远志是远志科植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)或卵叶远志 (Polygala sibirica L.)的干燥根, 具有安神益智, 交通心肾, 祛痰, 消肿的功效^[1]。远志的生品具有一定刺激性^[2], 所以临床上常用其炮制品。远志的炮制方法有10余种^[3], 其中甘草制品(制远志)使用最为广泛, 并被列入《中国药典》。远志的甘草制法最早出现在《雷公炮炙论》, 流传至今, 经甘草制后可增强协同补脾益气、安神益智的作用。

中药饮片的规格等级是衡量中药质量优劣的重要参考依据, 直接影响着中医临床疗效的安全^[4]。随着中药现代化进程的加快, 中药质量标准不断完善, 然而中药材及饮片规格等级标准的研究制定却相对缓慢。关于远志药材的商品等级早有报道^[5-7], 但是关于其饮片——制远志, 临床上常用的一味中药饮片, 其商品等级划分尚未见报道。这不仅影响了制远志的临床合理用药, 而且难以实现优质优价。

本课题组前期对国内多家饮片企业生产的制远志样品进行取样调研, 发现不同企业生产的制远志形状、大小、色泽、气味等外观差异较大, 价格差异也较大。多数企业的制远志只有一个等级, 少数企业划分为两个等级, 不同企业之间对于制远志饮片等级的划分缺乏统一的标准。此外, 制远志的外观和其中的有效成分含量之间的关系并不明确。因此, 建立制远志不同商品等级的分级方法及质量检测方法, 十分必要和迫切。本文将依据传统的外观性状将制远志划分不同等级, 根据中心直径将制远志进行分级, 并通过薄层鉴别、多指标性成分含量测定和指纹图谱等方法分析不同等级制远志和其所含化学成分种类和含量之间的关系, 为制定合理且适用于市场的制远志饮片等级标准提供指导和参考。

制远志饮片样品  34批样品购买于康美药业股份有限公司、安徽九洲方圆制药有限公司、北京三和药业有限公司、北京华邈药业有限公司、盛实百草药业有限公司、河北一仁药业有限公司等12个中药饮片企业。经购买时咨询及经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为远志科远志属植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)经甘草炮制后的干燥根皮。具体样品信息见表 1。

表1(Table 1)

Table 1 Sample information and content determination results of effective components in Glycyrrhiza Polygalae Radix slices. aDiameter is the average diameter of ten Glycyrrhiza Polygalae Radix slices in each batch. bChinese Pharmacopeia 2015 Edition No. Manufacturer Habitat Processing standard Collection date Grade Diametera (x±s)/mm Percentage of root bark/% Polygalaxan-thone Ⅲ/% 3, 6'-Disinapoylsucrose/% Tenuifolin/% S1 Beijing Sanhe Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2016.9.3 First 4.23 ± 0.30 98.6 0.18 0.56 3.34 S2 Beijing Sanhe Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2017.4.26 First 4.22 ± 0.48 96.9 0.26 0.47 3.57 S3 Anhui Jiuzhoufangyuan Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2016.4.21 First 4.34 ± 0.66 94.6 0.19 0.55 3.80 S4 Anhui Jiuzhoufangyuan Shaanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2017.3.8 First 4.41 ± 0.55 98.7 0.27 0.71 3.44 S5 Kangmei Shaanxi CHP 2015edb 2017.11.20 First 4.45 ± 0.36 97.8 0.15 0.39 3.93 S6 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.41 ± 0.40 96.5 0.14 0.40 3.93 S7 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.27 ± 0.42 98.4 0.15 0.40 3.91 S8 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.52 ± 0.62 97.2 0.14 0.40 3.93 S9 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.31 ± 0.57 97.9 0.15 0.39 3.86 S10 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.20 ± 0.36 98.5 0.14 0.42 3.76 S11 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.18 ± 0.43 96.9 0.14 0.41 3.59 S12 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.23 ± 0.61 97.3 0.15 0.42 3.69 S13 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.36 ± 0.58 95.9 0.14 0.43 4.40 S14 Kangmei Shaanxi CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.17 ± 0.46 97.6 0.14 0.42 3.83 S15 Kangmei Sichuan CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.26 ± 0.66 96.0 0.14 0.39 3.77 S16 Kangmei Sichuan CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.12 ± 0.47 96.1 0.14 0.39 3.38 S17 Kangmei Sichuan CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.35 ± 0.39 97.5 0.14 0.38 3.68 S18 Kangmei Sichuan CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.24 ± 0.54 97.1 0.14 0.39 3.82 S19 Kangmei Sichuan CHP 2015ed 2017.11.20 First 4.28 ± 0.62 96.6 0.13 0.38 3.88 S20 Shengshibaicao Shanxi CHP 2015ed 2016.6.17 First 4.55 ± 0.57 99.3 0.18 0.55 3.88 S21 Shengshibaicao Shanxi CHP 2015ed 2016.8.22 First 4.72 ± 0.46 97.5 0.17 0.57 3.87 S22 Shengshibaicao Shanxi CHP 2015ed 2017.9.2 First 3.75 ± 1.16 99.9 0.33 0.68 3.22 S23 Beijing Qijing Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2017.5.15 First 3.65 ± 0.62 96.8 0.38 0.68 3.79 S24 Beijing Sanhe Shanxi CHP 2015ed 2017.8.27 First 4.58 ± 0.62 98.9 0.34 0.66 3.22 S25 Beijing Sanhe Shanxi CHP 2015ed 2017.9.17 First 3.90 ± 0.52 96.0 0.43 0.61 3.62 S26 Zhenxingbaicao Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2016.1.1 Second 2.90 ± 0.26 86.9 0.26 0.49 3.84 S27 Shanghai Dedatang Shanxi CHP 2015ed 2017.6.15 Second 2.84 ± 0.32 88.2 0.37 0.64 3.74 S28 Anhui Jiuzhoufangyuan Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2016.4.21 Second 2.89 ± 0.19 89.6 0.53 0.74 4.05 S29 Anhui Jiuzhoufangyuan Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2016.4.21 Second 2.67 ± 0.22 97.7 0.49 0.75 3.90 S30 Anhui Jiuzhoufangyuan Shanxi Beijing TCM Pieces Processing Standards 2008ed 2016.4.21 Second 2.84 ± 0.30 94.7 0.50 0.75 3.96 S31 Beijing Huamiao Shanxi CHP 2015ed 2017.9.2 Second 2.61 ± 0.31 90.5 0.40 0.62 3.75 S32 Hebei Jincao Neimenggu CHP 2015ed 2017.4.8 Second 2.90 ± 0.24 88.3 0.20 0.50 3.58 S33 Guangzhou Huiqun Shanxi CHP 2015ed 2017.2.4 Second 2.50 ± 0.33 91.8 0.23 0.51 3.91 S34 Hebei Yiren Shanxi CHP 2015ed 2017.6.2 Second 2.86 ± 0.32 95.4 0.15 0.51 3.58

