药学学报  2019, Vol. 54 Issue (8): 1484-1492     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0327   PDF    
雷公藤甲素衍生物雷腾舒的体外代谢研究
徐叶1,2, 杜江波1, 冯慧瑾1, 左建平1, 许红涛1, 李援朝1, 钟大放1,2     
1. 中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室, 上海 201203;
2. 中国科学院大学, 北京 100049
摘要: 本课题的目的是研究雷公藤甲素衍生物雷腾舒的体外代谢特征。将雷腾舒分别与人、猴、犬、大鼠或小鼠的肝细胞一起孵育,共鉴定出4个代谢物,分别为环氧水解开环代谢物(M1)、谷胱甘肽结合代谢物(M2)和单氧化并谷胱甘肽结合代谢物(M3-1和M3-2)。在人或大鼠肝微粒体孵育体系中,共鉴定出7个代谢物,分别为脱氢代谢物(M4)和单氧化代谢物(M5-1~M5-6)。通过化学半合成和大鼠原代肝细胞孵育的方法获得代谢物的对照品,并与以上代谢物相比对,确认了5个代谢物的结构,分别为12,13-环氧水解开环代谢物M1、12-谷胱甘肽结合代谢物M2、(16S)-单羟基化代谢物M5-1、(2R)-单羟基化代谢物M5-4和(19R)-单羟基化代谢物M5-5。体外活性评价显示,仅(2R)-羟基化代谢物表现出弱的免疫抑制活性,其活性不足母体药物的十分之一,同时毒性也显著降低。提示雷腾舒可能在体内经历代谢失活和减毒。
关键词: 雷腾舒     药物代谢     代谢物鉴定     肝细胞     肝微粒体    
Studies on the metabolism of a triptolide derivative (5R)-5-hydroxytriptolide in vitro
XU Ye1,2, DU Jiang-bo1, FENG Hui-jin1, ZUO Jian-ping1, XU Hong-tao1, LI Yuan-chao1, ZHONG Da-fang1,2     
1. State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: The purpose of current study is to investigate the metabolic profile of a triptolide derivative (5R)-5-hydroxytriptolide in vitro. (5R)-5-Hydroxytriptolide was incubated with the hepatocytes of human, monkey, dog, rat or mouse, respectively. Compared with inactivated hepatocytes, four metabolites were identified in hepatocytes from all five species:oxidative ring-opening metabolite (M1), glutathione-conjugating metabolite (M2), and monooxidative combined with glutathione-conjugating metabolites (M3-1 and M3-2), respectively. In human or rat liver microsomes, seven metabolites of (5R)-5-hydroxytriptolide were found, dehydrogenated metabolite (M4) and monooxidative metabolites (M5-1-M5-6), respectively. Reference standards for the metabolites were obtained either through chemical semisynthesis or biotransformation through rat primary hepatocytes. The structures of five metabolites were confirmed, which were 12, 13-epoxy ring-opening metabolite M1, 12-glutathione-conjugating metabolite M2, (16S)-, (2R)- and (19R)-monohydroxylated metabolites M5-1, M5-4, and M5-5, respectively. In vitro activity assay revealed that only (2R)-hydroxylated metabolite exhibited weak immunosuppressive activity with less than one-tenth the activity of its parent drug, and a significant decrease in toxicity was observed. It is suggested that (5R)-5-hydroxytriptolide might undergo metabolic inactivation and detoxification in vivo.
Key words: (5R)-5-hydroxytriptolide     metabolism     metabolite confirmation     hepatocytes     liver microsomes    

雷公藤甲素是中药雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. F., TwHF)有效成分中最具代表性的化合物, 于1972年从雷公藤中提取分离出来, 为环氧二萜内酯类化合物, 具有抗炎、免疫抑制[1, 2]以及广谱的抗癌活性[3]。然而, 雷公藤甲素也历来被认为是雷公藤毒性的主要来源, 例如肝、肾、生殖系统毒性等[4, 5], 这些都极大地限制了雷公藤甲素的临床应用。为了得到具有良好成药性的雷公藤内酯醇衍生物, 药物化学家对其进行了大量的结构改造[6]。雷腾舒作为雷公藤甲素结构改造的衍生物之一, 是雷公藤甲素(5R)-位羟基化衍生物, 与雷公藤甲素具有类似的药理活性[7, 8]

