脑卒中最早记载于《神农本草经》, 主要是以卒然昏仆、不省人事为主要病证, 并伴有半身不遂, 口眼斜、语言不利为兼证的病证^[1], 在西医上被称之为脑卒中, 通常表现为脑血栓、脑缺血、动脉粥样硬化等心血管疾病^[2]。传统中医学根据发病机制的不同, 将脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种。其中缺血性脑卒中最为常见, 临床实验表明所有脑卒中患者中缺血性脑卒中患者达到80%^[3]。而历代医家认为, 瘀血是造成脑卒中的关键因素及重要病机^[4], 气血虚者, 其经络多瘀滞, 则易导致脑卒中的发生, 中医诊断为气虚血瘀型脑卒中^[5-7]。现代医学表明, 缺血性脑卒中发病机制非常复杂, 主要与脑组织能量衰竭、炎症反应、细胞凋亡、免疫调节异常等机制有一定的关系^[8], 其临床表现复杂多样, 多是由病理性的代谢异常或形态改变而引起的。此外, 有研究发现, 糖尿病、高血压、心脏病也可导致脑卒中加重^[3]。

中药复方是复杂体系, 具有多成分、多靶点、多作用途径的特点, 在传统医学治疗疾病的过程中, 常常配伍多种中药, 以达到增效减毒的目的^[9]。复方的临床效果是机体体内复杂生物过程的一个综合结果, 有效成分组与相关药物靶点群研究是中药复方作用机制研究目前面临的两个重要难题^[10]。复方龙脉宁方由葛根、穿山龙、川芎、蜂胶4味中药所组成, 具有活血通脉的功效, 主要用于缺血性心脑血管类疾病, 如动脉粥样硬化、脑血栓、脑缺血和心绞痛等^[11]。在临床上对于治疗缺血性脑卒中所导致的肢体麻木、半身不遂、口眼歪斜和胸痹所导致的胸闷气短、心悸、失眠等症^[12], 具有很好的疗效, 但其药效物质基础的研究尚不明确。网络药理学是一种基于系统生物学与生物信息学结合方法理论, 它是通过生物系统进行网络分析, 从而来设计多靶点药物的学科, 它主要强调的是药物对多个靶点同时起作用, 调节多条信号通路, 最后达到增效减毒的目的, 为从分子角度研究中药复方的分子作用机制提供理论和方法, 并被广泛应用于中医药分子机制的研究^[13-15]。

本研究采用网络药理学的研究方法, 从复方龙脉宁化学物质组入手, 通过OB值、DL值分析遴选该复方中的潜在活性成分, 运用反向对接法筛选其对应的作用靶点。构建“成分-靶点”网络模型图, 靶蛋白之间的关系图, 以期阐明复方龙脉宁方治疗缺血性脑卒中的分子机制, 为其临床用药奠定理论基础, 为中药复方的质量控制奠定物质基础。

潜在活性成分的收集  复方龙脉宁方由葛根、穿山龙、川芎、蜂胶4味中药所组成。利用TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)数据库和查阅CNKI (http://www.cnki.net/)数据库中已报道的关于葛根、穿山龙、川芎、蜂胶这4味药的相关文献, 收集复方龙脉宁方组方中各单味药的主要化学成分进行ADME分析, 根据条件参数(OB≥30%, DL≥0.18)^[16]初步筛选出该复方潜在的活性成分。

作用靶点的预测与筛选  将收集到的各单味药的化学成分信息, 保存为mol2的格式, 输入到Pharmmapper (http://59.78.96.61/pharmmapper)数据库中, 将参数Select Targets Set设置为Human Protein Tagets Only (v2010, 2241), 其余参数均为默认设置。将所得到的所有靶点分别导入到UniProt (https://www.uniprot.org/)数据库中, 得到所有蛋白和Gene ID, 记录与活性成分相关的靶点信息。