Table 1 Sample information and content determination results of effective components in Glycyrrhiza Polygalae Radix slices. aDiameter is the average diameter of ten Glycyrrhiza Polygalae Radix slices in each batch. bChinese Pharmacopeia 2015 Edition

实验仪器、药品、试剂  万分之一电子分析天平(BS 110S, 美国Sartorius); 十万分之一电子分析天平(BP 211D, 美国Sartorius); UV-1紫外分析仪; 默克薄层板; 高效液相色谱仪Agilent1100系列:四元泵、在线脱气机、柱温箱、二极管阵列检测器(美国Agilent科技有限公司); Agilent1100色谱工作站(美国Agilent科技有限公司)。

远志𠮿酮Ⅲ对照品(成都曼斯特生物科技有限公司, 批号MUST-18072301, HPLC纯度≥99.40%); 3, 6'-二芥子酰基蔗糖对照品(成都曼斯特生物科技有限公司, 批号MUST-18070608, HPLC纯度≥99.06%)、细叶远志皂苷对照品(成都曼思特生物科技有限公司, 批号MUST-18011110, HPLC纯度≥98.95%); sibiricose A5对照品(成都曼斯特生物科技有限公司, 批号MUST-18030704, HPLC纯度≥93.91%); sibiricose A6对照品(成都曼斯特生物科技有限公司, 批号MUST-18080513, HPLC纯度≥96.42%); tenuifoliside A对照品(成都德思特生物科技有限公司, 批号DST181018-063, HPLC纯度≥98%)。远志对照药材(购买于山西省运城市新绛县阳王镇北池村, 远志筒一等品, 生长年限2.5年, 家种)经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为远志科远志属植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根皮。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯; 正丁醇为分析纯。

制远志等级划分  测量制远志饮片的中心直径和抽心率, 参照远志药材的商品等级分类方法^[5], 根据其中心直径进行等级划分, 将中心直径≥3.0 mm的规定为一等品, 中心直径 < 3.0 mm的规定为二等品。

薄层鉴别  取制远志粉末1.0 g, 加70%乙醇5 mL, 超声处理15 min, 滤过, 作为供试品溶液。另取远志𠮿酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖对照品, 加甲醇制成每1 mL含远志𠮿酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖各0.5 mg的混合对照品溶液; 另取远志对照药材1 g, 加70%乙醇5 mL, 超声处理15 min, 滤过, 作为对照药材溶液。吸取上述3种溶液各1 μL, 分别点于同一硅胶G薄层板上, 以乙酸乙酯-乙酸-水(55:13:13)为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外灯(365 nm)下检视。