雷腾舒作为1类新药, 2008年申请临床, 申报适应证为“类风湿性关节炎”, 并于2009年获得临床试验批件。2017年雷腾舒又以新的适应证—艾滋病慢性异常免疫激活—向国家食品药品监督管理局提出了申请, 并于2018年获得了临床试验批件(http://www.sphchina.com/news_center/news_detail.html?id=29)。

尽管雷腾舒的药理活性得到了广泛的关注和研究, 但目前与其药物代谢相关的研究报道则相对较少。在前期的研究中[9], 作者发现与雷公藤甲素类似, 雷腾舒也主要由CYP3A4 (占64.2%)代谢, 但未对其代谢物进行表征。

结合以上背景, 本研究的目的是通过体外代谢模型(肝细胞和肝微粒体)研究雷腾舒的代谢特征, 并对雷腾舒的代谢物结构进行确证, 为临床研究提供一定的支持。

材料与方法

材料与试剂  雷腾舒(批号: T8-235-95, 99.11%)由上海医药集团中央研究院合成室提供(中国), 地塞米松(批号: Y16N6C5757)购自上海源叶生物科技有限公司(中国), 雷公藤甲素(批号: O1006AS)购自大连美仑生物技术有限公司(中国), 大鼠(批号: 21027)和人(批号: 23418)肝微粒体购自BD公司(Woburn, MA, USA), 混合原代人肝细胞(批号: 1410266)、混合原代食蟹猴肝细胞(批号: 1610047)、混合原代雄性比格犬肝细胞(批号: 1610325)、混合原代雄性Sprague-Dawley大鼠肝细胞(批号: 1610175)和混合原代雄性CD-1小鼠肝细胞(批号: 1510134)购自美国Xenotech公司, 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(批号: 10380624, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)购自德国罗氏公司, 羧甲基纤维素钠(批号: SLBT6423, sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), 甲醇(批号: I0951807816)和乙腈(批号: JA06330, HPLC级)购自德国Merck公司(Darmstadt, Germany), 甲酸(批号: 37UHN-HN, 分析纯)购自Fluka公司(St. Louis, MO, USA); 去离子水由Millipore Milli-Q纯水仪制备(Millipore, Molsheim, France)。其他试剂如未经特殊说明, 均购自国药集团, 分析纯。

体外肝细胞孵化实验  雷腾舒储备液由DMSO制备。每个孵化体系总体积为100 μL, 介质为William's Medium E培养基(pH 7.4), 包括细胞密度为每毫升1.0×106个肝细胞和终浓度为50 μmol·L-1的雷腾舒, 37 ℃孵化, 在反应180 min后加入冰冷乙腈100 μL终止反应, 所有孵化样本均为双样本。将孵化样品双样本合并, 全取合并样品, 加入乙腈400 μL, 涡流1 min, 离心5 min (11 000 ×g), 取出全部上清液置于10 mL试管中, 于40 ℃氮气流下吹干, 残留物以乙腈-水(1:9) 120 μL复溶。取复溶液5 μL用于UPLC-UV/Q TOF 5600+ MS进样分析。

体外肝微粒孵化实验  孵育体系(200 μL)包括磷酸缓冲液(100 mmol·L-1, pH 7.4), 大鼠或人肝微粒体(1 mg·mL-1), 雷腾舒(50 μmol·L-1)和NADPH (2 mmol·L-1)。每一反应体系都重复双样本, 以不加NADPH的体系作为阴性对照组。37 ℃孵育1 h后, 用两倍体积的冰冷乙腈(400 μL)终止反应。混合物涡流混匀后, 11 000 ×g离心5 min, 全部取上清转移至玻璃管中, 于40 ℃氮气流下吹干, 残留物以乙腈-水(1:9) 120 μL复溶。取复溶液5 μL用于UPLC-UV/Q TOF 5600+ MS进样分析。

体外肝微粒代谢稳定性  孵育体系(100 μL)包括磷酸缓冲液(100 mmol·L-1, pH 7.4), 大鼠或人肝微粒体(1 mg·mL-1), 雷腾舒(3 μmol·L-1)和NADPH (2 mmol·L-1)。每一反应体系都重复双样本。37 ℃孵育, 大鼠肝微粒体孵育样本分别于0、5、10、15、30、45和60 min的时间点, 人肝微粒体于0、20、40 min、1、2、3、6 h的时间点, 用等体积含内标(雷公藤甲素1 μmol·L-1)的冰冷乙腈(100 μL)终止反应。混合物涡流混匀后, 11 000 ×g离心5 min, 全部取上清于40 ℃氮气流下吹干, 残留物以乙腈-水(1:9) 120 μL复溶。雷腾舒的检测采用文献[9]中的非衍生化的检测条件。

