贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.为藤黄科金丝桃属多年生草本植物, 又名贯叶连翘、圣约翰逊草^[1]。我国贯叶金丝桃资源十分丰富, 有55种、8个亚种, 分布于甘肃、陕西、四川、安徽、贵州、河南、湖北等地^[2]。2005年中国药典收录其中^[3]。贯叶金丝桃中的化学成分主要包括黄酮类、间苯三酚类及萘骈二蒽酮类等, 具有抗乙肝病毒、抗AIDS、抗菌、伤口愈合及治疗轻中度抑郁等广泛活性^[4]。在欧洲用于治疗轻中度抑郁, 已有数百年历史。其开发应用在国际上引起了广泛关注, 现在对该植物的研究仍然是热点之一。前期研究已从中分离得到多个黄酮及酚酸类化合物^[5], 为了进一步寻找和明确该植物中的活性成分, 本文采用硅胶柱色谱、凝胶色谱及制备液相色谱等多种分离技术从贯叶金丝桃地上部分的95%乙醇提取物中分离得到1个新的较罕见的2, 3-二氧代黄酮类化合物。通过UV、IR、MS、HR-ESI-MS及核磁共振等波谱技术鉴定为: Rel-(2S, 3R)-2-(3, 4-dihydroxyphenyl)-3, 5, 7-trihydroxy-2-methoxy-3-(2-oxopropyl)chroman-4-one (图 1)。结构中含有一个丙酮基片段, 在自然界中较为罕见存在。此外, 还对化合物1的可能生源途径进行了推测(图 2)。

结构解析 化合物1

淡黄色固体。正离子ESI-MS在m/z 391.1处给出了[M+H]⁺峰, 413.2处给出了[M+Na]⁺峰, 负离子ESI-MS在m/z 389.2处给出了[M-H]^-峰, 以及779.2处的[2M-H]^-峰, 提示分子量为390, HR-ESI-MS给出了准分子离子峰m/z: 413.083 8 [M+Na]⁺, (计算值为413.084 3, C₁₉H₁₈NaO₉), 确定分子式为C₁₉H₁₈O₉, 不饱和度为11。IR光谱给出了羰基(1 637、1 701 cm^-1), 苯环(1 511、1 471 cm^-1)的特征吸收峰。紫外光谱显示UV (MeOH) λ_max (logε): 209 (3.75)、290 (3.47)、331 (2.94) nm。提示该化合物属于黄酮类结构骨架。

在¹H NMR谱中, 低场区显示一组ABX系统质子信号[δ_H 7.22 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2')、7.12 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, H-6')、6.91 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5')], 一组AB自旋质子信号[δ_H 6.13 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8)、6.05 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6)], 4个活泼羟基信号(δ_H 11.17、9.92、8.27、8.11), 一个羟基信号δ_H 4.93, 2个甲基信号δ_H 2.98 (3H, s, H₃-11)、1.99 (3H, s, H₃-14), 两个偕偶AB偶合特征质子信号[δ_H 2.63 (1H, d, J = 13.8 Hz, 12-Ha)和2.47 (1H, d, J = 13.8 Hz, 12-Hb)]。

¹³C NMR谱中, 显示了18个碳信号, DEPT谱将这些碳信号区分为2个甲基(1个连氧甲基碳, 1个与酮羰基相连碳)、1个亚甲基、5个次甲基(均为sp²杂化碳)和11个季碳(包括7个sp²杂化碳, 1个羰基碳)。根据以上数据, 推断化合物1为黄酮类化合物。

¹H NMR谱中特征的AB自旋质子信号说明A环为5, 7-二羟基取代, ABX系统质子信号提示B环为3', 4'-二取代。AB自旋质子信号准确归属[δ_H 6.13 (H-8), 6.05 (H-6)]。并且在HMBC图谱中, H-6与C-8、C-10, H-8与C-6、C-10相关, H-2'与C-4'、C-6', H-5'与C-1'、C-3', H-6'与C-2'、C-5'的远程相关进一步得到证实。H₃-14与C-13相关, 同时结合化学位移说明C-14连在C-13上; H₂-12与C-13、H₃-14与C-12相关表明C-13所在的乙酰基与C-12相连; 同时H₂-12还与C-2、C-4、C-13相关, 3-OH与C-2、C-3、C-4、C-12相关提示C-12连在季碳C-3上; 甲氧基H₃-11仅与C-2相关说明C-11所在的甲氧基与C-2相连; 最后通过H-2'与C-2相关确定了B环芳香环连接在C-2上。这样化合物1的平面结构就确定了, 如图 1所示。