多指标含量测定  参照《中国药典》 (2015版)远志项下^[1]远志𠮿酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖和细叶远志皂苷的含量测定方法。

指纹图谱  参照本课题前期建立的远志药材指纹图谱分析方法^[8]进行指纹图谱测定, 并导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统(2.0版)”中进行分析。

多元统计分析  将指纹图谱数据导入SIMCA-P 14.1软件中进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。

测量了34批制远志的中心直径和抽心率, 划分等级后, 一等品有25批(S1~S25), 二等品有9批(S26~S34), 见表 1、图 1。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 First-grade (A) and second-grade (B) of Glycyrrhiza Polygalae Radix slices

对34批制远志进行薄层鉴别, 供试品色谱中, 在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点。代表性的薄层色谱图见图 2。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 TLC chromatogram of Glycyrrhiza Polygalae Radix slices. HB is a mixed references of 3, 6'-disinapoyl sucrose (A) and polygalaxanthone Ⅲ (B); DZ is reference crude drug of Polygalae Radix

对34批制远志进行远志𠮿酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖和细叶远志皂苷的含量测定, 结果见表 1。不同等级制远志有效成分含量平均值的对比图见图 3。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Content comparison of different grades of Glycyrrhiza Polygalae Radix slices. *P < 0.05, **P < 0.01 vs first-grade (first-grade, n = 25; second-grade, n = 9)

将34批制远志进行指纹图谱测定, 并导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统(2.0版)”, 通过多点校正对各样品中色谱峰进行匹配, 确定了共有峰27个, 生成的对照指纹图谱见图 4, 其中峰9为对照品3, 6'-二芥子酰基蔗糖色谱峰。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Reference HPLC fingerprint of Glycyrrhiza Polygalae Radix slices. Peak 3: Sibiricose A5; Peak 4: Sibiricose A6; Peak 9: 3, 6'-Disinapoyl sucrose; Peak 12: Tenuifoliside A; other peaks: Unknown

对不同等级的制远志指纹图谱数据进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。从PLS-DA得分图所示(图 5A), 制远志饮片的一等品样本和二等品样本明显聚落成两类。该模型R²X = 0.488, Q² = 0.775, 在交叉验证中(n = 20) R²-Q²的差值小于0.3, 表示所建立的PLS-DA模型具有良好的解释能力和对模型的预测能力, 并且没出现过拟合。随后建立有监督OPLS-DA模型进一步分析, 通过OPLS-DA得分图发现(图 5B), 制远志一等品和二等品化学成分具有显著差异, 分布在两个象限区间。该模型具有良好的解释程度和预测能力(R²X = 0.82, R²Y = 966, Q² = 0.818), 而且所建立的OPLS-DA模型稳定可靠(CV-ANOVA P = 6.22E-5), 没有出现过拟合。通过整合OPLS-DA S-plot和VIP-plot (图 5C), 进一步选择出制远志一等品和二等品中差异的色谱峰。参考对照品, 发现sibiricose A5、sibiricose A6、远志𠮿酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖和tenuifoliside A (保留时间分别为11.81、12.31、24.702、31.30和35.24 min)在制远志二等品中的含量高于一等品。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 PLS-DA and OPLS-DA results of different grades of Glycyrrhiza Polygalae Radix slices. A: PLS-DA score chart; B: OPLS-DA score chart; C: OPLS-DA S-plot and VIP-plot combined loading chart

本文收集了市面上12家企业34批制远志饮片, 通过其中心直径和抽心率将其划分为两个等级, 并采用建立的薄层色谱方法和2015年版《中国药典》中远志𠮿酮Ⅲ、3, 6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷的含量测定方法, 以及本课题组前期已经建立的制远志HPLC指纹图谱方法^[8]对34批样品进行了分析。