仪器和检测条件

代谢物的检测  使用Triple TOF 5600+型四极杆-飞行时间串联质谱仪(Q-TOF MS), 配备电喷雾电离源(ESI源)和CDS自动校正系统, 美国Applied Biosystems公司; Acquity UPLC液相色谱系统, 包括二元输液泵、自动进样器、柱温箱、脱气机, 美国Waters公司。

色谱分离  采用Waters柱子(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm ID), 柱温设为40 ℃, 自动进样器温度为4 ℃。流动相为5 mmol·L-1醋酸铵水溶液含0.1%甲酸(A相)和乙腈(B相), 流速为0.4 mL·min-1, 采用梯度洗脱, 0~3.00 min, 5% B相, 3.00~15.00 min, B相从5%增加到45%, 15.00~17.00 min, B相从45%增加到99%, 17.00~21.00 min, B相从99%降到5%。

质谱检测  通过Triple TOF 5600+ MS (AB Sciex)。质量范围设为m/z: 100~1 000, 电喷雾电离源, 正离子检测模式, 离子源电压为5 500 V, 源温度为550 ℃, 离子源气体1为55 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa), 离子源气体2为55 psi, 气帘气体为40 psi, 去簇电压为80 V。一级全扫描时碰撞能量为10 eV, 产物离子扫描时碰撞能量为20 ± 10 eV, 扫描范围为m/z 100~1 000, 采用自动校正系统(CDS)外标法校正质量数, 信息相关扫描方式(information-dependent acquisition, IDA)和质量亏损过滤(mass defect filter, MDF)共同用于激发二级质谱采集。

代谢物对照品制备

化学合成法制备代谢物  代谢物对照品的制备, 主要通过两种方法:化学合成法和生物转化法。化学合成共得到5个雷腾舒的衍生物, 如路线图 1所示。其中化合物3的合成方法已在之前的文章中描述过[10], 采用二氧化硒(SeO2)分别氧化(16S)-羟基雷公藤内酯酮(hydroxytriptolide)和(16R)-羟基雷公藤内酯酮[11]的烯丙位(C-5)得到相应的C-5位羟基化合物4a5a, 然后用硼氢化钠(NaBH4)还原其C-14位羰基得到化合物45。化合物1245的合成过程描述如下。

Figure 1 Metabolic profiles of (5R)-5-hydroxytriptolide in human (A), monkey (B), dog (C), rat (D) and mouse (E) hepatocyte

化合物1的合成:称取雷腾舒(25 mg, 0.065 mmol)置于100 mL反应瓶中, 加入磷酸缓冲溶液50 mL (pH = 4.0), 回流反应24 h, 冷却到室温后, 加入二氯甲烷萃取, 依次用饱和食盐水、清水洗涤, 二氯甲烷层浓缩后经HPLC分离得到化合物1 (11.5 mg, 0.029 mmol, 45%, 白色固体)。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 4.94 (dd, J = 14.9, 10.7 Hz, 2H), 4.02 (dd, J = 5.5, 1.7 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.33 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 3.25 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 2.48~2.00 (m, 4H), 1.90~1.71 (m, 1H), 1.31 (dd, J = 11.8, 3.7 Hz, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.91 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 175.7, 161.8, 128.4, 77.8, 76.3, 73.1, 70.6, 70.1, 65.3, 61.9, 60.4, 59.5, 41.4, 31.5, 28.5, 26.0, 18.1, 17.1, 16.0, 15.9; HRMS (ESI) Calcd. for C20H27O8 [M+H]+ 395.170 6, found 395.171 1。