将上述所得到的靶点信息与TTD (Therapeutic Target Database, http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)数据库、CNKI数据库中关于脑卒中的靶点进行比对分析, 最终筛选归纳出关于脑卒中的作用靶点。经文献查询, 发现糖尿病、高血压、心脏病也与脑卒中有一定的关系, 因此, 在这里同时对这3类疾病与该复方的各活性成分也进行了靶点的收集。

“成分-靶点”网络模型的构建  为了明确复方龙脉宁方治疗脑卒中的分子机制与相关靶点之间的对应关系, 本研究采用网络药理学模型的方法对其进行分析, 得到治疗脑卒中的主要成分以及关键靶点。首先将复方龙脉宁方中的中药与由上述得到的潜在活性成分制作成中药-成分对应关系表, 并将其保存为H-C.xlsx备用, 然后将复方龙脉宁方中所有化学成分与对应的靶点制作成相应的关系表, 保存为C-T.xlsx备用。最后, 将上述的两个表格依次导入Cytoscape3.5.0软件中, 构建“成分-靶点” (component-target, C-T)网络图。分别用不同的颜色和不同的形状的节点来代表所对应的成分和作用靶点。

复方龙脉宁方靶蛋白群网络模型构建与分析  将上述所得的关于疾病脑卒中的潜在靶点, 与活性成分分别汇总成表, 保存为.xlsx表格, 然后将其输入String (https://string-db.org/)数据库中, 得到复方龙脉宁方的靶蛋白互作模型图。将上述所得的复方龙脉宁方的“成分-靶点”网络模型进行拓扑分析与模块分析。首先, 将复方龙脉宁中的所建立的C-T.xlsx表与Table.xlsx表导入Cytoscape3.5.0软件中, 利用Network Analyzer工具分析靶点的连接度与中介中心度这2个网络拓扑参数。模块分析采用ClusterViz插件进行EAGLE聚类分析。EAGLE算法对建成PPI网络分析, 利用Cytoscape 3.5.0软件进行绘图, 参数设为默认值。将上述所得到的潜在靶点输入KEGG (http://www.kegg.jp/)数据库中, 通过输入靶基因名称列表, 限定物种为人, 其他均为默认设置, 最后对通路进行分析。

分子对接  为验证炎症靶点蛋白与其所对应的活性成分之间的结合活性, 利用软件SYBYL-X2.0, 将上述得到的靶点蛋白与其对应成分进行对接, 对其结果进行分析。

本研究运用中药网络药理学数据库TCMSP、CNKI数据库最终收集到复方龙脉宁方中这4味药所含的化学成分共220个, 其中葛根(GG) 18个, 蜂胶(FJ) 13个, 川芎(CX) 189个, 穿山龙(CSL) 9个。通过标准参数OB≥30%, DL≥0.18对其所有化学成分进行筛选, 最终遴选复方龙脉宁活性成分39个(表 1)。

表1(Table 1)

Table 1 Major ingredients table of Fufang Longmai Ningfang No. Ingredient Molecular formula GG1 Formononetin C16H12O4 GG2 Daidzein C15H10O4 GG3 3'-Methoxydaidzein C16H1 2O5 GG4 Beta-sitosterol C29H50O GG5 Daidzein-4, 7-diglucoside C27H30O14 GG6 Soyasapogenol A (P) C30H50O4 GG7 Soyasapogenol B (P) C30H50O3 GG8 Puerarin C21H20O10 GG9 Allantoin C4H6N4O3 FJ10 Acetylsalicylic acid C C9H8O4 FJ11 Chrysin C15H10O4 FJ12 Pinobanksin C15H12O5 FJ13 Galangin C15H10O5 FJ14 Quercetin dihydrate C15H14O9 FJ15 Acacetin C16H12O5 FJ16 Caffeic acid C9H8O4 FJ17 Phenethyl caffeate C17H16O4 FJ18 Apigenin C15H10O5 FJ19 Kaempferol C15H10O6 FJ20 Rhamnetin C16H12O7 FJ21 Rutin C27H30O16 FJ22 7, 4'-Di-O-methylapigenin C17H16O5 CSL23 Dioscin C45H72O16 CSL24 7-Epitaxol C47H51NO14 CSL25 Diosgenin palmitate C43H72O4 CSL26 Smitilbin C21H22O11 CX27 Ferulic acid C10H10O4 CX28 Tetramethylpyrazine C8H12N2 CX29 Rhein C15H8O6 CX30 Butylphthalide C12H14O2 CX31 Ligustilide C12H14O2 CX32 Neocinidilide C12H18O2 CX33 3-Butylideniphthalide C11H14O3 CX34 Perlolyrine C16H12N12O2 GX35 Wallichilide C20H16O7 CX36 Sitosterol C29H50O CX37 Mandenol C20H36O2 CX38 Free ammonia C19H19N7O6 CX39 Myricanone C15H10O8

