药学学报  2019, Vol. 54 Issue (11): 2059-2063     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0407   PDF    
引用本文
SUN Chen, XIE Zhe-yu, WU Yong-jiang. Fingerprint analysis and multi-component determination of Leonurus japonicus by high performance liquid chromatography[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2019, 54(11): 2059-2063.  
孙晨, 谢浙裕, 吴永江. 益母草HPLC指纹图谱及多成分含量测定方法研究[J]. 药学学报, 2019, 54(11): 2059-2063.  
益母草HPLC指纹图谱及多成分含量测定方法研究
孙晨1,2, 谢浙裕2, 吴永江1     
1. 浙江大学药学院, 浙江 杭州 310058;
2. 绍兴市食品药品检验研究院, 浙江 绍兴 312071
收稿日期: 2019-05-24; 修回日期: 2019-07-04
基金项目: 名贵中药资源可持续利用能力建设项目（2060302-1508-04）；国家科技重大专项“重大新药创制”项目（2018ZX09201-010）资助
*通讯作者: 吴永江 ,Tel: 86-571-88208455, E-mail: yjwu@zju.edu.cn
摘要: 建立益母草的HPLC指纹图谱及多成分含量同时测定方法，为益母草质量综合评价和控制提供参考。益母草用70%乙醇水浴回流提取2 h，提取物采用HPLC法分析，色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，柱温30℃，检测波长为280 nm。25批样品得到共有峰12个，确认了其中5个峰对应的化学成分。丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷分别在进样量0.426 1~85.22ng（r=0.999 9）、7.948~1590 ng（r=0.999 3）、10.20~2040 ng（r=1.000 0）、2.018~403.6ng（r=0.999 9）、8.704~1741 ng（r=0.999 9）内呈良好的线性关系；平均回收率分别为99.0%、97.6%、97.4%、96.9%和98.5%，RSD分别为1.1%、1.8%、1.4%、1.5%和1.3%。该指纹图谱特征性明显，并可同时测定5个成分的含量。
关键词: 益母草     指纹图谱     多成分含量测定    
Fingerprint analysis and multi-component determination of Leonurus japonicus by high performance liquid chromatography
SUN Chen1,2, XIE Zhe-yu2, WU Yong-jiang1     
1. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2. Shaoxing Institute for Food and Drug Control, Shaoxing 312071, China
Abstract: An HPLC fingerprint and multi-component determination method of Leonurus japonicus was established for comprehensive evaluation and quality control of Leonurus japonicus. The sample was incubated in 70% ethanol in a water bath for 2 h, and the extract was analyzed by HPLC using Kromasil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The temperature of column was 30℃. The detection wavelength was 280 nm. HPLC fingerprint of characteristic components of Leonurus japonicus was established. There were 12 common peaks among 25 batches of samples, and 5 of them were identified and determined. Syringic acid, leonurine hydrochloride, rutin, hyperoside or isoquercitrin showed a good linearity in the ranges of 0.426 1-85.22 ng (r=0.999 9), 7.948-1 590 ng (r=0.999 3), 10.20-2 040 ng (r=1.000 0), 2.018-403.6 ng (r=0.999 9), or 8.704-1 741 ng (r=0.999 9), respectively. The average recoveries were 99.0%, 97.6%, 97.4%, 96.9% and 98.5% with RSD of 1.1%, 1.8%, 1.4%, 1.5% and 1.3%, respectively. The HPLC characteristic fingerprint of Leonurus japonicus was specific, and this method can simultaneously determine the content of 5 components.
Key words: Leonurus japonicus     fingerprint     multi-component determination    

益母草为唇形科植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)的新鲜或干燥地上部分, 始载于《神农本草经》, 列为上品, 历代本草均有收载[1]。益母草味辛苦、凉, 具有活血调经、利尿消肿、清热解毒的功效[2], 临床上广泛用于月经不调、产后瘀痛、痛经闭经、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿、心脑血管疾病、血液病等疾病的治疗。益母草成分较复杂, 目前从中先后分离得到黄酮类[3-5]、生物碱类[6, 7]等化学成分, 而现行质量标准中只对盐酸水苏碱和盐酸益母草碱进行控制, 没有关注到其他化学成分的情况, 难以从整体上把握益母草的内在品质。指纹图谱作为中药质量控制的重要手段, 已被广泛应用, 有文献报道对益母草流浸膏[8]、益母草注射液[9-11]、益母草饮片标准汤剂[12]的指纹图谱进行了研究, 但未对益母草药材进行指纹图谱研究, 也未见益母草指纹图谱与含量测定相结合的质量分析方法。本文运用高效液相色谱法, 对其指纹图谱方法进行研究, 并同时测定5个成分的含量, 建立益母草指纹图谱与含量测定相结合的质控方法, 以期为益母草质量控制提供科学依据。