化合物2的合成:称取还原性谷胱甘肽(76.8 mg, 0.25 mmol)置于100 mL反应瓶中, 加入碳酸钠缓冲溶液(pH 9.2) 20 mL, 然后用NaOH溶液(0.5 mol·L-1)调pH 8.4, 之后加入溶有雷腾舒(20 mg, 0.05 mmol)的四氢呋喃溶液5 mL, 室温搅拌反应过夜后, 加入二氯甲烷萃取, 依次用饱和食盐水、清水洗涤, 二氯甲烷层浓缩后经HPLC分离得到化合物2 (26.6 mg, 0.039 mmol, 79%, 白色固体)。1H NMR (300 MHz, D2O) δ 4.91 (q, J = 18.4 Hz, 2H), 4.53 (dd, J = 9.4, 4.6 Hz, 2H), 3.92 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 9.8 Hz, 2H), 3.56 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 3.44 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.31 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.28~3.14 (m, 2H), 2.91 (dd, J = 14.1, 9.7 Hz, 1H), 2.51~2.14 (m, 7H), 2.12~1.92 (m, 4H), 1.63 (dq, J = 8.5, 6.4 Hz, 1H), 1.26 (dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 1H), 0.96 (s, 3H), 0.84 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.74 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, D2O) δ 176.2, 175.8, 174.8, 171.5, 160.3, 126.8, 78.1, 74.2, 71.4, 69.9, 66.9, 60.5, 60.0, 58.8, 53.9, 52.6, 45.5, 43.0, 39.7, 33.1, 31.2, 29.0, 28.4, 26.8, 23.9, 16.1, 15.6, 14.6, 14.4; HRMS (ESI) Calcd. for C30H42N3O13 [M+H]+ 684.243 8, found 684.244 5。

Scheme 1 The processes of the synthesis of compounds 1-5 (a-d)

化合物4的合成:称取化合物4a (20 mg, 0.051 mmol)置于10 mL反应瓶中, 加入甲醇1 mL, 冷却到0 ℃之后加入NaBH4 (3.8 mg, 0.1 mmol), 搅拌反应30 min后, 经HPLC分离得到化合物4 (5.1 mg, 25%, 白色固体)。1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 4.96~4.91 (m, 2H), 3.87 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 3.68 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 3.49 (s, 1H), 3.46 (dd, J = 10.9, 7.8 Hz, 1H), 3.40~3.34 (m, 2H), 2.29 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.40~2.12 (m, 3H), 2.14~1.99 (m, 2H), 1.82 (td, J = 11.9, 6.2 Hz, 1H), 1.64~1.55 (m, 1H), 1.25 (dd, J = 12.8, 5.4 Hz, 1H), 1.14 (s, 3H), 0.97 (d, J = 7.1 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 174.5, 162.2, 125.7, 72.8, 70.7, 68.9, 63.3, 62.4, 62.2, 61.2, 58.9, 56.5, 54.9, 40.4, 36.5, 30.5, 23.4, 16.7, 15.4, 11.4; HRMS (ESI) Calcd. for C20H25O8 [M+H]+ 393.154 9, found 393.154 9。

化合物5的合成:称取化合物5a (15 mg, 0.038 mmol)置于10 mL反应瓶中, 加入甲醇1 mL, 冷却到0 ℃后加入NaBH4 (2.9 mg, 0.076 mmol), 搅拌反应30 min后, 经HPLC分离得到化合物5 (3.6 mg, 24%, 白色固体)。1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 4.97~4.90 (m, 2H), 3.88 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 11.1, 6.3 Hz, 1H), 3.58~3.56 (m, 2H), 3.51 (dd, J = 11.1, 6.5 Hz, 1H), 3.36 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 2.29 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.25~2.15 (m, 3H), 2.14~2.00 (m, 2H), 1.96 (dt, J = 14.0, 7.0 Hz, 1H), 1.82 (td, J = 12.0, 6.2 Hz, 1H), 1.63~1.55 (m, 1H), 1.27~1.19 (m, 1H), 1.14 (s, 3H), 0.97 (d, J = 7.1 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 174.6, 162.2, 125.7, 72.3, 70.7, 68.9, 63.9, 63.3, 62.3, 61.2, 59.0, 56.4, 55.1, 40.4, 38.8, 30.5, 23.4, 16.7, 15.4, 11.1; HRMS (ESI) Calcd. for C20H25O8 [M+H]+ 393.154 9, found 393.154 7。

Scheme 2 The process of obtaining of compounds 6 and 7

通过生物转化法制备代谢物对照品  雄性Sprague-Dawley大鼠(6~8周龄, 200~220 g)购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号: SCXK (沪) 2007-0005], 被饲养于清洁级动物饲养房中, 动物房中温度恒定, 相对湿度恒定, 12 h昼夜循环。所有动物实验均经过中国科学院上海药物研究所实验动物伦理委员会批准。