Table 1 Major ingredients table of Fufang Longmai Ningfang

39个活性成分中有9个来自葛根, 13个来自川芎, 4个来自穿山龙, 13个来自蜂胶。在传统的中医药理论中, 常常通过配伍应用来达到增效减毒的目的。在复方龙脉宁方中, 葛根、川芎、穿山龙、蜂胶配伍使用, 具有活血通络、解毒化淤的功效。本方中葛根代表性成分为异黄酮类成分如葛根素、大豆皂醇等, 具有解热、镇痛、舒张血管、降血压、改善微循环障碍和心肌缺血的药理作用^[17-20]; 川芎代表性成分为川芎嗪、藁本内酯和丁基苯酞, 具有扩张血管, 降低血压、抗心肌缺血、抗脑缺血、抑制血小板凝集和抗血栓形成的药理作用^{[21, 22]}; 穿山龙代表性成分为薯蓣皂苷、土茯苓素, 具有抗炎、扩张冠状动脉和调节代谢的药理作用^[23]; 蜂胶代表性成分为芦丁、槲皮素、咖啡酸苯乙酯, 具有抗菌消炎、降低血压和抗氧化的药理作用^[24-26]。研究表明, 复方龙脉宁方治疗缺血性脑卒中是通过多成分-多靶点协同作用的结果。

为了解释复方龙脉宁方治疗脑卒中的作用机制, 将上述39个活性分子通过Pharmmapper服务器所获取的靶点与TTD数据库中的靶点进行对比校正, 最终得到复方龙脉宁方中总靶点数1 705个, 其中川芎451个, 葛根437个, 蜂胶392个, 穿山龙425个, 其中与脑卒中相关的靶点数为17个。复方龙脉宁方中39个潜在活性成分和治疗脑卒中17个靶点通过Cytoscape软件构建“成分-靶点”网络关系图, 发掘复方龙脉宁方治疗脑卒中的关键成分和关键靶点及其之间的相互关系, 如图 1所示。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 "Ingredient-target" network diagram of Fufang Longmai Ningfang

在图 1中用成分名以及Uniprot数据库中的靶点Gene ID来代表网络图中不同的靶点。其中, 红色的节点表示复方龙脉宁方中4味中药的潜在活性成分, 绿色的节点表示对有效成分群具有潜在结合作用的靶点, 也就是与脑卒中相关的靶点。如图 1所示, 节点的中心度越高, 则表示该成分能够作用于更多的靶点, 也就是说, 能够在生理及病理过程中更多地参与调节作用。靶点分析依然如此, 节点的中心度越高, 则表示该靶点与较多的成分发生作用, 在治疗疾病时与药物作用关系越密切。“成分-靶点”网络图进一步分析可以发现, 葛根素、大豆苷元等异黄酮类成分的中心度较高(葛根素的中心度为7, 大豆苷元的中心度为5)。

