肝癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一^[1]。目前, 治疗肝癌应用广泛的化学药物治疗毒副作用大, 容易导致耐药性。因此, 毒副作用小的中药在临床上的需求日渐提升, 从中药中提取抗肿瘤药物的任务也显得尤为迫切^{[2, 3]}。

人参, 属于五加科植物的干燥根, 被称之为“百草之王”, 从人参中提取的人参皂苷(ginsenoside)具有良好的抗肿瘤作用^{[4, 5]}, 由于其毒副作用小, 与临床抗癌药物具有协同作用的特点, 已经用于癌症的辅助治疗^[6]。人参皂苷CK是天然二醇型人参皂苷在体内发挥药用活性的实体^[7]。研究表明, 人参皂苷CK不仅可以有效地抑制人肝癌HepG-2细胞增殖^[8], 其聚糖纳米粒可改善肝损伤^[9]。TGF-β1/Smads通路是一种广泛存在于正常细胞和肿瘤细胞的跨膜信号转导通路, 在肿瘤的发生发展中扮演重要角色, 参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和凋亡等病理过程^{[10, 11]}, 已有学者从天然植物中提取抗癌成分通过抑制TGF-β1/Smads通路表达, 抑制肿瘤的转移^[12], 筛选TGF-β1/Smads通路的抑制剂有望成为研究抗肝癌药物的重要作用靶点。

本实验探究人参皂苷CK对人肝癌SMMC-7721细胞促凋亡的作用及对TGF-β1/Smads通路的影响, 为人参皂苷CK抗肿瘤方面的药理作用提供理论依据。

实验细胞  人肝癌SMMC-7721细胞购于南京凯基生物制品有限公司。

实验药品与试剂  人参皂苷CK购于源叶生物技术有限公司; SDS-PAGE凝胶试剂盒购于索莱宝科技有限公司; PVDF膜、ECL检测显影液购于Merck Millipore公司; 小牛血清和青链霉素购于美国Gibco公司; DMEM培养液和胰酶购于Invitorgen公司; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司; β-actin、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2抗体购于CST公司; TGFβRⅡ、Smad2/3、Smad4、Smad7抗体购于博士德生物工程有限公司; p-Smad2/3购于博奥森生物工程有限公司; 羊抗兔IgG购于中杉金桥生物技术有限公司; MTT粉购于美国Sigma公司; 人重组蛋白TGF-β1购于美国Peprotech公司; LY2109761购于美国BioVision公司。

实验仪器  电泳仪(DYY-7C)、转膜仪(DYCZ-40D) (北京市六一仪器厂产品); UPV凝胶成像仪(Biospectrum, 美国UVP凝胶成像系统有限公司); 超净工作台(C1109C)、CO₂培养箱(COR-1150) (上海智城分析仪制造有限公司); 酶标仪(日本TECAN公司); 显微镜(日本Olympus公司)。

细胞培养及分组  人肝癌SMMC-7721细胞加入至含10%小牛血清的DMEM培养液中, 37 ℃、5% CO₂恒温全湿培养箱中进行培养。每48 h换液传代, 取生长良好、处于对数生长期的细胞进行实验。细胞分为空白对照组(vehicle)、人参皂苷CK (10、20、40、60和80 μmol·L^-1)组, TGF-β1组(TGFβ1 10 ng·mL^-1)、TGF-β1+人参皂苷CK组(10 ng·mL^-1 TGFβ1+40 μmol·L^-1人参皂苷CK)、LY2109761组(10 μmol·L^-1 LY2109761)、LY2109761+人参皂苷CK组(10 μmol·L^-1 LY2109761+40 μmol·L^-1人参皂苷CK)。

MTT法检测细胞增殖  收集对数生长期的人肝癌SMMC-7721细胞, 制成细胞悬液, 调整细胞浓度, 将细胞按照每孔1×10⁴个接种于96孔板中, 每孔细胞悬液200 μL。24 h后弃去原孔内的培养液, 分别加入含有不同浓度人参皂苷CK (10、20、40、60和80 μmol·L^-1)的培养液培养24、48、72 h后, 取出96孔板, 每孔加入浓度为5 g·L^-1的MTT 20 μL, 继续培养, 4 h后取出弃其上清留底部沉淀, 每孔再加入150 μL DMSO, 避光放置于酶标仪内, 在波长490 nm处测定吸光度值, 计算IC₅₀和细胞存活率。计算公式如下:

流式细胞仪检测细胞凋亡率(Annexin V-FITC/PI双染)  取不同浓度人参皂苷CK组和DMEM对照组细胞培养。48 h后, 用不含EDTA的胰酶消化细胞, 冰PBS终止消化, 12 000 r·min^-1离心5 min, 再次清洗离心。PBS制成细胞悬液, 根据细胞计数取各实验组细胞约1×10⁶个, 用200 μL结合缓冲液制得细胞重悬液, 室温避光孵育15 min, 加入Annexin V 10 μL, 室温避光孵育10 min, 避光加入5 μL PI, 避光孵育, 上机检测, FACS Diva 4.1软件分析结果。

免疫蛋白印迹检测蛋白表达  各实验组细胞培养48 h后, 提取细胞全蛋白, BCA试剂盒测定蛋白含量。配置凝胶。根据蛋白浓度计算上样量上样, 电泳(100 V, 150 min), 转膜(100 V, 30~80 min)。室温下, 5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h。分别加入一抗(TGFβRⅡ、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4、Smad7、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和β-actin)室温孵育1.5~2 h, TBST清洗PVDF膜, 放入二抗室温孵育1~1.5 h。ECL试剂盒显影, 使用G:BOX chemiXR5成像系统显影, 分析数据使用Image J软件进行灰度分析。

数据处理及分析  采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析。所有数据均用x±s表示, 不同分组采用单因素方差分析统计, 组间两两比较采用t检验。

MTT结果显示, 10、20、40、60和80 μmol·L^-1人参皂苷CK作用48 h时人肝癌SMMC-7721细胞的存活率分别为95.21% ± 3.15%、87.98% ± 8.13%、57.00% ± 6.60%、34.20% ± 5.63%和10.01% ± 5.94%。人参皂苷CK能降低人肝癌SMMC-7721细胞的存活率, 且呈一定的时间和浓度依赖性, 见图 1。计算人参皂苷CK对细胞作用48 h时IC₅₀值为44.04 μmol·L^-1。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Effect of ginsenoside CK on the survival rate of SMMC-7721 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs vehicle

流式细胞术检测凋亡结果显示, 细胞凋亡率逐渐上升, 呈剂量依赖性, 40、60 μmol·L^-1人参皂苷CK与空白对照组相比较, 差异显著, 有统计学意义(P < 0.01, 图 2A)。Western blot结果显示与空白对照组相比, 40和60 μmol·L^-1加药组cleaved caspase-3表达量明显上升, Bcl-2/Bax值显著下调(图 2B), 有统计学意义(P < 0.01)。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Effect of ginsenoside CK on apoptosis of SMMC-7721 cell. SMMC-7721 cells were treated with ginsenoside CK (20, 40, 60 μmol·L-1) for 48 h. A: Annexin V-FITC/PI double staining assay; B: Western blot assay. a: Vehicle; b: 20 μmol·L-1 ginsenoside CK; c: 40 μmol·L-1 ginsenoside CK; d: 60 μmol·L-1 ginsenoside CK. n = 3, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs vehicle

Western blot检测发现, 人参皂苷CK对TGF-β1/Smads通路相关蛋白Smad2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达有抑制作用, 对Smad7蛋白表达有促进作用。其中人参皂苷CK浓度为40和60 μmol·L^-1时, 与空白对照组相比, 差异显著, 均有统计学意义(P < 0.05, 图 3)。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Effect of ginsenoside CK on TGF-β1/Smads pathway related protein expression. SMMC-7721 cells were treated with ginsenoside CK (20, 40, 60 μmol·L-1) for 48 h. a: Vehicle; b: 20 μmol·L-1 ginsenoside CK; c: 40 μmol·L-1 ginsenoside CK; d: 60 μmol·L-1 ginsenoside CK. n = 3, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs vehicle

Western blot结果显示, 人参皂苷CK显著抑制了TGFβ1活化的Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4蛋白表达, 诱导了Smad7蛋白表达, 同时对凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达有促进作用, Bcl-2/Bax值下调(图 4)。TGF-β1与TGF-β1+人参皂苷CK组比较, 差异显著, 有统计学意义(P < 0.05)。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Effect of ginsenoside CK on TGF-β1/Smads pathway related protein and apoptosis related protein expression. SMMC-7721 cells were pretreated with ginsenoside CK (40 μmol·L-1), TGF-β1(10 ng·mL-1), TGF-β1 (10 ng·mL-1) + ginsenoside CK (40 μmol·L-1) for 48 h. n = 3, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs vehicle; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TGF-β1

