乳腺癌是全世界女性中最常见的恶性肿瘤[1, 2]。虽然多柔比星在一线化疗中有着重要的作用, 但化疗耐药仍然是乳腺癌治疗的主要障碍[3]。随着对化疗耐药机制的深入研究, 作为基因货物载体的肿瘤细胞来源的外泌体在细胞间耐药信息的转移逐渐引起研究人员的关注。外泌体是大多数细胞分泌的一种直径介于40~100 nm之间的小囊泡, 其中含有各种活性分子, 包括蛋白质、脂类、DNA、RNA[4, 5]。外泌体作为细胞间通讯的介质穿梭于肿瘤微环境中并被周围的癌细胞或基质细胞吸收, 并可通过释放内容物传递信息从而引起肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移及耐药[6, 7]。有研究表明, 肿瘤来源的或与肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤耐药的重要机制, 它可以通过传递RNA、蛋白质等分子赋予敏感细胞耐药性[8, 9]。本文探讨外泌体在乳腺癌细胞多柔比星耐药传递中的作用及初步分子机制, 旨在为乳腺癌多柔比星耐药的分子机制及治疗策略提供新的思路。
材料与方法 实验材料乳腺癌亲本细胞株(MCF-7)和多柔比星耐药细胞株(MCF-7/Dox)由郑州大学第一附属医院精准临床药学重点实验室保存。不完全1640培养基、胎牛血清(Biological Industries生物公司); 胰蛋白酶细胞消化液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司); 多柔比星(美国MedChemExpress公司); ABCB1抗体、Hoechst 33342 (美国Cell Signaling Technology公司); BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司索莱宝); CD63抗体(武汉三鹰生物技术有限公司); Flotillin-1抗体(美国Abcam公司); 荧光二抗(美国LI-COR公司); 一抗二抗稀释液(武汉博士德生物工程有限公司); DiI、PKH67荧光染料(美国Sigma-Aldrich公司); CCK-8试剂盒、YF®488-Annexin V和PI凋亡试剂盒(苏州宇恒生物科技有限公司)。
细胞培养与外泌体共培养MCF-7和MCF-7/Dox培养于RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 u·mL-1、链霉素100 μg·mL-1), 在37 ℃、饱和湿度及5% CO2的细胞培养箱内培养, 每2~3天传代1次。同时, 收集对数生长期含有外泌体的MCF-7/Dox细胞的培养上清液, 1 500 r·min-1离心5 min, 吸取上清, 加入10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素, 用于MCF-7细胞的共培养, 共培养的细胞标记为MCF-7/Exo。三种细胞同时培养, 用于后续实验。
乳腺癌细胞对多柔比星的药物敏感性检测将MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox 3种细胞悬液以每毫升3×104个的细胞浓度分别接种于96孔板, 每孔体积为100 μL, 培养过夜后换用含不同浓度多柔比星的培养基继续培养72 h, 然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液并将孔板放入培养箱内孵育2 h, 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。实验重复3次, 每组设6个复孔。此外, 将MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox细胞接种于6孔板, 培养过夜后换用含多柔比星0和0.625 μmol·L-1培养基继续培养72 h, 显微镜观察3种细胞株的形态及生长状态变化。
荧光显微镜检测细胞凋亡将MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox取对数期接种于24孔板内, 在培养箱里培养过夜后用浓度分别为0和0.625 μmol·L-1多柔比星处理24 h后用PBS洗涤细胞, 用蒸馏水按4:1的比例稀释5×Annexin V结合缓冲液, 每100 μL Annexin V结合缓冲液中加入10 μL YF®488-Annexin V, 24孔板中加入足量的染液以覆盖全部细胞, 冰上孵育30 min, 用1×结合缓冲液清洗细胞后加入足量的1×结合缓冲液覆盖细胞, 使用荧光显微镜观察3种细胞加药后早期凋亡情况。