通过KEGG数据库对复方龙脉宁方治疗脑卒中的关键靶点进行通路的富集分析, 发现共有14条代谢通路(图 2), 其中有7条通路排在最前面, 分别是糖酵解/糖异生(glycolysis / gluconeogenesis)、碳代谢(carbon metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、果糖和甘露糖代谢(fructose and mannose metabolism)、戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)、肌醇磷酸代谢(inositol phosphate metabolism)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)。在糖酵解/糖异生代谢通路中, 糖酵解酶的紊乱会导致贫血的发生, 贫血会导致氧气的不足, 而在现代研究中, 低氧诱导因子(HIF-1α)是在低氧状态时产生的一种转录调节因子, 它可以减轻心肌缺血再灌注引起的炎性损伤, 其作用机制可能与抑制炎症相关的通路TLR4/NF-κB信号通路有关^[27], 供血不足易发生低氧的症状, 低氧又与炎症关系紧密, HIF-1α可以降低炎症因子IL-6、IL-2和TNF-α的增加, 减轻炎症反应, 而缺血性脑卒中的关键因素就是供血不足导致的炎症反应, 因此, 这也可能成为复方龙脉宁方治疗脑卒中的机制。除此之外, HIF在调节转录时, 可能是通过激活HIF-VEGF-eNOS信号, 促进NO分子的形成, 从而促进血管的生成, 从而达到治疗脑卒中的效果。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway in the treatment of stroke target by Fufang Longmai Ningfang

为了研究复方龙脉宁方中靶蛋白之间的关系, 本研究对复方龙脉宁方靶点群进行“蛋白-蛋白”网络关系图的构建, 得到图 3。图 3分析可知, 复方龙脉宁方中各靶点之间的关系密切, 存在相互协同的作用。如血管紧张素转换酶(ACE)与肾素(REN)、P-选择素(SELP)、盐皮质激素受体(NR3C2)、胰岛素受体(INSR)存在相互作用的关系, 结合成分-靶点对应关系可知, 与靶点蛋白血管紧张素转换酶存在相互作用的成分为穿山龙中的土茯苓素, 与靶点蛋白肾素存在相互作用的为蜂胶中的短叶松素, 与靶点蛋白P-选择素存在相互作用的是川芎中的3H-川芎哚。这也更好地验证了复方龙脉宁各成分间存在着相互协同的作用, 共同参与疾病的治疗过程, 与传统中医理论协同增效的理论相统一。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 "Protein-protein" network diagram of Fufang Longmai Ningfang

为了确定复方龙脉宁方的关键成分和关键靶点, 本研究对复方龙脉宁方中所含的各有效成分及其对应靶点进行拓扑分析。采用Cytoscape软件3.5.0中的Network Analysis工具来分析不同网络的拓扑参数, 根据中介中心度与连接度来衡量节点在网络中的中心度, 1个节点度代表网络中和节点相连的路线的条数。化合物和靶点之间的节点越多, 则这些成分与靶点就可能是其中的关键成分和关键靶点。表 2为复方龙脉宁方中的各成分与靶点拓扑分析结果, MMP3、KDR、ALB可能为该复方治疗脑卒中的关键靶点蛋白。除此之外, 本研究采用EAGLE算法进行模块分析, 进一步展现各成分与其对应靶点及疾病之间的关系, 根据节点的不同, 将靶点分为3个模块, 不同的模块参数如表 3所示。

表2(Table 2)

Table 2 Analysis of topological properties of stroke targets of Fufang Longmai Ningfang Number Gene Degree Betweenness centrality 1 MMP3 36 0.199 3 2 KDR 33 0.179 1 3 ALB 33 0.126 9 4 TGFB2 24 0.065 6 5 MMP9 23 0.106 6 6 NOS3 21 0.041 5 7 SOD2 19 0.032 8 8 IL2 18 0.031 4 9 PARP1 16 0.022 4 10 NOS2 9 0.005 8 11 CPB 4 0.009 3 12 PLAU 4 0.002 9 13 TEK 3 0.000 0 14 PGF 3 0.000 0 15 PLAT 1 0.000 0 16 ANG 1 0.000 0 17 PLG 1 0.000 0

Table 2 Analysis of topological properties of stroke targets of Fufang Longmai Ningfang

表3(Table 3)

Table 3 Modular analysis of stroke targets of Fufang Longmai Ningfang Module number No.1 No.2 No.3 Network Rank 1 2 3 Nodes 13 7 4 Edges 47 16 6 Modularity 3.615 0.64 0.222 Indeg 47 16 6 Outdeg 13 25 27

