肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在东南亚和非洲, 由于乙型肝炎C型病毒感染的增加, 预计肝癌的发病率在未来几年将进一步增加[1, 2]。目前, 虽然传统的综合治疗方式(手术治疗、介入治疗、分子靶向治疗和放射治疗等)在肝细胞癌的全身治疗中起着重要的作用, 然而治疗结果一般比较局限。并且某些方式(如放疗和靶向治疗)在延长肝癌患者的整体生存期的同时, 往往也会对机体造成严重毒性和耐药性[3, 4]。因此, 寻找一种有效的治疗肝细胞癌的方法是非常重要的。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是一种治疗癌症的新方法, 它使用光敏剂(photosensitizer, PS)在特定波长激光照射下可引发一系列光化学和光生物学反应, 其中最重要的是产生单态氧及释放前列腺素、淋巴因子、血栓素等细胞因子, 破坏肿瘤组织的微血管和肿瘤细胞生物膜, 从而杀伤肿瘤细胞, 动物实验和临床应用均发现有较好的疗效[5, 6]。所以, 光敏剂的开发成为PDT治疗中的一个重点和热点[7]。
BF01 (分子结构如图 1)是上海百菲生物医药科技有限公司自自主研发的一种新型光敏剂, 课题组前期已经对光动力学参数进行摸索, 确定了最佳光照剂量和给药浓度。本文将继续研究BF01-PDT对人肝癌细胞BEL-7402体外抑制作用功能性评价及初步探讨其作用机制, 为其作为抗肿瘤新药提供理论依据。
BF01为本公司实验室自行合成, 纯度大于95%, (高效液相色谱检测), 绿色粉末, 化学名二氢卟吩e6钛合物, 并利用钛离子对其进行改性, 从而提高了BF01的各项性能, 最大激发波长652 nm, 易溶于水。体外实验用PBS配制成母液4 mg·mL-1。BEL-7402细胞、AnnexinV-EGFP细胞凋亡检测试剂盒和活性氧检测试剂盒均购自江苏凯基生物股份有限公司。Rhodamine 123购自上海翊圣生物科技有限公司。激光器购自南京来创激光科技有限公司。DAPI染色试剂盒购自南京碧波生物科技有限公司。NU/NU裸鼠(SPF级)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可SCXK (沪) 2018-0006]。
CCK-8法测定不同光敏剂浓度对BEL-7402抑制率影响对数生长期细胞培养于96孔培养板内, 每孔100 μL, 含6×103个肿瘤细胞, 置37 ℃、5% CO2温箱中培养。同时设立正常肝脏细胞作为对照, 培养条件及细胞数同上。次日给药浓度设置0、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1, 孵育4 h, 用PBS洗2遍后, 加完全培养基后, 利用激光器给予波长为650 nm的激光照射, 照射剂量2.4 J, 24 h后, 每孔加10 μL CCK8, 2 h后用酶标仪在波长450 nm条件下测OD值。并计算对肿瘤细胞抑制率、半数抑制率(IC50)及光敏剂对肝脏细胞有无杀伤效应。
BF01-PDT在BEL-7402中ROS的检测对数生长期细胞培养于96孔培养板内, 每孔6×103个肿瘤细胞。次日, 给药组加入含有不同浓度的BF01。对照组加入含0.1% DMSO的培养液。孵育24 h时后, 加入DCFH-DA (终浓度为10 μmol·L-1), 37 ℃孵育30 min后, 冷PBS洗2遍。利用激光器给予波长为650 nm的激光照射, 功率为2.4J·cm-2, 每孔1 min, 利用荧光显微镜观察照相, 酶标仪在408 nm处检测OD值。