细胞外泌体的提取将对数生长期的MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox细胞用无血清1640培养基培养24 h后, 收取等量的3种细胞的上清液, 经高速离心机300 ×g离心5 min、500 ×g离心5 min、3 000 ×g离心30 min、6 000 ×g离心60 min、10 000 ×g离心60 min, 取上清, 用超高速离心机100 000 ×g低温超速离心90 min, PBS洗涤沉淀, 再经100 000 ×g低温超速离心90 min, 收集沉淀重悬于50 μL PBS中, -80 ℃分装保存。
透射电镜观察外泌体形态与数量取10 μL外泌体滴加于载样铜网上, 室温静置1 min, 用滤纸从侧面吸干液体, 滴加2%磷钨酸溶液10 μL于铜网上, 室温负染1 min, 用滤纸吸干负染液, 白炽灯下烤10 min, 透射电镜下观察外泌体形态与数量。
BCA法外泌体蛋白定量收取等量的3组细胞的上清液并提取外泌体, 在提取的外泌体沉淀中, 加入50 μL裂解液, 用枪头吹打, 使裂解液与外泌体充分接触后将EP管放入提前预冷至4 ℃的离心机中, 13 000 r·min-1离心10 min, 取上清液于EP管中。取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各10 μL, 加入到做好标记的试管中。在每个试管中加入0.2 mL工作液, 充分混合。将混合液加入96孔板中, 37 ℃孵育30 min后用酶标仪测定562 nm的吸光值, 根据标准曲线计算出蛋白浓度, 用外泌体蛋白的量反映外泌体的量。
DiI荧光染料检测外泌体含量收取等量的3组细胞的上清液并提取外泌体, 将DiI加入到200 μL外泌体悬液中使终质量浓度为2 g·mL-1, 孵育30 min, 用1640完全培养基洗脱去除多余染料, 100 000 ×g超高速离心90 min, 用200 μL PBS重悬外泌体, 将DiI标记的外泌体分别加入24孔板中, 荧光显微镜下观察3种外泌体的含量。
Western blot检测外泌体特异分子CD63和Flotillin-1的表达收取等量的3组细胞的上清液并提取外泌体, 加入50 μL裂解液混匀后4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min, 取上清, 加入12.5 μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)后震荡、离心, 水浴锅煮沸10 min变性, 取25 μL蛋白样品电泳、转膜、洗涤封闭、孵育抗体(一抗CD63和Flotillin-1的稀释倍数分别为1:300、1:2 000, 荧光二抗的稀释倍数为1:5 000)。将硝酸纤维素膜置于双色红外激光扫描成像系统(Odyssey)检测蛋白条带, 并进行信号强度分析。
外泌体共摄取实验取2 μg MCF-7/Dox细胞来源的外泌体重悬于1 mL的Diluent C中, 将4 μL PKH67加入1 mL Diluent C中, 制备染料。将1 mL外泌体和1 mL染料悬液混合染色5 min, 加入2 mL纯血清终止染色, 洗涤着色外泌体1次。将种植在24孔板里的小圆片上的MCF-7更换含有PKH67着色外泌体的完全培养基。在细胞培养箱中共培养60 min后, PBS清洗2次, 多聚甲醛固定40 min后, PBS清洗2次, 将MCF-7用Hoechst染色10 min后, PBS清洗2次。滴加20 μL抗荧光衰减封片液于载玻片上封片。用激光共聚焦显微镜观察外泌体和MCF-7的相互作用情况。
Western blot检测细胞中多药耐药蛋白ABCB1的表达水平应用RIPA裂解液裂解MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox 3种细胞, 提取总蛋白, 应用BCA法经微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(110 V, 90 min)分离, 然后转移至硝酸纤维素膜, 用Blocking buffer常温下封闭1 h后, 加入兔抗人ABCB1一抗或鼠抗人Actin一抗4 ℃孵育过夜, 加入IRDye 680LT标记的山羊抗兔IgG和IRDye 800CW标记的山羊抗鼠IgG常温避光孵育2 h。将硝酸纤维素膜置于双色红外激光扫描成像系统(Odyssey)检测蛋白条带, 并进行信号强度分析。
统计学分析应用SPSS 21.0软件进行统计分析, 计量资料采用方差分析, 组间两两比较采用LSD法, 数据以x± s表示, 以P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果 1 多柔比星对不同细胞增殖活性的影响将不同浓度的多柔比星作用于3组细胞72 h后, 应用CCK-8检测细胞的增殖活性。结果显示, 敏感细胞株MCF-7对多柔比星的半数抑制浓度(IC50)为0.15 ± 0.05 μmol·L-1, MCF-7/Exo对多柔比星的IC50为0.83 ± 0.09 μmol·L-1, 耐药倍数升高5.5倍, 两组细胞对多柔比星的IC50有统计学差异(P < 0.01) (图 1A、B)。显微镜下观察发现, 0.625 μmol·L-1多柔比星作用于细胞72 h后, MCF-7细胞皱缩变圆, 明显脱落, 而MCF-7/Exo细胞的形态变化不大, 与MCF-7/Dox细胞相似(图 1C)。结果提示, 耐药细胞MCF-7/Dox的外泌体可以向敏感细胞MCF-7传递多柔比星耐药性。