Table 3 Modular analysis of stroke targets of Fufang Longmai Ningfang

为了更好地说明炎症靶点蛋白与相对应的活性成分之间的结合活性, 阐明复方龙脉宁方可能是通过抑制炎症反应治疗缺血性脑卒中, 本研究选取由“作用靶点的预测与筛选”得到的炎症因子与其对应的活性化合物进行分子对接分析。利用SYBYL-X 2.0软件^[28]进行分子对接和阳性验证实验, 对接得分结果见表 4、5。

表4(Table 4)

Table 4 Docking results of the partial active compound with inflammation targets Target Compound Total score NOS2 CSL26 6.197 3 NOS2 CX34 5.280 6 NOS2 GX35 6.040 2 NOS2 CX38 5.476 2 NOS3 FJ17 5.389 5 NOS3 FJ21 6.114 5 NOS3 CSL23 7.162 9 NOS3 CSL24 6.934 6 NOS3 CSL25 7.423 3 NOS3 CX33 5.018 1 NOS3 GX35 5.376 5 NOS3 CX36 6.828 3 NOS3 CX37 8.146 5 NOS3 CX38 6.935 NOS3 CX39 5.248 7 MMP9 GG3 6.038 4 MMP9 GG4 7.215 5 MMP9 GG5 6.257 9 MMP9 FJ15 6.384 2 MMP9 FJ17 7.113 9 MMP9 CSL26 6.372 1 MMP9 CX33 5.469 2 MMP9 CX34 5.800 8 MMP9 GX35 7.132 8 MMP9 CX37 7.836 5 MMP9 CX38 7.522 6 IL2 FJ21 5.389 5 IL2 CSL25 4.727 1 MMP3 GG4 5.694 9 MMP3 GG5 5.244 MMP3 FJ11 5.435 5 MMP3 FJ13 5.182 3 MMP3 FJ14 5.523 1 MMP3 FJ17 6.085 8 MMP3 FJ19 5.836 3 MMP3 FJ20 6.360 2 MMP3 FJ21 6.315 4 MMP3 CSL25 6.472 1 MMP3 CX33 5.547 4 MMP3 GX35 7.055 5 MMP3 CX36 6.420 8 MMP3 CX37 6.931 8 MMP3 CX38 7.962 3 PARP1 GG3 5.644 1 PARP1 GG4 6.630 3 PARP1 GG5 6.296 6 PARP1 FJ17 8.120 3 PARP1 CSL25 7.28 PARP1 CSL26 8.227 1 PARP1 CX30 5.503 6 PARP1 CX31 5.337 4 PARP1 CX33 6.871 6 PARP1 CX36 7.631 5 PARP1 CX39 5.555 9 IL2 CSL26 5.148 1 IL2 GX35 4.300 3

Table 4 Docking results of the partial active compound with inflammation targets

表5(Table 5)

Table 5 Target protein docking results with ligands Target name Ligand Total score NOS2 SO4 4.288 2 NOS3 ZN 0.689 6 MMP3 ZN 0.459 7 MMP9 ZN 0.516 9 PARP1 SO4 3.629 5 IL2 GOL 3.551 4

Table 5 Target protein docking results with ligands

将表 4中的小分子与其所对应的靶点蛋白的对接得分和表 5的靶点蛋白与相应的配体得分(阳性对照)相比较, 可以看出, 炎症靶点蛋白与所对应的活性分子具有一定的结合活性。文献表明^[29], 对接得分≥4.25, 说明分子与靶点有一定的结合活性; 对接得分 > 5.0, 说明有较好的结合活性; 对接得分 > 7.0, 说明分子与靶点具有强烈的结合活性。并且, 阳性对照的对接得分不高于小分子与靶点蛋白的对接得分。由此可以得知, 复方龙脉宁方可能是通过特定成分作用于炎症靶点蛋白来抑制炎症反应的发生, 由此来达到治疗脑卒中的目的。