在化合物1的NOESY谱中, H₂-12与H-2'、H-6'相关, 表明H₂-12和B环处于母核结构的同侧, 推测连在C-2的甲氧基和连在C-3位的羟基处于母核结构的另外一侧。由此, 确定其相对构型如图所示。[α]_D²⁰≈0 (c 0. 2, MeOH), 结合ECD谱, 未出现明显的Cotton吸收, 推测可能为一对对映异构体。但是因为分离的量较少无法进行手性拆分。故最后确定化合物1的结构为Rel-(2S, 3R)-2-(3, 4-dihydroxyphenyl)-3, 5, 7-trihydroxy-2-methoxy-3-(2-oxopropyl)chroman-4-one。

对化合物1的生源途径进行了推测^[6]:前体化合物是在贯叶金丝桃中已经分离到的含量丰富的槲皮素(quercetin), 通过迈克尔加成反应得到醌类中间体1a, 再经过甲基转移酶获得甲基化的中间体1b, 然后和乙酰辅酶A经过亲核反应生成1c, 再经与丙二酸单酰辅酶A缩合等途径得到乙酰乙酸类中间体1d。1d通过分子内的消除, 生成一分子的CO₂后得到烯醇类中间体1e, 最后通过烯醇转化得到最终产物1。

实验部分

Agilent1100系列LC/MSD Trap-SL型质谱仪(Agilent, Waldbronn, Germany); QSTAR Elite四极杆-飞行时间质谱仪(AB SCIEX, USA)测定质谱; Mercury-300、Mercury-400和SYS-600核磁共振仪(美国Varian公司)测定NMR; 测定温度: 297 K, 以溶剂峰信号作为内标; JASCO P2000自动数码旋光仪(JASCO, Tokyo, Japan)测定旋光; JASCO V-650分光光度计测定UV (JASCO); Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪(显微透射法)测定IR (Thermo Electron, Madison, WI, USA); 薄层色谱硅胶GF₂₅₄和柱色谱用硅胶(100~200目, 200~300目)均为青岛海洋化工厂产品; 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品; Agilent 1100和Shimadzu LC-6AD高效液相色谱仪(YMC公司Pack ODS-A C₁₈制备柱, 20 mm×250 mm, 5 µm); 所用分析纯和色谱纯试剂为北京化工厂生产。

贯叶金丝桃全草于2008年采自新疆维吾尔自治区乌孙山, 经新疆药物所刘发教授鉴定为贯叶金丝桃Hypericum perforatum L., 标本现存于中国医学科学院药物研究所植物标本室, 标本号为No. ID-S-2250。

1 提取分离

干燥的贯叶金丝桃地上部分20 kg, 粉碎后用10倍量的95%乙醇加热回流提取3次, 每次2 h, 提取液减压回收溶剂得浸膏3.5 kg。将浸膏分散于10 L水中混悬, 过滤后得到水溶(HP-W)和水不溶(HP-WN)两部分。水不溶部位(170 g)经硅胶柱(200~300目, 400 g)色谱分离, 依次用石油醚、乙酸乙酯、丙酮和甲醇洗脱, 回收溶剂得到相应的洗脱部分(HP-PE, HP-EtOAc, HP-A, HP-MeOH)。HP-EtOAc (50 g)经硅胶柱色谱(200~300目, 1000 g)石油醚-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱, 得到41个组分(HPE1-HPE41)。组分HPE30 (4 g)通过Sephadex LH-20柱色谱, 石油醚-氯仿-甲醇(5:5:1)为洗脱剂得到10个亚组分(HPE30a-HE30j)。HPE30h部分(260 mg)分离纯化, 通过HPLC制备(YMC, 甲醇-水=55:45, 7 mL·min^-1, λ = 254 nm)分离得到化合物1 (3 mg)。

2 结构鉴定

化合物1 淡黄色固体。UV (MeOH) λ_max (logε): 209 (3.75)、290 (3.47)、331 (2.94) nm; IR ν_max 3 354 (br s)、1 701、1 637、1 511、1 471、1 293、1 163、829、784 cm^-1; ¹H NMR (CD₃COCD₃, 300 MHz) and ¹³C NMR (CD₃COCD₃, 100 MHz)见表 1; (+)-ESI-MS m/z 391.1 [M+H]⁺, 413.2 [M+Na]⁺, (-)-ESI-MS m/z 389.2 [M-H]^-, 779.2 [2M-H]^-; 分子式为C₁₉H₁₈O₉; (+)-HR-ESI-MS m/z: 413.083 8 [M+Na]⁺ (计算值413.084 3, C₁₉H₁₈NaO₉)。