BF01在BEL-7402细胞中的亚细胞定位将BEL-7402细胞培养于共聚焦培养皿中, 每皿1 mL (含2×104~2.5×104个肿瘤细胞。给药组加入BF01为3.2 μmol·L-1。对照组加入含0.1% DMSO的培养液。孵育24 h后, 倾去药物溶液, 并用不带血清的培养基洗涤2次, 按试剂盒操作, 加入终浓度为500 nmol·L-1线粒体染料Rhodamine 123, 避光孵育30 min。用不带血清的培养基洗涤细胞2次, 共聚焦显微镜下观察药物在细胞内的定位情况。
DAPI染色分析BF01-PDT作用BEL-7402细胞核形态将BEL-7402细胞接种于24孔板, 过夜培养。给药浓度设置:对照组0 μmol·L-1, 实验组3.2 μmol·L-1, 作用时间为24 h。用甲醇把DAPI原液稀释10倍, 制备成DAPI工作液。从细胞培养箱中取出24孔板, 充分除去细胞培养液, 每孔加入适量DAPI工作液洗涤细胞1次。充分除去上述工作液, 每孔加入500 μL DAPI工作液, 在37 ℃条件下避光染色15 min。充分除去上述DAPI工作液, 用甲醇洗涤细胞1次, 充分除去甲醇, 加入适量Buffer A, 在荧光显微镜下以340/380 nm紫外光为激发光进行观察, 拍照记录。
流式细胞仪检测BF01-PDT对BEL-7402细胞凋亡率的影响待6孔板细胞长满单层后, 给药浓度设为0、3.2和6.4 μmol·L-1, 经激光照射后, 照射剂量为2.4 J, 过夜培养, 用胰酶消化细胞, PBS分别洗涤对照细胞和凋亡细胞样品, 800×g离心力, 离心5 min, 收集1×105~5×105细胞, 具体实验操作按AnnexinV-EGFP细胞凋亡检测试剂盒说明书进行, 样品准备好后进行流式细胞仪检测。
BF01-PDT对NU/NU裸鼠模型的体内抗肿瘤实验收集1×107个BEL-7402细胞, 注射裸鼠皮下, 建立肿瘤模型。实验分为4组, 裸鼠性别为雄性, 每组6只, 共24只。每组裸鼠尾静脉注射光敏剂剂量分别为0、2.5、5和10 mg·kg-1, 每天1次, 持续6次, 注射后2.5 h, 每只小鼠均照射激光1 min, 注射后8.5 h, 每只小鼠均照射1 min激光。第3、7、10、14、21天测量裸鼠体重及肿瘤体积并计算相对肿瘤体积(RTV)。动物实验结束后, 对动物实施安乐死, 颈椎脱臼法处死小鼠, 仔细剥离肿瘤组织称重, 实验结束后收集裸鼠主要脏器进行HE染色, 观察光敏剂裸鼠体内正常组织是否有损伤。该动物实验经华东理工大学动物实验伦理委员会批准。
统计学分析采用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行处理和分析, 所有数据采用均数±标准差(x±s)表示。采用GraphPad Prism 5.0软件剂量曲线拟合计算IC50。
结果 1 CCK-8法测定不同光敏剂浓度对BEL-7402抑制率影响化合物BF01在药物浓度6.4 μmol·L-1时, 对BEL-7402抑制率达到86%, 且暗毒性实验显示, 化合物BF01本身对细胞几乎没有暗毒性。实验结果表明, 体外对正常肝脏细胞没有杀伤效应。对光敏剂化合物BF01光动力BEL-7402细胞杀伤效应的剂量依赖曲线进行拟合, 计算IC50为2.46 μmol·L-1 (图 2)。
光动力治疗中的一个关键环节就是ROS的产生, ROS产生后可以与细胞和组织中的大分子发生多种反应, 引起了细胞系列的变化, 尤其是破坏了细胞和组织中的关键细胞器, 从而导致靶细胞和组织的死亡。本研究以BEL-7402为研究对象, 观察经过不同浓度化合物BF01孵育, 然后激光652 nm (能量密度为2.4 J·cm-2)照射, 引起BEL-7402细胞中ROS的产生。由图 3可知, 随着BF01浓度的增加, 细胞中ROS产量也增加, 具有一定的量效关系。这一结果与CCK8检测的BF01对肿瘤细胞BEL-7402 PDT治疗作用的结果一致。