此外文献记载, 糖尿病、高血压、心脏病是发生缺血性脑卒中的危险因素, 这3种疾病会使本身患有脑卒中的患者病情加重^[3]。因此, 本研究在复方龙脉宁方用于治疗缺血性脑卒中的基础上对这3种疾病与缺血性脑卒中之间的关系进行了研究。本研究采用上述同种研究方法对复方龙脉宁方进行潜在靶标的预测, 筛选出关于糖尿病、高血压、心脏病的靶点, 其中糖尿病的靶点数为31个, 高血压为20个, 心脏病为1个, 糖尿病与脑卒中的共有靶点数为4个, 高血压与脑卒中的共有靶点数为2个, 心脏病与脑卒中的共有靶点数为1个。最后根据不同成分对应不同的靶点, 各靶点对应不同的疾病进行“成分-靶点-疾病”网络模型的构建。图 4是对复方龙脉宁方中的4味中药中的有效成分化学群进行这3种疾病与脑卒中的潜在活性成分靶点进行预测、筛选所得到的“成分-靶点-疾病”网络图。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 "Ingredient-target-disease" network diagram of Fufang Longmai Ningfang

研究发现, NOS2和NOS3为治疗脑卒中、高血压、糖尿病的共有靶点; 靶点IL-2、PARP1为脑卒中与糖尿病的共有靶点; 血管生成素(ANG)为脑卒中与心脏病的共有靶点。其中糖尿病与脑卒中的关系更为密切(靶点数为4个)。已有文献记载, 高血糖除了是糖尿病的主要症状外, 还可导致氧化应激和炎症反应而损伤血管, 使蛋白激酶C (PKC)和Rho激酶激活、内皮素系统及基质金属蛋白酶(MMP9)上调等^[30], 从而促进脑卒中的发展。除此之外, 又有研究发现, NOS在辅助因子四氢生物蝶呤参与下, 通过氧化L-精氨酸及还原氧生成NO^[31]。在生理条件下, 由NOS生成的NO是内源性血管保护分子, 有舒张血管、抑制血小板聚集、改善缺血区血流量、抑制白细胞黏附于内皮细胞而清除氧自由基、抗炎等作用^[32], 从而对于缺血性脑卒中有很好的治疗作用。ANG具有非常强的促进血管再生的能力, 能够使血管稳定、抑制内皮细胞的凋亡, 是一种能够促进血管修复的细胞因子, ANG治疗脑缺血脑卒中的作用机制有两方面, 其一可能是通过维持血管内皮细胞的结构形态完整; 其二是可能通过减轻脑血管炎症反应过程来实现保护作用^[33]。

实验研究表明, 葛根异黄酮类成分具有扩张血管、抗血栓和降脂降压的药理作用^[20]。其中葛根素通过诱导缺血心肌血管的再生来治疗心肌缺血, 其机制可能是激活HIF-VEGF-eNOS信号转导通路中1个或几个分子, 从而促进NO分子的形成, NO和其他分子一起促进内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。除此之外, 还能提高PGI2/TXA2水平, 降低儿茶酚胺生成, 从而降低血黏度、抑制血栓形成^{[34, 35]}, 达到治疗缺血性脑卒中的目的。已有文献报道, NOS3与NOS2对于缺血性脑卒中具有很好的治疗效果。川芎中的川芎嗪治疗缺血性脑卒中主要通过两方面。其一, 能有效抑制脑缺血-再灌注时白介素的合成^[36]; 其二, 抑制脑缺血-再灌流后TNF-α的表达, 使白介素的表达提前, 从而对抗脑缺血-再灌注损伤, 治疗缺血性脑卒中^[37]。穿山龙中的薯蓣皂苷的中心度也相对较高(薯蓣皂苷的中心度为10)。研究发现, 薯蓣皂苷不仅可以增加小鼠心肌营养性血流量, 同时, 还可以降低β/α脂蛋白的比率, 改善冠脉循环, 这对于治疗缺血性脑卒中有非常重要的作用^[38], 同时它也对IL-2起到一定的作用, 可以抑制炎症的发生和细胞凋亡。蜂胶水提液具有明显的抗炎作用, 主要通过抑制5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)的活性来发挥抗炎作用, 并能有效地抑制血小板凝集、抑制前列腺素E₂ (PEG₂)合成, 具有神经保护和免疫调节的作用^{[39, 40]}。

