药学学报  2019, Vol. 54 Issue (9): 1636-1644     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0164   PDF    
钩藤干预自发性高血压大鼠肝脏代谢紊乱的脂质组学研究
张世明1, 齐冬梅2, 曹艺明1, 周洪雷1, 蒋海强2, 李运伦3, 张倩1     
1. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355;
2. 山东中医药大学实验中心, 山东 济南 250355;
3. 山东中医药大学附属医院, 山东 济南 250300
摘要: 本文通过脂质组学方法研究钩藤干预自发性高血压大鼠肝脏脂质代谢物的变化,探索钩藤的作用机制。所有实验过程均获得了山东中医药大学实验中心动物保护和使用委员会的批准。实验中采用UHPLC-Q Extractive轨道阱高分辨质谱采集大鼠肝脏脂质代谢物信息,经模式识别,识别显著差异的物质,通过质谱和数据库检索鉴定潜在生物标志物。模式识别结果显示正常组与SHR组明显分开,高血压大鼠与正常大鼠相比,磷脂酰胆碱、甘油二酯、磷脂酸和鞘磷脂含量减少;溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯、亚油酸、花生四烯酸和鞘磷脂含量增多。钩藤乙醇提取物通过干预甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路、亚油酸代谢通路、花生四烯酸代谢通路改善脂质代谢紊乱的状态。本研究揭示了钩藤干预脂质代谢的机制,在阐释中药作用方面显示出了独特的潜力。
关键词: 脂质组学     肝脏     自发性高血压大鼠     钩藤     高分辨质谱    
Lipidomics study on intervention by Uncaria on hepatic metabolic disorder in spontaneously hypertensive rats
ZHANG Shi-ming1, QI Dong-mei2, CAO Yi-ming1, ZHOU Hong-lei1, JIANG Hai-qiang2, LI Yun-lun3, ZHANG Qian1     
1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
2. Experiment Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
3. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250300, China
Abstract: In this paper, the lipidomics was used to analyze the changes to address how Uncaria interrupts lipid metabolism in the liver of spontaneously hypertensive rats, and to explore the mechanism of action of Uncaria. All the experiments were approved by the animal protection and use committee of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. UHPLC-Q Extractive orbitrap high-resolution mass spectrometry was used to collect lipid metabolite information of the rat livers. Through pattern recognition, matters with noticeable differences were recognized. Mass spectrum and data base searching helped to identify the potential biomarkers. Pattern recognition results indicated that the rats from control versus SHR group showed clear differences. Compared with the rats from the control group, there are decreases in sphosphatidylcholine, phosphatidic acid, diacylglycerol and sphingomyelin in rats from the SHR group, however lysophosphatidylcholine, triglyceride, linoleic acid, arachidonic acid and ceramide are increased. Uncaria could regulate the disorder of lipid metabolism by interfering with glycerophospholipid, sphingolipid, linoleic acid, and arachidonic acid metabolic pathways. This study provided the mechanistic understanding of the impact of Uncaria on lipid metabolism and revealed the lipid metabolism pathways affected to offer the explanation for the complex mechanism of action.
Key words: lipidomics     liver     spontaneous hypertensive rat     Uncaria     high resolution mass spectrometry    

高血压是导致心血管疾病甚至死亡的主要因素之一[1], 是心血管疾病研究的重点[2]。脂质代谢紊乱是高血压病的主要易患因素[3]。近年来, 研究人员开始关注脂质代谢对高血压等心血管病的作用[4]。目前主要认为鞘磷脂、甘油磷脂类、甘油脂类、神经酰胺等脂质代谢物与高血压有密切关系[5-8]

脂类代谢的主要器官和重要场所在肝脏[9]。甘油三酯(triglyceride, TAG)蓄积过多和游离脂肪酸(free fatty acids, FFA)、总胆固醇、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)、神经酰胺(ceramide, Cer)和鞘磷脂(sphingolipid, SM)异常的代谢是导致脂质代谢紊乱的主要原因[10-13], 而这些成分主要在肝脏细胞中产生和贮存[14, 15]。脂质代谢紊乱是高血压的主要特征之一[3, 16, 17]