化合物BF01与BEL-7402肝癌细胞共孵育24 h后再与线粒体标记物孵育, 因为光敏剂可以激发红色荧光, 而细胞器线粒体的标记物为绿色荧光, 因而细胞中出现黄绿色颗粒说明两种荧光结合, 无黄色荧光说明无结合。本研究结果发现化合物BF01分布在BEL-7402细胞线粒体内产生黄绿色荧光, 说明EF01分布在BEL-7402细胞中线粒体发挥PDT效应(图 4A~C)。
DAPI染色结果(图 5A、B)显示, 对照组的细胞核较完整, 边缘清晰, 染色均匀, 产生较弱的蓝色荧光; 给药组3.2 μmol·L-1部分细胞出现核边缘不规则, 细胞核固缩, 细胞核碎片增加, 产生较强的蓝色荧光, 呈现出典型的凋亡特征(如图 4B中的红色箭头所示)。
用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测了BF01-PDT作用人肝癌细胞BEL-7402细胞的凋亡的情况。从图 6可以看出, 给药组(3.2和6.4 μmol·L-1) PDT可以诱导BEL-7402明显产生凋亡, 并且凋亡主要以晚期凋亡为主。
从图 7可以看出, 10 mg·kg-1 BF01在第14天的时候肿瘤抑制率达到最大。裸鼠实验模型证明BF01-PDT可以抑制小鼠肝癌BEL-7402的生长, 且裸鼠尾静脉给药模式抑制作用较强, 说明BF01-PDT在体内有较好的抗肿瘤活性。表 1结果显示, 3个剂量治疗组的肿瘤重量与对照组相比明显减小, 有显著性差异; 在本次实验中给药组小鼠与对照相比较, 体重有少许减轻, 但与对照组相比无显著性差异, 说明有效剂量的BF01无明显的系统毒性。另外, 收集主要脏器及肿瘤, 对其进行HE染色(图 8), 结果表明其主要分布在肿瘤和肝脏中, 说明BF01具有良好的靶向性和蓄积能力, 光敏剂BF01对小鼠主要脏器几乎没有病理变化和损伤。
本研究开发的化合物具有光响应范围宽且灵敏、光毒性小特点, 靶向性强, 不易发生光降解且容易保存, 在使用相同剂量条件下能更为有效地杀伤肿瘤细胞, 抑制细胞增殖。光动力学治疗的一个重要优势就是光敏剂本身是无细胞毒性的, 只有在光、氧气的存在下才能发挥作用, 从而光动力学治疗有很强的靶向性。光敏剂如何作用于靶组织或肿瘤组织的关键是由它的亚细胞定位决定的[8]。PDT诱导细胞产生凋亡的机制与光敏剂的定位, 细胞类型密切相关。线粒体在细胞死亡机制中发挥关键作用并且与抑制凋亡通路相关[9]。
但是其通过何种途径还有待进一步研究验证。在PDT的治疗中, 产生的ROS可以破坏细胞内的大分子如脂质、核酸和蛋白质等, 当这些损坏积累到一定程度时ROS不但诱导自噬而且会激活自噬性的细胞死亡, 所以ROS的类型、氧化损伤的程度和涉及的分子靶标影响了PDT诱导自噬性死亡的结果[10]。体外细胞实验使课题组掌握了BF01-PDT对人肝癌细胞BEL-7402细胞的作用规律及相关治疗参数, 体内实验显示, BF01-PDT可以明显抑制小鼠肝癌生长, 抑制效果十分明显, 这一结果与肿瘤内光敏剂蓄积多少有一定关系, 局部肿瘤给药光敏剂可以不经过代谢, 最大量地进入肿瘤细胞内, 因而会产生较好的治疗效果, 而决定PDT结果最重要因素是光敏剂如何作用于靶组织或肿瘤组织。而本研究所涉及的新型光敏剂亚细胞定位主要是定位在细胞的线粒体中。研究发现BF01定位于肿瘤细胞的线粒体, 在激光照射的情况下产生具有细胞毒性的活性氧, 从而杀死病变细胞[11], 二者之间存在的必然联系。而这些研究结果, 为接下来的研究奠定了一定的基础。但是关于BF01光敏药物杀伤肝癌的进一步机制还需进行更深入的研究, 这必将极大推进该光敏药在肝癌治疗领域中的应用。
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