多柔比星作用于不同细胞后, 应用YF®488-Annexin V染色检测早期凋亡细胞。荧光显微镜观察显示, 加入0.625 μmol·L-1多柔比星后, MCF-7细胞凋亡数明显增加(P < 0.001), 而与耐药细胞上清共培养的MCF-7/Exo细胞凋亡数无明显增加(P > 0.05) (图 2A、B)。
收集3种细胞的上清液, 提取外泌体, 透射电镜下观察, 外泌体呈双层脂质膜包裹的杯状结构, 直径为40~100 nm。与MCF-7细胞相比, MCF-7/Exo细胞的外泌体明显增多, 差异具有统计学意义(P < 0.05) (图 3A、B)。用BCA法测外泌体的蛋白含量, 并用蛋白含量反映外泌体的含量。实验结果显示, 与MCF-7细胞相比, MCF-7/Exo细胞的外泌体含量明显增多, 差异具有统计学意义(P < 0.001) (图 3C)。用DiI荧光染料标记3组细胞的外泌体, 荧光显微镜下观察, 发现MCF-7/Exo细胞的外泌体数量明显多于MCF-7细胞, 差异具有统计学意义(P < 0.001) (图 3D、E)。进一步通过Western blot检测外泌体特异性蛋白分子的表达, 结果显示MCF-7/Exo细胞的外泌体表达CD63、Flotillin-1, 与耐药细胞MCF-7/Dox表达水平相当, 而敏感细胞MCF-7的外泌体无或少有CD63和Flotillin-1表达(图 3F)。
为了验证耐药细胞来源的外泌体能否进入敏感细胞, 本研究应用PKH67标记耐药细胞MCF-7/Dox的外泌体, 与MCF-7细胞共培养60 min后, 用激光共聚焦显微镜观察, 发现耐药细胞MCF-7/Dox的外泌体可以被敏感细胞MCF-7摄取(图 4)。
为了初步探讨外泌体传递多柔比星耐药的分子机制, 本研究进一步应用Western blot技术检测了多柔比星作用前后3组细胞多药耐药蛋白ABCB1的表达水平。结果显示, MCF-7/Exo与MCF-7/Dox细胞均高表达ABCB1, 而敏感细胞MCF-7不表达ABCB1。0.625 μmol·L-1多柔比星作用后, 细胞内ABCB1的表达无明显变化(图 5)。
外泌体是细胞间物质和信息的交流载体[10]。它被认为是原发性肿瘤微环境内细胞-细胞间通讯的关键介质, 这些胞吐起源的小囊泡被释放到肿瘤微环境中将一些蛋白质和核酸转运到受体细胞从而改变受体细胞的表型, 如细胞增殖、迁移和耐药发生。在肿瘤细胞耐药信息传递方面, 耐药肿瘤细胞源性外泌体可以在细胞外环境中通过将其内容物(DNA、mRNA、miRNA、lncRNA和耐药蛋白质等)转运到敏感细胞, 从而增强或诱导耐药[11]。有研究表明, 与肺癌敏感细胞株相比, 顺铂耐药细胞株分泌的外泌体明显增多, 同时研究人员发现耐药细胞来源的外泌体降低了敏感细胞对顺铂的敏感性[12]。
外泌体对抗肿瘤药物耐药的影响已有较为广泛的报道, 说明外泌体在肿瘤耐药中的作用成为目前研究的热点。近年来已有多项研究表明, 外泌体可以通过传递miRNA、lncRNA、蛋白质使肿瘤细胞获得耐药性[13-16]。然而, 目前的主流研究方法是首先提取外泌体, 作用于受体细胞, 观察受体细胞药物敏感性的变化。但是, 人工提取外泌体费时费力, 且不能保证外泌体浓度、纯度、完整度等质量指标的均一性和一致性。更重要的是, 人为提取外泌体, 可能会破坏耐药肿瘤细胞的微环境, 无法真实反映细胞上清液中外泌体的功能。本研究直接将含有外泌体的耐药细胞上清液加入敏感细胞, 简便快捷, 没有人为干预和修饰, 更有利于外泌体发挥本能作用, 也保证了实验的可重复性。实验结果表明, 将含有外泌体的多柔比星耐药乳腺癌细胞的上清液加入敏感乳腺癌细胞, 受体细胞的多柔比星敏感性显著降低, 说明细胞上清液的外泌体可以传递耐药性。此外, 本研究发现多柔比星耐药乳腺癌细胞的外泌体多于敏感乳腺癌细胞, 并可以被敏感乳腺癌细胞直接摄取, 而摄取了耐药细胞外泌体的敏感细胞可以获得多药耐药蛋白ABCB1的表达。由此, 本研究结果证实, 多柔比星耐药乳腺癌细胞可以分泌大量的外泌体, 并通过外泌体可以向敏感细胞传递耐药性, 其机制可能与外泌体介导的ABCB1蛋白转运有关, 从而为乳腺癌多柔比星耐药机制的阐述和耐药的检测、预防或逆转提供了新的研究方向。
本研究结果只是揭示了乳腺癌耐药细胞可以大量分泌外泌体, 并通过外泌体向敏感细胞传递耐药性, 其初步机制与传递多药耐药蛋白ABCB1相关, 但具体的作用机制有待于进一步研究。课题组后续将以外泌体中的miRNA、lncRNA、circRNA为出发点, 深入研究外泌体介导肿瘤耐药传递的分子机制, 旨在为乳腺癌多柔比星耐药机制的阐述及治疗策略的发现提供新的思路。
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