血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)的靶点具有很高的中心度(VEGFR-2中心度为25)。VEGFR-2是VEGF的受体, 与VEGF-A结合后能增强内皮细胞有丝分裂、改善内皮细胞的抗凋亡作用, 增强血管通透性以及血管新生^{[41, 42]}。在缺血性脑卒中发生早期, VEGF及VEGFR-2水平升高可以保护血管内皮, 改善微循环, 促进侧支循环建立, 改善缺血区域再灌注以及减轻炎症反应, 从而达到神经保护作用^{[43, 44]}。已有文献报道, VEGFR-2为治疗脑卒中的关键靶点^[45]。近年来, 基质金属蛋白酶(MMPs)被视为治疗缺血性脑卒中的新靶点^[46]。MMP9在周围脑血管的基底层中起着非常重要的作用, 它可以通过调节亲和抗血管生成因子之间的平衡, 介导VEGF的蛋白活化, 促使神经血管重塑^[47-49]。据文献记载, 脑卒中患者的神经功能损伤程度与机体所含血清白蛋白呈负相关^[50], 引发重症脑卒中的危险因素之一可能就是低蛋白血症^[51]。并且, 脑卒中患者低蛋白血症对神经功能的远期预后, 也会产生不良影响^[52]。因此, 对于白蛋白的调控至关重要。

研究发现, 复方龙脉宁方中的4味中药具有明显的抗血栓、抑制炎症反应、增加心血管形成的作用, 对于治疗缺血性脑卒中有很好效果。除此之外, 不同的成分对应多个靶点, 而不同的靶点又对应多个的成分, 从分子水平揭示中药复方多成分多靶点协同作用的特点。

从靶点群相关性分析发现, 脑卒中与高血压、心脏病、糖尿病这3类疾病均有共同的蛋白质靶点群。因此, 复方龙脉宁方不仅可以用来治疗缺血性脑卒中, 还可对患有糖尿病、心脏病、高血压的患者进行一定的治疗, 在临床上也有过类似的用法。综上所述, 本研究从分子角度初步揭示中药复方异病同治的分子机制, 为中药复方老药新用奠定理论基础。

通过利用网络药理学的分析方法, 其中包括靶点预测、构建网络模型、KEGG通路分析, 阐述了复方龙脉宁方组方中治疗脑卒中的39个活性分子, 分别以葛根素等异黄酮类、川芎嗪类生物碱、薯蓣皂苷类等为代表的有效物质群; 通过靶点预测得到了17个与治疗脑卒中有关的作用靶点, 其中NOS2、NOS3、ANG、MMP3、MMP9、SOD2在治疗脑卒中方面起着非常重要的作用。对经典复方“复方龙脉宁方”治疗缺血性脑卒中的分子机制进行初步的阐述, 并对其进行通路分析, 发现复方龙脉宁方在治疗脑卒中时可能有以下3种途径: ①可能是通过激活HIF-VEGF-eNOS信号转导通路中的几个分子, 从而促进内皮细胞的增殖、迁移和血管的生成、增强血管通透性; ②可能与抑制炎症相关的通路TLR4/NF-κB信号通路有关, 供血不足导致缺氧, 而低氧与炎症关系密切, HIF-1α可以降低炎症因子IL-6、IL-2和TNF-α的增加, 从而减轻心肌缺血再灌注引起的炎性损伤; ③可能与其抑制5-LOX的活性来发挥抗炎作用, 从而有效抑制血小板凝集、保护神经和增强免疫调节来达到治疗脑卒中的效果。此外, 复方龙脉宁方在治疗脑卒中的同时对于糖尿病、高血压、心脏病也有一定的治疗作用。本研究初步阐明了复方龙脉宁方的分子作用机制, 为传统复方的临床用药提供理论基础。