脂质组学由Han和Gross在2003年提出[18]。脂质组学作为代谢组学的一个重要分支, 旨在表征脂质种类, 并研究脂质在生物系统中的代谢途径和网络。脂质组学用于发现和识别各种脂类物质结构, 研究体液和组织中脂质的分布, 以及研究脂质在不同生物种群之间的差异[19, 20]。质谱法的广泛应用使得脂质组学分析更加精确和高效。脂质组学已经形成了一套成熟的分析方法, 并应用于生物医学科学中[21, 22]。Graessler等[16]通过研究发现与正常血压男性相比, 男性高血压患者PC-O (36:4)、PC-O (38:4)、PE-O (38:5)、PE-O (38:6)和PE-O (40:5)等甘油磷脂类成分降低。脂质组学分析发现高血压患者中磷脂类和甘油酯类代谢异常[23], 其中磷脂酰胆碱和甘油三酯是影响血脂代谢的主要因素[24]

钩藤是治疗高血压和调节脂质代谢常用的天然药物, 能够预防脑血管硬化、降血压和降血脂[25, 26]。钩藤中的钩藤碱具有镇静、抗惊厥及抗血小板聚集和血栓形成的药理作用[27]。钩藤碱抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖, 并进一步增加一氧化氮合酶活性, 促进一氧化氮合成和释放, 从而达到降血压的作用[28]。本文通过脂质组学方法, 研究钩藤对自发性高血压大鼠肝脏代谢絮乱的作用, 其中正常组和钩藤治疗组肝脏标志物相对含量的差异, 揭示了钩藤调节高血压大鼠脂质代谢紊乱的过程。本研究对钩藤治疗自发性高血压大鼠肝脏代谢絮乱的机制研究提供科学依据。

材料与方法

仪器和试剂  UltiMate 3000超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司), Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司), 配有ESI离子源。SCIENTZ-48高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司), 高速台式离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司), Vortex-Genie 2涡旋震荡器(美国SI公司), BP-98A大小鼠无创血压仪(北京软隆技术有限公司), 20~200 μL和100~1 000 μL单道微量可调移液器(美国Thermo Fisher Scientific公司), 乙腈(批号: 174263, Thermo Fisher公司), 甲醇(批号: 178511, Thermo Fisher公司), 异丙醇(批号: 178454, Thermo Fisher公司), 甲基叔丁基醚(批号: F1614018, methyl tert-butyl ether, MTBE)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司), 甲酸铵(批号: 20161008, 色谱纯, 上海迈坤化工有限公司), 钩藤药材(原产地云南; 批号: 170906)。

药品制备  钩藤粉碎, 加8倍量75%乙醇浸泡30 min, 回流提取2次, 每次2 h, 合并2次提取液, 真空干燥, 4 ℃冰箱保存备用。采用UHPLC-Q Exactive orbitrap MS正离子模式定量分析钩藤生物碱, 最终测得以下4种指标成分相当于每克钩藤原药材中的含量为:钩藤碱(217.1 ± 1.7) μg、异钩藤碱(126.7 ± 2.0) μg、去氢钩藤碱(55.18 ± 0.67) μg、异去氢钩藤碱(215.8 ± 2.5) μg。

实验动物  雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rats, SHR) 14只, 清洁级, 8周龄, 体重(190.7 ± 9.0) g; 雄性Wistar-Kyoto (WKY)大鼠7只, 清洁级, 8周龄, 体重(155.3 ± 1.8) g。实验动物均购于北京维通利华实验动物技术有限公司, 合格证书: SCXK (京) 2016-0006。所有实验过程均获得了山东中医药大学实验中心动物保护和使用委员会的批准(SDUTCM2018120301)。

动物分组  正常组(7只), SHR模型组(14只)。正常喂养大鼠7天, 待大鼠适应环境、血压稳定后, 将SHR随机分为2组, 即: SHR组7只, 钩藤组7只, 并选择WKY大鼠作为正常组。分笼饲养, 每笼各7只。饲养在12 h光照/黑暗的房间内, 室内温度为23~25 ℃, 自由摄食进水。