连续3天灌胃给予地塞米松(50 mg·kg-1·d-1, CMC-Na混悬), 利用两步灌流法分离制备大鼠原代肝细胞。代谢物的生物转化是将雷腾舒100 μmol·L-1与自制的大鼠肝原代细胞混悬液(每毫升1.0×106个细胞)共同孵化, 孵化体积为50 mL, 共10份, 37 ℃孵育4 h, 收集孵化液, 离心去除沉淀后, 浓缩, 利用半制备液相分离纯化, 最终得到两个单加氧的代谢物67 (路线图 2)。

Figure 2 Metabolite profiles of (5R)-5-hydroxytriptolide in human (A) and rat liver microsomes (B)

化合物6 (白色固体): 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 5.04~4.90 (m, 1H), 4.49 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 3.86 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 3.58 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 3.47 (s, 1H), 3.35 (s, 1H), 2.38 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.28~2.20 (m, 1H), 2.18 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 2.05 (dd, J = 13.9, 5.8 Hz, 1H), 1.43 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 1.32 (s, 3H), 0.99 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 175.0, 165.7, 127.6, 73.8, 72.2, 70.0, 65.6, 64.6, 62.9, 60.4, 60.1, 58.2, 56.1, 41.8, 34.5, 31.8, 29.2, 20.1, 18.0, 17.1; HRMS (ESI) Calcd. for C20H25O8 [M+H]+ 393.154 9, found 393.155 9。

化合物7 (白色固体): 1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 6.45 (s, 1H), 3.88 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 3.60 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 3.50 (s, 1H), 3.36 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 2.49 (dd, J = 15.8, 5.2 Hz, 1H), 2.38 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 2.32~2.21 (m, 2H), 2.21~2.12 (m, 1H), 1.83 (td, J = 12.0, 6.3 Hz, 1H), 1.25 (dd, J = 12.7, 5.6 Hz, 1H), 1.17 (s, 3H), 1.02 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 171.7, 162.0, 129.8, 100.5, 72.4, 71.2, 64.1, 63.2, 61.2, 59.1, 56.5, 54.7, 40.4, 30.3, 27.8, 23.3, 17.2, 16.6, 15.7, 15.5; HRMS (ESI) Calcd. for C20H25O8 [M+H]+ 393.154 9, found 393.155 2。

代谢物毒性和免疫抑制活性评价

细胞制备  BALB/c小鼠(雄性, 6~8周龄, 购自上海斯莱克实验动物有限公司)在无菌环境下被处死, 摘取脾脏, 去除细胞碎片和细胞团块, 制备成单个脾脏细胞悬液。红细胞用Tris-氯化铵缓冲溶液(0.155 mol·L-1 NH4Cl和16.5 mmol·L-1 Tris, pH 7.2)裂解。单核细胞清洗后, 用含有青霉素(100 u·L-1)和链霉素(100 μg·mL-1)的RPMI 1640培养基重悬。体外实验时, 将5只小鼠脾脏混合用于细胞制备。

MTT实验  细胞毒性实验采用MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide)法测定, 将脾细胞悬液(每孔1×104, 100 μL)与雷腾舒或者雷腾舒的衍生物(化合物1~7)的含10%胎牛血清的培养液(100 μL)一起培养48 h, 三样本平行。不加药的细胞作为对照组。之后吸除药液120 μL, 每孔加入新鲜配置的MTT溶液(20 μL, 5 mg·mL-1), 即终浓度为1 mg·mL-1, 37 ℃下培养4 h, 小心吸去上清, 每孔加入DMSO 150 μL, 震荡10 min, 之后于570 nm处读取OD值并计算细胞死亡率。

细胞分裂实验  脾淋巴细胞与5 mg·mL-1刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA)或10 mg·mL-1脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、雷腾舒或其衍生物(化合物1~7)于37 ℃共同培养48 h, 三样本平行。在培养结束前的8 h加入[3H]-thymidine 25 μL, 然后继续培养48 h, 最后收集细胞置于玻璃纤维过滤器中, 使用Beta闪烁计数器来测量放射性。

数据处理  代谢物鉴定的样品采用AB Sciex公司的Analyst® TF V1.6和Waters公司的Masslynx V4.1软件进行数据采集, 采用AB Sciex公司的PeakView® V1.2和MetabolitePilot V1.5软件进行数据分析。