Western blot检测(图 5)显示, 在TGF-β1/Smads通路被抑制后cleaved caspase-3表达显著上调, Bcl-2/Bax值显著下调, LY2109761组与空白对照组相比差异显著(P < 0.01)。加入人参皂苷CK后不能抑制TGF-β1/Smads通路相关蛋白及激活cleaved caspase-3表达, Bcl-2/Bax值也无明显变化。LY2109761组与LY2109761+人参皂苷CK组比较, 无统计学意义。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Effect of ginsenoside CK on TGF-β1/Smads pathway related protein and apoptosis related protein expression. SMMC-7721 cells were pretreated with ginsenoside CK (40 μmol·L-1), LY2109761 (10 μmol·L-1), LY2109761 (10 μmol·L-1) + ginsenoside CK (40 μmol·L-1) for 48 h. n = 3, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs vehicle

人参皂苷作为人参发挥药用价值的主要成分, 具有多项功能活性。已有研究证实人参皂苷Rh4通过激活结直肠癌细胞ROS/JNK/p53通路, 诱导细胞凋亡^[13]; 在小鼠模型中, 人参皂苷Rg5通过抑制PI3K/Akt通路诱导乳腺癌细胞凋亡^[14]。人参皂苷CK是天然二醇型人参皂苷在体内发挥药用活性的实体, 同时由于其潜在的药用价值受到广泛关注。本研究以人肝癌SMMC-7721细胞作为研究对象, 探讨人参皂苷CK抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用。MTT实验结果表明, 人参皂苷CK能降低人肝癌SMMC-7721细胞的生存率, 流式细胞仪检测发现细胞凋亡率逐渐增加, Western blot结果显示人参皂苷CK能激活cleaved caspase-3的表达, 下调Bcl-2/Bax值, 当cleaved caspase-3大量表达时, 能够促进细胞的凋亡。以上结果说明, 人参皂苷CK可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖, 诱导细胞凋亡。

TGF-β1/Smads通路可介导组织器官的正常生长和发育、胚胎发生、机体免疫等生物过程^{[15, 16]}。TGF-β1/Smads通路可以激活上皮间质转化^[17], 引起肿瘤的发生。TGF-β1/Smads通路与肿瘤细胞凋亡也密切相关, 已有学者证实TGF-β1/Smads通路参与直肠癌细胞、胰腺癌细胞的增殖和凋亡过程^{[18, 19]}。接受TGF-β1信号的膜上受体是一种跨膜蛋白, 分为TGF-β1Ⅰ型受体(TGFβRⅠ)、TGF-β1Ⅱ型受体(TGFβRⅡ)和Ⅲ型受体(TGFβRⅢ)。TGF-β1首先识别膜上的TGFβRⅡ并与其结合, 随后TGFβRⅡ与TGFβRⅠ形成复合物, 活化下游信号分子进而激活细胞内信号传导^[20]。本研究将采用TGF-β1/Smads通路作为靶点进行后续实验, 探究人参皂苷CK对人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡作用。利用Western blot法检测TGF-β1/Smads通路相关蛋白发现, 在40和60 μmol·L^-1人参皂苷CK作用下除了抑制型Smad7表达量明显上升之外, 其余蛋白均显著下调, 推测人参皂苷CK对TGF-β1/Smads通路具有抑制作用。

为了进一步确认人参皂苷CK对TGF-β1/Smads信号通路的作用, 本研究利用人重组蛋白TGFβ1作用于人肝癌SMMC-7721细胞。发现加入TGFβ1后TGF-β1/Smads信号通路处在高度激活的状态, 人参皂苷CK抑制了此激活作用同时促进cleaved caspase-3蛋白表达, 下调了Bcl-2/Bax值。而加入TGF-β1/Smads通路抑制剂LY2109761后, LY2109761阻断TGF-β1识别膜上受体TGFβRⅡ, 抑制下游蛋白表达, 并激活cleaved caspase-3蛋白表达。加入人参皂苷CK后对此作用无影响, Bcl-2/Bax值也无明显变化。以上结果从正、反两个方面证实了人参皂苷CK是通过抑制TGF-β1/Smads通路来诱导SMMC-7721细胞发生凋亡。

本研究结果显示, 人参皂苷CK能诱导SMMC-7721细胞发生凋亡, TGF-β1/Smads通路发挥了重要作用。今后将进一步结合体内实验深入探讨人参皂苷CK的促凋亡作用, 为人参皂苷CK抗肿瘤方面的药理作用提供实验依据。