材料与方法

仪器   LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司); XPE-205电子天平(Mettler Toledo); MILLI-Q ADVANTAGE A 10超纯水仪(MILLIPORE); TW-20恒温水浴锅(德国优莱博); 5810R台式大容量冷冻离心机(德国EPPENDORF公司)。

试药、试剂与样品   丁香酸对照品(阿拉丁, 批号22852, 纯度98%); 盐酸益母草碱对照品(中国药品生物制品检定所, 批号111823-201303, 含量95.2%); 芦丁对照品(批号100080-201408, 含量90.2%)、金丝桃苷对照品(批号111521-201507, 含量为94.3%)、异槲皮苷对照品(批号111809-201403, 含量92.9%)购自中国食品药品检定研究院; 乙腈(Merck, 色谱级); 超纯水; 其余试剂为分析纯; 25批益母草由浙江省食品药品检验研究院中药所提供, 样品信息见表 1。

Table 1 Sample information

对照品溶液的制备   精密称取丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷对照品适量, 加70%乙醇制成浓度分别为4.261、79.48、102.0、20.18、87.04 μg·mL-1的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备   精密称取益母草2.0 g置烧瓶中, 精密加入50 mL 70%乙醇, 水浴回流2 h, 放冷, 补足减失重量, 摇匀, 离心, 取上清液, 即得。

色谱条件   色谱柱: Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B), 梯度洗脱程序如下: 0→60 min, 5% A→25% A; 60→60.1 min, 25% A→80% A; 60.1→70 min, 80% A→80% A; 70→70.1 min, 80% A→5% A; 70.1→80 min, 5% A→5% A。柱温: 30 ℃; 流速: 1.0 mL·min-1; 检测波长: 280 nm; 进样量: 5 μL。

指纹图谱方法学验证

重复性   取同一批益母草(Y07) 6份, 按“供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液, 在上述色谱条件下进样分析, 记录色谱图, 测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

精密度   取益母草(Y07), 按“供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液, 在上述色谱条件下连续进样6次, 记录色谱图, 测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

稳定性   取益母草(Y07), 按“供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液, 在上述色谱条件下分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样, 记录色谱图, 测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

指纹图谱建立及相似度评价   取25批益母草样品, 按“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液, 在上述色谱条件下进样分析, 记录色谱图。将图谱导入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版中进行分析, 生成对照图谱, 计算各样品指纹图谱与对照图谱的相似度。

多指标含量测定方法学验证

根据指纹图谱研究结果, 对已知的5个成分丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷进行定量测定方法验证。

线性关系   分别依次精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μL注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归, 计算回归方程和相关系数。

重复性   按指纹图谱重复性项下方法, 记录丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的峰面积, 计算RSD值。

稳定性   按指纹图谱稳定性项下方法, 记录丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的峰面积, 计算RSD值。

回收率   精密称取已知含量的益母草(Y12) 9份, 分别按低、中、高3个梯度加入一定量的混合对照品溶液(5种成分大致为样品中含量的80%、100%、120%), 制备供试品溶液, 测定各成分含量, 计算平均回收率和RSD。

结果 1 指纹图谱方法学考察

在上述色谱条件下, 各特征峰可达到较好分离, 混合对照品与供试品溶液HPLC色谱图见图 1。

Figure 1 HPLC chromatograms of mixed standard solution (A) and sample solution (B). 2: Syringic acid; 6: Leonurine hydrochloride; 8: Rutin; 9: Hyperoside; 10: Isoquercitrin; 1, 3, 4, 5, 7, 11, 12: Other characteristic peak
1.1 重复性