代谢稳定性数据通过Analyst软件(1.6.2; AB Sciex, Foster City, CA, USA)采集, 结果利用Excel软件处理, 以平均值(双样本)表示。肝脏固有清除率(CLint)计算采用以下方法[12, 13]:以孵育体系中原形药物的ln (剩余率)对孵育时间作图, 进行线性回归得到斜率k, 按公式1求得药物的体外清除半衰期(t1/2, min)和CLint (mL·min-1·kg-1):

$ \begin{array}{l}{t_{1/2}} = - 0.693/k\\ {\rm{C}}{{\rm{L}}_{{\rm{int}}}} = \frac{{0.693}}{{{t_{1/2}}}} \times \frac{{{\rm{孵育体积}}\left( {{\rm{mL}}} \right)}}{{{\rm{微粒体}}\left( {{\rm{mg}}} \right)}} \times \frac{{{\rm{微粒体}}\left( {{\rm{mg}}} \right)}}{{{\rm{肝重}}\left( {\rm{g}} \right)}} \times \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\frac{{{\rm{肝重}}\left( {\rm{g}} \right)}}{{{\rm{体重}}\left( {{\rm{kg}}} \right)}} \end{array} $ (1)
结果 1 雷腾舒在5种属肝细胞中的代谢物

利用MetabolitePilot软件对雷腾舒的人、猴、犬、大鼠和小鼠肝细胞孵化样品数据进行处理, 获得相关的代谢物质谱图和紫外色谱图(图 1)。与失活肝细胞相比, 除原形药物外, 在人、猴、犬、大鼠和小鼠细胞孵化样品中共检测到3种相关离子, 分别为氧化开环代谢产物(M1)、谷胱甘肽结合代谢产物(M2)和单氧化并谷胱甘肽结合代谢产物(M3-1和M3-2), 见表 1。除猴肝细胞中检测到全部3种代谢产物外, 其他种属的肝细胞中均只检测到部分。

Table 1 The UPLC/Q-TOF-MS information of (5R)-5-hydroxytriptolide metabolites in the hepatocytes of human, monkey, dog, rat and mouse
2 雷腾舒在人和大鼠肝微粒体中的代谢物

随后将雷腾舒和人或大鼠肝微粒体共同孵育, 利用MetabolitePilot软件对雷腾舒的微粒体样品数据进行处理, 获得相关的代谢物谱图(图 2)。与阴性对照组相比, 除原形药物外, 人肝微粒体中鉴定得到4个代谢产物, 大鼠肝微粒体中鉴定得到7个代谢产物。其中人肝微粒体中的4种代谢物在大鼠肝微粒体中都有检测到, 说明不存在人肝微粒体特异性的代谢物(表 2), 分别命名为M4、M5-1~M5-6。

Table 2 The UPLC/Q-TOF-MS information of (5R)-5-hydroxytriptolide metabolites in human liver microsomes (HLM) and rat liver microsomes (RLM). *M5 is actually a mono-oxidation metabolite of (5R)-5-hydroxytriptolide which is assumed to be unstable in the ionization source
3 雷腾舒的UPLC/Q-TOF MS分析

对雷腾舒溶液进行UPLC/Q-TOF MS分析, 推测质谱裂解规律, 为其代谢产物结构推测奠定基础。在本研究选取的色谱条件下, 雷腾舒的色谱保留时间为9.35 min, 一级全扫描质谱图中(图 3A), 获得m/z 377.158 8的准分子离子[M+H]+。雷腾舒的结构中仅含有C、H、O三种原子, 产物离子扫描模式下(图 3B)未获得特征性碎片离子。

Figure 3 UPLC/Q-TOF-MS analysis of (5R)-5-hydroxytriptolide solution. A: MS spectrum of m/z (5R)-5-hydroxytriptolide; B: MS/MS spectrum of (5R)-5-hydroxytriptolide
4 代谢物鉴定 4.1 代谢物M1 ([M+H]+, m/z 395.171)

根据准确分子质量, 推测M1的分子式组成为C20H26O8, 与原形药物相比增加了18 Da, 这一变化有可能是因为雷腾舒12, 13-位环氧开环的代谢物。该代谢物经过比对, 与化合物1的色谱和质谱行为一致。

4.2 代谢物M2 ([M+H]+, m/z 684.244)