动物给药与样品收集  钩藤组:参照课题组前期工作基础[3, 29, 30], 给药剂量为2.29 g·kg-1体重钩藤乙醇提取物粉末。正常组和SHR组给予等量的生理盐水。每天定时给药, 每周给药6天, 连续给药4周。给药周期结束后, 所有大鼠禁食不禁水12 h后称重, 以10%水合氯醛对大鼠行腹腔麻醉(3 mL·kg-1), 待动物成功麻醉后(用止血钳试探性的夹住大鼠的四肢, 大鼠无明显反应), 剪开腹腔, 取肝脏后, 用生理盐水清洗肝组织由深红变为浅红色。

样品前处理  脂质提取采用甲基叔丁基醚提取法[31]。取大鼠肝组织50 mg, 置于2 mL的离心管中, 加入甲醇水溶液(1:1) 1.2 mL, 高通量组织研磨器匀浆1 min。在4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min。去除上清液向沉淀中加入甲基叔丁基醚-甲醇-水(5:1.5:1.45) 1.6 mL, 涡旋5 min, 在4 ℃下, 12 000 r·min-1, 离心15 min, 上清液用氮气吹干。用1.2 mL异丙醇-乙腈-水的混合溶液(2:1:1)溶解。

色谱条件  色谱柱: Halo C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm); 流速为0.30 mL·min-1; 柱温45 ℃, 进样器温度15 ℃; 进样量2 μL。二元梯度系统包括5 mmol·L-1醋酸铵加入乙腈-水的混合溶液(40:60;流动相A)和5 mmol·L-1醋酸铵加入乙腈-异丙醇的混合溶液(10:90;流动相B)。梯度为: 0~1 min流动相B比例为2%~20%; 1~5 min流动相B比例为20%~40%; 5~9 min流动相B比例为40%~70%; 9~17 min流动相B比例为70%~88%。

质谱检测模式  采用正负离子模式检测。正离子检测模式为:离子源ESI; 毛细管电压3 500 V; 毛细管温度350 ℃; 鞘气45 arb; 辅助气10 arb; 源内温度320 ℃; 质谱采集范围m/z 300~1 300;分辨率为70 000; S-Lens RF Level为55。负离子检测模式为:离子源ESI; 毛细管电压3 000 V; 毛细管温度320 ℃; 鞘气45 arb; 辅助气10 arb; 源内温度300 ℃; 质谱采集范围m/z 300~1 300;分辨率为70 000; S-Lens RF Level为55。正负离子二级质谱采集范围均为m/z 200~1 000, 归一化碰撞能量(Normalized Collision Energy, NCE)为30、50和70 eV。

质量控制  采用质控样品(quality control, QC)检测系统的稳定性[32]。QC样品是由匀浆后的样品各取100 μL混合得到。在对样品进行分析前, 为平衡系统先运行5次QC样品。在样品的检测过程中, 每检测5个正常样品后运行1次QC样品, 以衡量系统的稳定性。

数据处理  采用MS convert进行数据转换, 质谱分析原始谱图的数据转换为R语言(R Project V3.2.2, The University of Auckland, New Zealand)可识别的格式后, 进行峰匹配、峰对齐、峰提取和归一化处理, 然后使用Simca-P软件(V13.0, MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden)进行主成分分析(principal component analysis, PCA), 观察各组分分离趋势[33]。为获取更加可靠的代谢物的组间差异与实验组的相关程度信息, 采用偏最小二乘法-判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)的统计方法对结果进行分析。通过置换检验(permutation test), 对模型有效性做进一步的检验[34]。PLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度(variable importance in the projection, VIP)大于1的标准筛选差异性代谢物。同时, 使用Mass Profiler Professional (V12.6.1, 美国Agilent Technologies)软件对SHR组与正常组数据进行t检验(Student's t-test), 保留P值小于0.05的变量, 筛选差异倍数(fold change)大于等于2, 作为潜在生物标记物。同时并通过人类代谢组数据库(the human metabolome database, HMDB), 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)[35]和脂质图谱数据库(lipid maps databases), 寻找差异代谢物和映射的代谢通路。