12个共有峰相对保留时间的RSD均 < 0.4%, 相对峰面积均 < 1.7%, 说明本法具有较好的重复性。

1.2 精密度

12个共有峰相对保留时间的RSD均 < 0.2%, 相对峰面积均 < 0.5%, 说明该方法精密度良好。

1.3 稳定性

12个共有峰相对保留时间的RSD均 < 0.3%, 相对峰面积均 < 1.4%, 表明供试品在24 h内稳定。

2 HPLC指纹图谱建立及相似度评价

25批益母草的指纹图谱见图 2, 共有12个特征峰。通过对照品定位, 高分辨质谱确证, 指认其中2号峰为丁香酸, 6号峰为盐酸益母草碱, 8号峰为芦丁, 9号峰为金丝桃苷, 10号峰为异槲皮苷, 其中盐酸益母草碱为益母草的活性成分和指标性成分之一, 含量较高且稳定, 且保留时间处于整个图谱中间位置, 选择盐酸益母草碱作为参照峰。所收集的25批样品指纹图谱与对照图谱相比, 相似度均 > 0.90, 结果见表 2, 表明不同产地的益母草整体质量差异较小。

Figure 2 Fingerprints of 25 batches of Leonurus japonicus

Table 2 Fingerprint similarity of Leonurus japonicus from different origins
3 多指标含量测定方法学考察 3.1 线性关系

丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的线性方程分别为: y = 108 121x + 4 469.9 (r = 0.999 9); y = 64 532x + 10 051 (r = 0.999 3); y = 32 742x + 1 163.5 (r = 1.0000); y = 38 177x + 1 224.1 (r = 0.999 9); y = 42 796x + 978.01 (r = 0.999 9)。各成分进样量分别在0.426 1~85.22 ng、7.948~1 590 ng、10.20~2 040 ng、2.018~403.6 ng、8.704~1 741 ng内呈良好的线性关系。

3.2 重复性

丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.9%、1.1%、1.6%、1.3%和0.4% (n = 6), 表明重复性良好。

3.3 稳定性

丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.2%、1.5%、1.7%、1.6%和1.4%, 表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.4 回收率

丁香酸、盐酸益母草碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的平均回收率分别为99.0%、97.6%、97.4%、96.9%和98.5%, RSD分别为1.1%、1.8%、1.4%、1.5%和1.3%, 结果见表 3。

Table 3 Recovery of 5 analytes in Leonurus japonicus
4 样品含量测定

取混合对照品溶液和25批益母草样品供试品溶液, 按上述色谱条件进样分析, 按外标法以峰面积计算含量, 结果见表 4。

Table 4 Determination results of 25 samples
讨论

由于益母草含有的成分极性差异大, 采用等度洗脱难以使各成分得到分离, 不能使指纹图谱获得尽可能多的信息量。为了使主要成分在一张图谱上反映出来, 并能有效分离, 采用了梯度洗脱。尝试了有机相甲醇和乙腈, 乙腈分离效果较好; 水相尝试了0.1%甲酸、0.01%三氟乙酸、0.02 mol·L-1甲酸铵溶液、0.02 mol·L-1乙酸铵溶液, 0.1%甲酸和0.01%三氟乙酸效果均较为理想, 考虑到质谱不能使用三氟乙酸做流动相, 因此选择了0.1%甲酸。色谱柱尝试了Kromasil C18、Diamonsil C18、Venusil MP C18、Waters Symmetry C18、Welch Materials XB-C18、Shimadzu VP-ODS C18、Agilent SB C18等, Kromasil C18和Venusil MP C18分离效果较为理想, 最后选择了Kromasil C18。5种成分含量测定分离度均大于1.5, 理论板数均大于10 000。在样品处理中考察了水、甲醇和不同浓度乙醇等多种提取溶媒, 同时考察了不同时间的超声和回流提取, 并对5种成分进行全波长扫描筛选检测波长, 最终确定了色谱条件和样品制备方法。

本实验建立的益母草指纹图谱有12个共有峰, 所收集的25批样品指纹图谱与对照图谱相比, 相似度均 > 0.90, 表明不同产地益母草的整体质量一致性较好。在建立指纹图谱方法的基础上, 对益母草5个成分进行了含量测定, 可同时控制特征图谱中多成分的含量。对所收集的25批益母草样品进行含量测定, 发现各产地丁香酸、金丝桃苷、盐酸益母草碱、芦丁、异槲皮苷的含量差异较大, 可能与气候、土质等有关。经方法学研究表明, 本文方法重现性良好, 操作简便, 可作为益母草质量鉴定的依据。

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