根据准确分子质量, 推测M2的分子式组成为C30H41N3O13S, 与原形药物相比增加了307 Da, 暗示M2为雷腾舒谷胱甘肽结合代谢物。经比对, M2与化合物2具有相同的色谱和质谱行为。

4.3 代谢物M3 ([M+H]+, m/z 700.239)

M3-1和M3-2的准确分子质量相同, 推测其分子式组成为C30H41N3O14S, 与原形药物相比增加了323 Da, 暗示M3为雷腾舒单氧化并谷胱甘肽结合代谢物, 代谢位点未知。

4.4 代谢物M4 ([M+H]+, m/z 375.144)

根据准确分子量, 推测其分子式组成为C20H22O7, 与原形药物相比减少了2 Da, 即原形药物脱去一分子H2, 脱氢位点未知。

4.5 代谢物M5 ([M+H]+, m/z 393.155)

M5-1~M5-6与原形药物相比均增加了16 Da。根据准确分子质量, 推测其分子式组成为C20H24O7, 暗示M5为雷腾舒单氧化代谢物。其中M5-5仅检测到母离子脱去一分子H2O后的碎片离子, 推测该单氧化代谢物可能不稳定, 极容易发生源内裂解, 丢失一分子H2O。经过与化合物3~7进行质谱和色谱行为的比对, 发现M5-1、M5-4和M5-5的色谱和质谱行为分别与化合物467相一致。

因此代谢物M5-1为原形药物(16S)-位单加氧代谢物, M5-4为原形药物(2R)-位的单加氧代谢物, M5-5为原形药物(19R)-位单加氧代谢物。图 4为推测的雷腾舒体外代谢途径。

Figure 4 Proposed metabolic profile of (5R)-5-hydroxytriptolide in vitro. hHe: Human hepatocytes; rmHe: Rhesus monkey hepatocytes
5 雷腾舒体外代谢稳定性

体外代谢稳定性实验结果发现, 雷腾舒在大鼠肝微粒体中的代谢速率要高于人肝微粒体。采用数据处理中描述的方法对得到的代谢稳定性数据进行处理, 计算得到的雷腾舒在大鼠肝微粒体中的清除半衰期为30.2 min, 经过转化后计算得到的雷腾舒的大鼠肝脏固有清除率为41.2 mL·kg-1·min-1。相同的方法计算得到的雷腾舒在人肝微粒体中的代谢半衰期为893 min, 人肝脏的固有清除率为0.973 mL·kg-1·min-1

6 代谢物免疫抑制活性评价

为了考察雷腾舒经过代谢之后的活性变化, 评价了以上获得的几种雷腾舒的衍生物对ConA诱导的T细胞增殖和LPS诱导的B细胞增殖的抑制作用。从表 3可以看出7个化合物中仅化合物6即M5-4展现出了弱的免疫抑制活性, 然而也不足原形药物活性的十分之一, 同时细胞毒性也较原形药物减小。

Table 3 Evaluation of cytotoxicity and immunosuppressive activity of (5R)-5-hydroxytriptolide and its derivatives. aCytotoxic concentration of the compound that reduces cell viability by 50%. bInhibitory concentration of the compound that reduces cell prolife-ration by 50%
讨论

本研究采用体外肝细胞和肝微粒体对雷腾舒的体外代谢途径和代谢稳定性进行研究。实验中采用5个种属的肝细胞分别与雷腾舒进行孵化, 5个种属的肝细胞中共检测到4个代谢物, 分别为12, 13-位环氧水解开环的代谢物M1、谷胱甘肽结合物M2以及单氧化并谷胱甘肽结合物M3-1和M3-2。

通常谷胱甘肽结合物的生成往往意味着反应性代谢产物的存在[14, 15]。从质谱峰面积判断, M2的响应在5个种属的肝细胞孵育体系中都是最高的, 然而从紫外色谱图中则仅能检测到原形药物的吸收峰。由于该类化合物的质谱响应受其结构影响较大[16], 因此紫外色谱峰面积更能准确反映代谢物之间量的多少。M2的质谱响应高, 是因为雷腾舒本身质谱响应差[17], 结合谷胱甘肽之后, 使其质谱响应显著提高。本实验中, 紫外色谱图中仅能检测原形药物的吸收峰, 说明相对于原形药物的量, M2的生成量几乎可以忽略不计。