目前, 药材市场上流通的远志药材已被分为多个商品等级, 但关于远志炮制品的规格等级却未见报道。制远志作为《中国药典》收载的远志药材唯一的炮制品, 具有临床使用量大的特点, 却依旧缺少等级划分的标准。经过对收集到的34批制远志饮片的观察, 发现不同企业的制远志在外观上差别较大, 如长度、直径、颜色、质地、抽心率等, 本研究以制远志中心直径为划分等级的主要依据, 有以下两个原因:一是因为外观性状中长度、直径容易量化, 《七十六种药材商品规格标准》^[5]中关于远志药材商品等级划分的主要依据就是长度和直径。考虑到制远志在加工过程需要切段, 不同企业切段长度的要求不同, 不具备参考的价值, 所以本文主要以中心直径为依据。二是因为中心直径在一定程度上可以反映远志的生长年限, 生长的年份越长, 远志的根就越粗壮, 直径越大; 并且远志的生长年限对其初级代谢产物和次级代谢产物的含量会产生一定影响^[9], 可能会影响其药效。根据对收集样品的分析, 结合市场调研, 最终确定中心直径≥3.0 mm为一等品, < 3.0 mm为二等品。抽心率在一定程度上也可以反映制远志的质量, 经过测定发现, 一等品抽心率的范围是94.9%~99.9%, 平均抽心率为97.4%, 暂定其限度≥90%;二等品抽心率的范围是86.9%~97.7%, 平均抽心率为91.4%, 考虑到二等品的远志根已较细, 去心相对困难, 故暂定其限度为≥85%。

在远志药材的收集过程中发现有直径≥5 mm的样品, 但在炮制品的收集过程中却非常少见, 究其原因可能是成本因素, 因此本研究未对此进行单列等级研究。将来若有该类商品, 可作为特等品对待。

2015年版《中国药典》关于远志的薄层鉴别是采用两种色谱条件, 分别对远志𠮿酮Ⅲ和细叶远志皂苷进行鉴别^[1], 而且细叶远志皂苷需要先进行碱水解, 操作繁琐。本文建立了一种新的薄层鉴别方法, 可以同时鉴别远志中的糖酯、𠮿酮和皂苷三大类主要成分。本文以乙酸乙酯-甲醇-水系统替代了药典中毒性较大的氯仿-甲醇-水系统, 且具有更好的分离度, 斑点条带清晰。并且, 经过指纹图谱与薄层色谱分析, 以远志总皂苷提取物(本课题组自制^[10])为对照, 确认薄层色谱中下方的亮蓝色条带主要为皂苷类成分。远志皂苷类成分因为糖链上含有肉桂酰基类取代基, 稳定性较差, 且含糖数目多, 分离困难, 所以本课题前期建立了采用碱水解后, 以细叶远志皂苷为对照的远志皂苷类成分定性和定量方法, 并收录到2010版药典中。但该操作繁杂, 耗时耗力。本文建立的薄层色谱方法可以不用碱水解, 操作简便易行, 节约时间; 推荐采用远志对照药材为对照, 其所含化学成分信息丰富, 可实现对其所含各类成分的同时对照, 并且成本低廉。

中药饮片外观性状与内部化学成分之间有怎样的关联, 是亟待探索和研究的问题。本研究中, 3种有效成分含量测定的结果表明, 制远志一等品3种有效成分含量比二等品低, 经过t检验分析验证, 3种有效成分在一等品和二等品之间均存在显著性差异。作者前期在对远志药材不同等级样品的含量分析过程中也发现远志药材的三等品相对一、二等品细叶远志皂苷和远志𠮿酮Ⅲ的含量偏高。其他研究也有类似报道^[7]。这可能是因为中心直径较大的远志根中根皮所占的比例较少, 影响了植物中次级代谢产物的积累。指纹图谱的多元统计分析结果表明, 制远志一等品和二等品之间化学成分存在显著的区别, 一等品与二等品可以明显区分; 同一企业不同批次的样品聚落更紧密, 这可能与企业样品来源产地固定、炮制工艺一致有着密不可分的关系。

本研究采用薄层色谱、多指标含量测定和指纹图谱相结合的方法对制远志的质量进行了分析, 并对不同等级的商品药材进行了对比, 为制远志药材质量标准的完善和等级标准的制定提供了重要的参考信息。但由于本研究过程中仅收载了34批制远志样品, 覆盖度还不是很广, 并且很多批次的产品来自同一厂家, 代表性不强, 今后应该收集更多批次、更多厂家的样品, 从而积累更多的数据, 为制远志的等级划分及不同等级和有效成分含量的高低间的关联性提供更加全面的信息。此外, 制远志作为较复杂的中药体系, 仅使用HPLC-UV检测在某一波长下的几个成分的含量信息也存在一定的局限性, 未来可以采用更多的检测方法, 针对不同类型的化学成分进行全面分析。另外, 现有的药材等级划分主要依靠性状大小进行划分, 导致为追逐良好的药材外观而使用壮根灵、膨大剂的现象频有发生, 从而导致药材的外观与内在品质没有密切关联甚至相互矛盾。因此, 关于中药材等级的划分, 除了性状, 还应结合有效成分含量的高低进行衡量, 必要时还应结合生物或药理药效的评价方法对不同商品等级进行评价, 弥补仅靠性状及化学成分高低来评价的局限性。通过多种手段相结合, 才能制订出科学合理、符合临床应用及市场流通规范的中药材及其饮片的等级标准。