍有其他基因多态性等众多因素能够造成他克莫司血药浓度的个体差异。且本研究为回顾性分析, 五酯胶囊相较地尔硫䓬对他克莫司血药浓度的影响还望在纳入更多影响因素的大规模前瞻性随机对照研究中进一步明确。