随后作者将雷腾舒与人或大鼠的肝微粒体进行孵育, 共检测到7个代谢物, 分别为脱氢代谢物M4和单氧化代谢物M5-1~M5-6。从紫外色谱中可以看到, 人肝微粒体中, M5-2生成量最高, 其次为M5-6, 而大鼠肝微粒体中M5-6的生成量最高, 且大鼠肝微粒体中雷腾舒的代谢速率高于人肝微粒体。当固有清除率低于肝血流量的20%时被认为是低清除率化合物, 而大于肝血流量的80%时则被认为是高清除率化合物[18]。通过体外代谢速率计算预测了雷腾舒在大鼠(CLint = 41.2 mL·kg-1·min-1)和人(CLint = 0.973 mL·kg-1·min-1)肝脏中的固有清除率, 发现雷腾舒在大鼠体内可能是中等清除率化合物(11 mL·kg-1·min-1 < CLint < 44 mL·kg-1·min-1), 而在人体则可能是低清除率化合物(CLint < 4 mL·kg-1·min-1)[18]

为了确定各个代谢物的准确结构, 分别利用化学合成法和生物转化法获得了相关的对照品(化合物1~7), 并通过核磁共振和高分辨质谱确认其结构。本实验通过化学半合成法获得了5个可能的代谢物对照品(化合物1~5), 又通过大鼠肝原代细胞转化, 获得了2个代谢物对照品(化合物67)。由于雷腾舒缺乏特征性的二级碎片, 因此本实验中代谢物的比对主要以液相色谱保留时间和质谱检测到的准确分子质量作为判断标准, 最终确定了5个代谢物的准确结构(图 4)。

作为雷公藤甲素的结构类似物, 雷腾舒与雷公藤甲素的代谢特征有诸多相似之处。体外研究中, 雷公藤甲素在人和大鼠肝微粒体中共检测到4种单氧化代谢物, 大鼠肝微粒体中的代谢物种类可以完全覆盖人肝微粒体中的代谢物[19]。在大鼠体内, 雷公藤甲素的I相代谢物以单氧化、双氧化为主, 文献中已确证的单氧化位点包括(2R)-、15-、(16S)-和(16R)-等[20], 而雷腾舒的单氧化位点也包括(2R)-和(16S)-等, 以及二者均有12, 13-位环氧开环并结合谷胱甘肽的代谢物。文献中[20]和本实验中, 雷公藤甲素和雷腾舒都有未确认的代谢物, 因此二者可能还有更多相同的代谢位点。

为了评价雷腾舒经过代谢后活性和毒性的改变, 对比了雷腾舒和化合物1~7之间对淋巴细胞的毒性和免疫抑制活性的区别。化合物1~5和化合物7的CC50和IC50均大于10 μmol·L-1, 仅化合物6展现了微弱的细胞毒性和免疫抑制活性, CC50和IC50相比于原形药物均显著升高。因此, 雷腾舒可能是通过代谢失活和减毒, 这与雷公藤甲素体内、外的代谢特征类似。多篇文献证实, 雷公藤甲素无论在体内、体外均可以经过代谢减毒, 一些诱导代谢的化合物可以显著减弱雷公藤甲素的毒性[21, 22]

结论

雷腾舒在5种属肝细胞以及人和大鼠肝微粒体的代谢孵化体系中, 共检测到5种代谢物, 分别为环氧水解开环代谢产物(M1)、谷胱甘肽结合代谢产物(M2)、单氧化并谷胱甘肽结合代谢产物(M3-1和M3-2)、脱氢代谢产物(M4)和单氧化代谢产谢(M5-1~M5-6)。通过与获得的代谢物对照品进行比对, 确认了5个代谢物的结构, 分别是12, 13-位环氧开环代谢物M1, 12-位谷胱甘肽结合代谢物M2, (16S)-、(2R)-和(19R)-单羟基化的代谢产物M5-1、M5-4和M5-5。其中, 仅发现(2R)-位取代的代谢产物(M5-4)表现了弱的免疫抑制活性, 不足原形药物的十分之一, 毒性也显著下降。说明, 雷腾舒经过代谢后, 活性和毒性均显著下降。

致谢: 周佳岚老师和唐崇壮博士生在肝细胞和微粒体实验中给予帮助, 庞晓雁博士和王乐博士在大鼠原代肝细胞分离中给予指导和帮助。

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