结果 1 钩藤乙醇提取物对自发性高血压大鼠的血压调节作用

通过无创血压仪在尾动脉上测量(给药前和给药四周后)的收缩压(systolic blood pressure, SBP)。血压数据x± SD表示, 通过SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。从图 1中可以看出, 治疗前, 治疗组和SHR组血压均高于正常组, 表明SHR血压均明显高于正常组大鼠, 在使用钩藤治疗4周后, 治疗组血压明显下降(P < 0.05)。钩藤治疗后血压降低, 且随着给药时间的延长, 血压下降越明显。说明钩藤可以降低自发性高血压大鼠的血压, 对高血压大鼠有一定的治疗作用(图 1)。

Figure 1 Blood pressure changes of spontaneously hypertension rats (SHR) after 4 weeks of continuous administration. *P < 0.05 vs model group. SBP: Systolic blood pressure
2 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS稳定性评价

QC样本实验数据导入Simca-P软件, QC数据间聚类紧密, 并集中分布于95%可信区间内, 表明数据质量可靠。为进一步验证数据质量的可靠性, 从QC样本中选取质量数从低到高的10个离子, 离子信号用m/ztR (min)表示, 计算各离子相应强度的RSD值< 5% (表 1), 说明数据可靠。

Table 1 Relative standard deviation (RSD) values of 10 ion signals in positive and negative ion modes
3 差异性标志物筛选和质谱解析

正、负离子模式下, PCA结果显示正常组与SHR组样本呈现出分离趋势, 无交叉与重叠。100次排列置换检验结果显示: R2 < 0.5, Q2 < 0模型拟合较好[36], 无过拟合现象。结果见图 2

Figure 2 Principal component analysis (PCA) scores plots in positive (A) and negative (B) mode, partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) scores plots in positive (C) and negative (D) mode and permutation test in positive (E) and negative (F) mode. QC: Quality control; SHR: Spontaneously hypertensive rats. n = 7
4 差异性标志物质谱鉴定

参考相关的文献[37, 38], 利用Xcalibur软件推测分子式, 然后根据其碎片离子信息推测该化合物的断裂规律和结构类型。最后, 结合常见代谢物的保留时间和代谢物数据库检索, 检测代谢物的结构, 最终在肝组织中筛选出45个有差异的脂质代谢物, 见表 2。根据化合物母离子信息初步筛选标志物后, 可以根据子离子信息分析脂质化合物的裂解规律, 提高脂质成分鉴定的准确性。

Table 2 Potential biomarkers of liver in SHR. ↑ and ↓ represent high and low level in SHR in comparison with normal group, separately. Product ion in positive ion mode is [M-H2O+H]+; product ion in negative mode is [FA-H]-; PC: Phosphatidylcholine; lysoPC: Lysophosphatidylcholine; PE: Phosphatidyl ethanolamine; lysoPE: Lysophosphatidyl ethanolamine; PG: Phosphatidylglycerol; PS: Phosphatidylserine; PI: Phosphatidylinositol; SM: Sphingolipid; Cer: Ceramide; CE: Cholesteryl ester; DAG: Diacylglycerol; TAG: Triglyceride

磷脂类成分, 以PG1为例, 在电喷雾负离子模式测得分子离子峰为[PG1-H]-, 其二级碎片离子多为由酯键断裂而来的[lysoPG1-H]-或[lysoPG2-H]-, 而溶血磷脂类成分其二级碎片离子会产生脂肪链[FA-H]-, 在电喷雾负离子模式中磷脂类成分通常会产生[M+H]+。如图 3所示, lysoPE (0:0/20:4)分子离子峰m/z为501.593 10。图 3A图 3B所示, 主要碎片离子峰m/z 483.249 18为中性丢失([lysoPE-H2O+H]+), 303.233 49为([FA-H]-), 502.329 44为([lysoPE+H]+), 500.279 82 ([lysoPE-H]-)。PE (22:4/22:5)分子离子峰m/z为841.562 15, 见图 3C, 840.576 6为([PE-H]-), 主要碎片离子峰m/z 329.269 96, 331.264 74为([FA-H]-)。PG (16:0/18:1)分子离子峰m/z为769.502 99 ([M-H]-